医疗器械微生物检验ppt课件

1医疗器械微生物限度检验医疗器械微生物限度检验1医疗器械微生物限度检验2概述概述n n微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。微生物限度检查微生物限度检查细菌、真菌菌落数细菌、真菌菌落数控制菌控制菌2概述微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微3概述概述n n微生物：形体微小，结构简单，通常要用光学显微生物：形体微小，结构简单，通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物微镜和电子显微镜才能看清楚的生物n n特点：特点：1 1、个体微小，一般、个体微小，一般0.1mm0.1mm 2 2、构造简单，有单细胞的，简单多细胞、构造简单，有单细胞的，简单多细胞 的，非细胞的的，非细胞的 3 3、进化地位低、进化地位低n n分类：原核类：二菌，四体（分类：原核类：二菌，四体（细细菌、放菌、放线线菌、螺旋体、菌、螺旋体、支原体、立克次氏体、衣原体支原体、立克次氏体、衣原体）真核类：真菌，原生动物，显微藻类真核类：真菌，原生动物，显微藻类 非细胞类：病毒，亚病毒非细胞类：病毒，亚病毒3概述微生物：形体微小，结构简单，通常要用光学显微镜和电子显445概述概述n n医疗用品的分类医疗用品的分类n n按医疗用品与人体接触的性质以及对人体使用安全按医疗用品与人体接触的性质以及对人体使用安全性要求分三类：性要求分三类：a)a)类医疗用品：接触人体完整皮肤的医疗用品类医疗用品：接触人体完整皮肤的医疗用品 b)b)类医疗用品：接触人体未破损粘膜的医疗用品类医疗用品：接触人体未破损粘膜的医疗用品 c)c)类医疗用品：进入人体无菌组织、器官和血液类医疗用品：进入人体无菌组织、器官和血液 以及接触破损皮肤和粘膜的医疗以及接触破损皮肤和粘膜的医疗 用品用品 5概述医疗用品的分类6常用检测标准常用检测标准n n中华人民共和国药典中华人民共和国药典 2010 2010年版二部附录年版二部附录XI J“XI J“微生物限度检查法微生物限度检查法”n nGB 15979-2002 GB 15979-2002 一次性卫生用品卫生标准一次性卫生用品卫生标准附附录录B Bn nISO11737-1:2006 Sterilization of medical ISO11737-1:2006 Sterilization of medical devices Microbiological methodsPart1:devices Microbiological methodsPart1:Determination of a population of microorganisms Determination of a population of microorganisms on productson products6常用检测标准7项目项目药典药典20102010GB15979-2002GB15979-2002细菌细菌定量：营养琼脂培养基定量：营养琼脂培养基 2 2个平皿个平皿定量：营养琼脂培养基定量：营养琼脂培养基 5 5个平皿个平皿真菌真菌定量：玫瑰红钠琼脂培养基定量：玫瑰红钠琼脂培养基 至少至少2 2个平皿个平皿 72h72h 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基定量：沙氏琼脂培养基定量：沙氏琼脂培养基 5 5个平皿个平皿 7 7天天定性：沙氏液体培养基定性：沙氏液体培养基 7 7天天大肠大肠埃希菌埃希菌 胆盐乳糖培养基胆盐乳糖培养基 、MUGMUG培养基培养基 曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基 /大肠大肠菌群菌群胆盐乳糖发酵培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康胆盐乳糖发酵培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基凯琼脂培养基 、乳糖发酵培养基、乳糖发酵培养基乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、乳糖发酵培乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、乳糖发酵培养基养基沙门菌沙门菌 营养肉汤营养肉汤 、四硫酸钠亮绿培养基、四硫酸钠亮绿培养基 、胆盐硫乳琼脂（或、胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚蓝琼脂）培养基亚蓝琼脂）培养基 、三糖铁琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基 /铜绿假单铜绿假单胞菌胞菌胆盐乳糖胆盐乳糖 、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 、氧化酶、氧化酶试验试验 、绿脓菌素试验、绿脓菌素试验、SCDLPSCDLP培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基基 、氧化酶试验、氧化酶试验 、绿脓菌素试验、硝酸盐还原、绿脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、明胶液化试验产气试验、明胶液化试验4242生长试验生长试验金黄色金黄色葡萄球菌葡萄球菌 亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基 、卵黄氯、卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基 、血浆凝、血浆凝固酶试验固酶试验 SCDLPSCDLP培养基、血琼脂培养基、甘露醇发酵试培养基、血琼脂培养基、甘露醇发酵试验、血浆凝固酶试验验、血浆凝固酶试验梭菌梭菌 庖肉培养基、含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基庖肉培养基、含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基 、过、过氧化氢酶试验氧化氢酶试验 /溶血性链溶血性链球菌球菌/葡萄糖肉汤、血琼脂培养基、链球菌试验、杆葡萄糖肉汤、血琼脂培养基、链球菌试验、杆菌肽敏感试验菌肽敏感试验 白色念珠白色念珠菌菌沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、念沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、念珠菌显色培养基、珠菌显色培养基、1%1%聚山黎脂聚山黎脂80-80-玉米琼脂培养基、玉米琼脂培养基、芽管试验芽管试验/7项目药典2010GB15979-2002细菌定量：营养8实验条件实验条件n n无菌操作技术n n实验环境n n实验器材8实验条件无菌操作技术9无菌操作技术无菌操作技术n n微生物学基础n n微生物实践基础n n无菌操作意识9无菌操作技术微生物学基础10实验环境实验环境n n洁净度洁净度1000010000级下的局部洁净度级下的局部洁净度100100级的单向流空级的单向流空气区域或隔离系统；气区域或隔离系统；n n定期按定期按GB/T16292-16294GB/T16292-16294：20102010医药工业洁净医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证；的现行国家标准进行洁净度验证；n n实验中监控：实验时将制备好的营养琼脂平板打实验中监控：实验时将制备好的营养琼脂平板打开放于实验台上，至实验结束收起，开放于实验台上，至实验结束收起，30 30 35 35培养培养48h48h，菌落平均数应小于，菌落平均数应小于1cfu1cfu/90mm。10实验环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流11实验器具实验器具n n仪器仪器 超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸汽灭菌器、薄膜过滤装置、比浊仪等。汽灭菌器、薄膜过滤装置、比浊仪等。n n用具用具 试管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精试管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精密密PHPH试纸、滤膜、滤杯、剪刀、镊子、无菌服、试纸、滤膜、滤杯、剪刀、镊子、无菌服、牛皮纸等。牛皮纸等。11实验器具仪器12实验准备实验准备n n实验环境保证n n实验试液n n培养基n n灭菌方法12实验准备实验环境保证13实验环境保证实验环境保证n n环境清洁，表面消毒（75%(V/V)乙醇、新洁尔灭(1:1000)溶液或其他适宜消毒溶液）n n空气过滤系统，紫外灯或臭氧空气消毒仪13实验环境保证环境清洁，表面消毒（75%(V/V)乙醇、14实验试液实验试液n n稀释剂稀释剂稀释剂稀释剂 1.0.9%1.0.9%氯化钠溶液氯化钠溶液氯化钠溶液氯化钠溶液 2.pH6.82.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、无菌磷酸盐缓冲液、无菌磷酸盐缓冲液、无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6pH7.6无菌磷酸盐缓冲液无菌磷酸盐缓冲液无菌磷酸盐缓冲液无菌磷酸盐缓冲液 3.pH7.03.pH7.0氯化钠氯化钠氯化钠氯化钠-蛋白胨缓冲液：调解蛋白胨缓冲液：调解蛋白胨缓冲液：调解蛋白胨缓冲液：调解pHpH至近中性，其中蛋至近中性，其中蛋至近中性，其中蛋至近中性，其中蛋白胨对细菌细胞有保护作用有利于菌落数及控制菌测定。白胨对细菌细胞有保护作用有利于菌落数及控制菌测定。白胨对细菌细胞有保护作用有利于菌落数及控制菌测定。白胨对细菌细胞有保护作用有利于菌落数及控制菌测定。n n表面活性剂、中和剂或灭活剂表面活性剂、中和剂或灭活剂表面活性剂、中和剂或灭活剂表面活性剂、中和剂或灭活剂n n鉴定用试剂鉴定用试剂鉴定用试剂鉴定用试剂 1.1.靛基质试液靛基质试液 2.2.1%1%二盐酸二甲基对苯二胺试液（氧化酶试液）二盐酸二甲基对苯二胺试液（氧化酶试液）3.3.三氯甲烷三氯甲烷三氯甲烷三氯甲烷 4.1mol/l4.1mol/l盐酸试液盐酸试液盐酸试液盐酸试液 14实验试液稀释剂15培养基培养基n n标准菌株处理及增菌用培养基n n选择性培养基n n鉴别培养基15培养基标准菌株处理及增菌用培养基16培养基培养基n n培养基的酸碱度应符合细菌生长要求。应按各种培养基要求准确测定调节pH值。多数细菌生长的适宜pH值为7.27.6。酵母菌霉菌（6.06.5）。调节可用1N HCl或NaOH。n n培养基的灭菌时间和温度，应按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果及不损失培养基的必需营养成分。n n制成的培养基应透明，以便观察细菌生长性状以及其他代谢活动所产生的变化。16培养基培养基的酸碱度应符合细菌生长要求。应按各种培养基要17灭菌方式灭菌方式n n湿热：115 121，15min30min 物品切勿立即取出置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，以致染菌。n n干热：160 170 ，2h 适于耐高温的玻璃、陶瓷或金属器皿的灭菌。n n灭菌程序需要经过验证。17灭菌方式湿热：115 121，15min3018计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查n n细菌、霉菌及酵母菌计数用培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。18计数培养基适用性检查细菌、霉菌及酵母菌计数用培养基应进行19计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查n n菌种菌种n n大肠埃希菌大肠埃希菌 CMCCCMCC（B B）44 10244 102n n金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 CMCCCMCC（B B）26 00326 003n n枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 CMCCCMCC（B B）63 50163 501n n白色念珠菌白色念珠菌 CMCC(F)CMCC(F)98 00198 001n n黑曲霉黑曲霉 CMCC(F)98 003CMCC(F)98 003n n验证试验所用的菌株传代次数不得超过验证试验所用的菌株传代次数不得超过5 5代（从菌代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0 0代），并采代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。学特性。19计数培养基适用性检查菌种20计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查n n菌液制备菌液制备 取细菌新鲜培养物（一般取细菌新鲜培养物（一般18h24h18h24h，白念，白念24h48h 24h48h，黑曲霉，黑曲霉 5757天天 ），用），用0.9%0.9%无菌氯化无菌氯化钠溶液制成每钠溶液制成每1ml 1ml 含菌数含菌数50cfu100cfu50cfu100cfu的菌悬液的菌悬液 （黑曲霉用含（黑曲霉用含0.05%0.05%聚山梨酯聚山梨酯8080的的0.9%0.9%无菌氯化无菌氯化钠溶液）；钠溶液）；n n菌悬液在室温下放置应在菌悬液在室温下放置应在2 2小时内使用，若保存在小时内使用，若保存在2 2 8 8可以在可以在2424小时内使用。黑曲霉孢子悬液小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在可保存在2 2 8 8，在验证过的贮存期内使用。，在验证过的贮存期内使用。20计数培养基适用性检查菌液制备 21计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查n n培养基接种培养基接种 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌2 2个平皿个平皿营养琼脂培养基营养琼脂培养基 大肠埃希菌大肠埃希菌2 2个平皿个平皿 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌2 2个平皿个平皿 玫瑰红钠琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基 白色念珠菌白色念珠菌2 2个平皿个平皿 黑典霉黑典霉2 2个平皿个平皿酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基：白色念珠菌酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基：白色念珠菌2 2个平皿个平皿用相同的对照培养基替代被检培养基做对照用相同的对照培养基替代被检培养基做对照21计数培养基适用性检查培养基接种 22计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查n n结果判定 若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。22计数培养基适用性检查结果判定23样品准备样品准备n n供试品进入无菌实验室前应作表面消毒，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒。n n检验数量：应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。n n一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。23样品准备供试品进入无菌实验室前应作表面消毒，用适宜的消毒24样品准备样品准备n n检验量：除另有规定外，一般供试品的检验量为10 g或10ml；化学膜剂100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）。24样品准备25供试液制备供试液制备n n液体供试品、固体、半固体或黏稠液供试品液体供试品、固体、半固体或黏稠液供试品 取取10ml10ml或或10g10g用用pH7.0pH7.0无菌氯化钠无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至蛋白胨缓冲液稀释至100ml100ml，混匀，作为混匀，作为1 1：1010的供试液。油剂可加入适量的无菌吐温的供试液。油剂可加入适量的无菌吐温8080使供使供试品分散均匀试品分散均匀;水溶性液体亦可用混合供试品原液作为供试液；水溶性液体亦可用混合供试品原液作为供试液；n n非水溶性供试品非水溶性供试品 ：乳化或萃取：乳化或萃取;n n膜剂供试品膜剂供试品 ：取供试品：取供试品100cm100cm2 2，剪碎，加，剪碎，加pH7.0pH7.0无菌氯化钠无菌氯化钠-蛋蛋白胨缓冲液白胨缓冲液100ml100ml浸泡，振摇，作为浸泡，振摇，作为1 1：1010的供试液的供试液;n n肠溶及结肠溶制剂供试品：取供试品肠溶及结肠溶制剂供试品：取供试品10g 10g ，加，加pH6.8pH6.8无菌磷酸盐无菌磷酸盐缓冲液缓冲液(用于肠溶制剂用于肠溶制剂)PH7.6)PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至剂）至100ml100ml，置，置4545水浴中，振摇，使溶解，作为水浴中，振摇，使溶解，作为1 1：1010的供的供试液试液;n n气雾剂、喷雾剂供试品气雾剂、喷雾剂供试品 ，经处理后同第一项制备供试液，经处理后同第一项制备供试液;n n贴剂供试品贴剂供试品n n具抑菌活性的供试品具抑菌活性的供试品 ：培养基稀释法：培养基稀释法 、离心沉淀法、离心沉淀法 、薄膜过滤、薄膜过滤法法 、中和法、中和法;25供试液制备液体供试品、固体、半固体或黏稠液供试品 26细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数 n n实验方法n n倾注平皿法n n薄膜过滤法n n培养基n n细菌总数：营养琼脂培养基 n n霉菌及酵母菌计数：玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄琼脂培养基 26细菌、霉菌及酵母菌计数 实验方法27细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数n n培养和计数培养和计数n n除另有规定外，细菌培养除另有规定外，细菌培养3 3天，逐日点计菌落数天，逐日点计菌落数n n霉菌、酵母菌培养霉菌、酵母菌培养5 5天，逐日点计菌落数天，逐日点计菌落数n n必要时可延长至必要时可延长至7 7天进行菌落计数天进行菌落计数n n点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数数，按菌数报告规则报告菌数27细菌、霉菌及酵母菌计数培养和计数28细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数n n方法验证方法验证n n（1 1）试验组）试验组 平皿法：供试液平皿法：供试液1ml+1ml 1ml+1ml 试验菌菌悬液，平行制试验菌菌悬液，平行制备备2 2个平皿，菌落计数；个平皿，菌落计数；薄膜过滤法：供试液，过滤，冲洗，在最后一次薄膜过滤法：供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入的冲洗液中加入1ml1ml试验菌，过滤，菌落计数；试验菌，过滤，菌落计数；n n（2 2）菌液组）菌液组 测定所加的试验菌数；测定所加的试验菌数；n n（3 3）供试品对照组）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数；数方法测定供试品本底菌数；n n（4 4）稀释剂对照组）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。稀释剂物受影响的程度。稀释剂+试验菌菌悬液；试验菌菌悬液；28细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证29细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数n n验证试验至少应进行验证试验至少应进行3 3次独立的平行试验，并分别次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。计算各试验菌每次试验的回收率。n n结果判断结果判断 n n在在3 3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率应均不低于收率应均不低于70%70%；n n若试验组的菌数回收率均不低于若试验组的菌数回收率均不低于70%70%，可照该供，可照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；及酵母菌数；n n若任一次试验中试验组的菌数回收率低于若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和中和 法等方法或联合使用这些方法消除供试品的法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。抑菌活性，并重新进行方法验证。29细菌、霉菌及酵母菌计数验证试验至少应进行3次独立的平行试30细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数n n1.1.平皿法平皿法n n采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2323个稀释级的供试液。个稀释级的供试液。n n取供试液取供试液1ml1ml，置直径，置直径90mm90mm的无菌平皿中，注入的无菌平皿中，注入1520ml 1520ml 温度不超过温度不超过4545的溶化的营养琼脂培养的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄琼基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备种培养基至少制备2 2个平板。个平板。n n阴性对照试验阴性对照试验 取试验用的稀释液取试验用的稀释液1ml1ml，置无菌平，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数的培养基各制备的培养基各制备2 2个平板，均不得有菌生长。个平板，均不得有菌生长。30细菌、霉菌及酵母菌计数1.平皿法31细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数营养琼脂营养琼脂-细菌细菌 玫瑰红钠琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基-霉菌霉菌31细菌、霉菌及酵母菌计数营养琼脂-细菌 玫32细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数n n1.1.平皿法平皿法n n菌数报告规则：菌数报告规则：n n细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300300、霉菌、霉菌宜选取平均菌落数小于宜选取平均菌落数小于100100的稀释级，作为菌数的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据；报告（取两位有效数字）的依据；n n以最高平均菌落数乘以稀释倍数的值报告以最高平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g1g、1ml1ml或或10cm10cm2 2供试品中所含的菌数；供试品中所含的菌数；n n如果各稀释级的平板均无菌落生长，或仅是最低如果各稀释级的平板均无菌落生长，或仅是最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1 1时，时，以以11乘以最低稀释倍数的值报告菌数。乘以最低稀释倍数的值报告菌数。32细菌、霉菌及酵母菌计数1.平皿法33细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数n n2.2.薄膜过滤法薄膜过滤法n n取相当于每张滤膜含取相当于每张滤膜含1g1g或或1ml1ml供试品的供试液，供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g1g或或1ml 1ml 所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液供试液1ml 1ml，过滤。用，过滤。用pH7.0pH7.0无菌氯化钠无菌氯化钠-蛋白胨蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗后取缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板钠培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。n n阴性对照试验阴性对照试验 取试验用的稀释液取试验用的稀释液1ml1ml，照上述薄，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。菌生长。33细菌、霉菌及酵母菌计数2.薄膜过滤法34细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数n n2.薄膜过滤法n n菌数报告规则：以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌生长，以1报告菌数（每张滤膜过滤 1g或1ml供试品），或1乘以稀释倍数的值报告菌数。34细菌、霉菌及酵母菌计数2.薄膜过滤法35细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数n n在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数较高的培养基中的菌数为计进行比较，以菌落数较高的培养基中的菌数为计数结果。数结果。35细菌、霉菌及酵母菌计数在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长363637控制菌检查法验证控制菌检查法验证n n菌种（菌液制备同前）n n大肠埃希菌大肠埃希菌CMCCCMCC（B B）44 10244 102n n金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌CMCCCMCC（B B）26 00326 003n n乙型副伤寒沙门菌乙型副伤寒沙门菌CMCCCMCC（B B）50 09450 094n n铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌CMCCCMCC（B B）10 10410 104n n生孢梭菌生孢梭菌 CMCC(B)64 941CMCC(B)64 94137控制菌检查法验证菌种（菌液制备同前）38控制菌检查法验证控制菌检查法验证n n（1 1）试验组）试验组取规定量供试液及取规定量供试液及10cfu100cfu10cfu100cfu试验菌加入增菌培养基试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。n n（2 2）阴性菌对照组）阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌葡萄球菌，梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。不得检出。n n结果判断结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀法验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。行方法验证。38控制菌检查法验证（1）试验组 取规定量供试液及10c39大肠埃希菌检验大肠埃希菌检验n n 取供试液取供试液10ml10ml（相当于供试品（相当于供试品1g1g、1ml1ml、10cm10cm2 2），直接），直接或处理后接种至适量（不少于或处理后接种至适量（不少于100ml100ml）的胆盐乳糖培养基）的胆盐乳糖培养基中，培养中，培养18241824小时，必要时可延长至小时，必要时可延长至4848小时。小时。n n取上述培养物取上述培养物0.2ml0.2ml，接种至含，接种至含5ml MUG5ml MUG培养基的试管内，培养基的试管内，培养，于培养，于5 5小时、小时、2424小时在小时在366nm366nm紫外线下观察，同时用紫外线下观察，同时用未接种的未接种的MUGMUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为光，为MUGMUG阳性，不呈现荧光，为阳性，不呈现荧光，为MUGMUG阴性。观察后，阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为为MUGMUG阴性和靛基质阴性。阴性和靛基质阴性。39大肠埃希菌检验 取供试液10ml（相当于供试品1g、1m40大肠埃希菌检验大肠埃希菌检验MUG 靛基质试验40大肠埃希菌检验MUG 41大肠埃希菌检验大肠埃希菌检验n n如如MUGMUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUGMUG阴性，阴性，靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUGMUG阳性、靛基质阴性阳性、靛基质阴性，或，或MUGMUG阴性、靛基质阳性，均应取胆盐乳糖培养基的培养物划线于阴性、靛基质阳性，均应取胆盐乳糖培养基的培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18182424小小时。时。n n若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符，若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与下表所列的菌落。若平板上生长的菌落与下表所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。验，确认是否为大肠埃希菌。41大肠埃希菌检验如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠42大肠埃希菌检验大肠埃希菌检验n n大肠埃希菌菌落形态特征培养基培养基菌菌 落落 形形 态态曙红亚甲蓝琼脂曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色、呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色、菌落中心呈菌落中心呈 深紫色或无明显暗色中心、深紫色或无明显暗色中心、圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽湿润，常有金属光泽麦康凯琼脂麦康凯琼脂 鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润表面光滑，湿润42大肠埃希菌检验大肠埃希菌菌落形态特征 培养基菌 落 43大肠菌群检验大肠菌群检验n n取含适量（不少于取含适量（不少于10ml10ml）的胆盐乳糖发酵培养基管）的胆盐乳糖发酵培养基管3 3支，支，分别加入分别加入1 1：1010的供试液的供试液1ml1ml（含供试品（含供试品0.1g0.1g或或 0.1ml0.1ml）、）、1 1：100100的供试液的供试液1ml1ml（含供试品（含供试品0.01g0.01g或或 0.01ml 0.01ml ）、）、1 1：10001000的供试液的供试液1ml1ml（含供试品（含供试品0.001g0.001g或或 0.001ml0.001ml），另取），另取1 1支胆盐乳糖发酵培养基加入稀释液支胆盐乳糖发酵培养基加入稀释液1ml1ml作为阴性对照管。作为阴性对照管。培养培养18241824小时。小时。43大肠菌群检验取含适量（不少于10ml）的胆盐乳糖发酵培养44大肠菌群检验大肠菌群检验n n胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养红亚甲蓝培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18241824小时。小时。n n若平板上无菌落生长，或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符若平板上无菌落生长，或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长的菌落与下表所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢的菌落与下表所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。杆菌，应进行确证试验。44大肠菌群检验胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸45大肠菌群检验大肠菌群检验大肠菌群落形态特征培养基培养基菌菌 落落 形形 态态曙红亚甲蓝琼脂曙红亚甲蓝琼脂 呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润滑，湿润 麦康凯琼脂麦康凯琼脂 鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润起，边缘整齐，表面光滑，湿润45大肠菌群检验大肠菌群落形态特征 培养基菌 落 形 46大肠菌群检验大肠菌群检验n n确证试验从上述分离平板上挑选45个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养2448小时。若产酸产气，判该乳糖发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。n n根据大肠菌群的检出管数，按下表报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。46大肠菌群检验确证试验 从上述分离平板上挑选447可能的大肠菌群数表可能的大肠菌群数表47可能的大肠菌群数表48沙门菌检验沙门菌检验n n取供试品取供试品10g10g或或10ml10ml，直接或处理后接种至适量（不少于，直接或处理后接种至适量（不少于200ml200ml）的营养肉汤）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养18241824小时。小时。n n取上述培养物取上述培养物1ml1ml，接种于，接种于10ml10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18241824小时后，小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚蓝琼脂）培养基的平板上，培养脂（或曙红亚蓝琼脂）培养基的平板上，培养18241824小时（必要时延长至小时（必要时延长至40484048小时）。小时）。n n若平板上无菌生长，或生长的菌落不同于下表所列的特征，判供试品未检出若平板上无菌生长，或生长的菌落不同于下表所列的特征，判供试品未检出沙门菌。沙门菌。48沙门菌检验取供试品10g或10ml，直接或处理后接种至适49沙门菌检验沙门菌检验n n沙门菌菌落形态特征49沙门菌检验沙门菌菌落形态特征 50沙门菌检验沙门菌检验n n若平板上生长的菌落与上表所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选若平板上生长的菌落与上表所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选2323个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养养18241824小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适判供试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门菌。宜的生化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门菌。50沙门菌检验若平板上生长的菌落与上表所列的菌落形态特征相符51铜绿假单胞菌检验铜绿假单胞菌检验 n n取供试液取供试液10ml10ml（相当于供试品（相当于供试品1g1g、1ml1ml、10cm210cm2），直接），直接或处理后接种至适量（不少于或处理后接种至适量（不少于100ml100ml）的胆盐乳糖培养基）的胆盐乳糖培养基中，培养中，培养18241824小时。取上述培养物，划线接种于溴化十小时。取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养18241824小时。小时。n n铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板上的菌落与上述菌落形态特征检出铜绿假单胞菌。如平板上的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选相符或疑似，应挑选2323个菌落，分别接种于营养琼脂培养个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养基斜面上，培养18241824小时。取斜面培养物进行革兰染色、小时。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。镜检及氧化酶试验。51铜绿假单胞菌检验 取供试液10ml（相当于供试品1g、152铜绿假单胞菌检验铜绿假单胞菌检验n n氧化酶试验氧化酶试验取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配置的于滤纸片上，滴加新配置的1%1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在二盐酸二甲基对苯二胺试液，在3030秒秒内培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。内培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。n n若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。n n绿脓菌素试验绿脓菌素试验取斜面培养物接种于取斜面培养物接种于PDPPDP琼脂培养基斜面上，培养琼脂培养基斜面上，培养2424小时，加三氯甲烷小时，加三氯甲烷35ml35ml至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入1mol/l1mol/l盐酸试液约盐酸试液约1ml,1ml,振振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性。同时用未接种的否则为阴性。同时用未接种的PDPPDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照，琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。阴性对照试验应呈阴性。n n若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的生化试验，确认是试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的生化试验，确认是否为铜绿假单胞菌。否为铜绿假单胞菌。52铜绿假单胞菌检验氧化酶试验 取洁净滤纸片置于平皿内，53金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌检验n n取供试液取供试液10ml10ml（相当于供试品（相当于供试品1g1g、1ml1ml、10cm210cm2），直接），直接或处理后接种至适量（不少于或处理后接种至适量（不少于100ml100ml）亚碲酸钠（钾）肉）亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基中，培养汤（或营养肉汤）培养基中，培养18182424小时，必要时可小时，必要时可延至延至4848小时。取上述培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂小时。取上述培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24722472小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于下表所列小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于下表所列特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。n n若平板上生长的菌落与下表所列的菌落特征相符或疑似，若平板上生长的菌落与下表所列的菌落特征相符或疑似，应挑选应挑选2323个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养培养18241824小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养色，并接种于营养肉汤培养基中，培养18241824小时，作血小时，作血浆凝固酶试验。浆凝固酶试验。53金黄色葡萄球菌检验取供试液10ml（相当于供试品1g、154金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌菌落形态特征培养基培养基菌菌 落落 形形 态态甘露醇氯化钠琼脂甘露醇氯化钠琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环，菌落直径外围有黄色环，菌落直径0.71mm 0.71mm 卵黄氯化钠琼脂卵黄氯化钠琼脂 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径落直径12mm 12mm 54金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌菌落形态特征培养基菌 55金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌检验n n血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验取灭菌小试管取灭菌小试管3 3支，各加入血浆和支，各加入血浆和 无菌无菌水混合液（水混合液（1 1：1 1）0.5ml0.5ml，再分别加入可疑菌株的营养肉，再分别加入可疑菌株的营养肉汤培养物（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬汤培养物（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）液）0.5ml0.5ml、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物（或由营养、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）0.5ml0.5ml、营养肉、营养肉汤或汤或0.9%0.9%无菌氯化钠溶液无菌氯化钠溶液0.5ml0.5ml，即为试验管、阳性对照，即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将管和阴性对照管。将3 3管同时培养，管同时培养，3 3小时后开始观察直至小时后开始观察直至2424小时。阴性对照管的血浆应流动自如，阳性小时。阴性对照管的血浆应流动自如，阳性 对照管血对照管血浆应凝固，若试验管血浆凝固者为血浆凝固酶试验阳性，浆应凝固，若试验管血浆凝固者为血浆凝固酶试验阳性，否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时，否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时，应另制备血浆，重新试验。应另制备血浆，重新试验。55金黄色葡萄球菌检验血浆凝固酶试验 取灭菌小试管3支，56金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌检验n n若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶试若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。验阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。56金黄色葡萄球菌检验若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固57梭菌检验梭菌检验n n取供试液取供试液10ml 10ml（相当于供试品（相当于供试品1g1g，1ml1ml）2 2份，其中份，其中1 1份置份置8080保温保温1010分钟后迅速冷却。上述分钟后迅速冷却。上述2 2份供试液直接或处理后分别接份供试液直接或处理后分别接种至种至100ml100ml的的0.1%0.1%新鲜庖肉培养基中。各培养基管在厌氧条件新鲜庖肉培养基中。各培养基管在厌氧条件下培养下培养4848小时。再取上述培养物小时。再取上述培养物0.2ml0.2ml，涂抹接种于含庆大霉，涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，在厌氧条件下培养素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，在厌氧条件下培养48724872小小时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有菌落生长，应挑选菌落生长，应挑选2323个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。试验。n n过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验 取上述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加取上述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加3%3%过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。阳性，否则为阴性。n n若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢，若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢，过氧化氢酶阴性，判供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭过氧化氢酶阴性，判供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。菌。57梭菌检验取供试液10ml（相当于供试品1g，1ml）258白色念珠菌检验白色念珠菌检验n n取供试液取供试液10ml10ml（相当于供试品（相当于供试品1g1g、1ml1ml、10cm210cm2），直接或处），直接或处理后接种至适量（不少于理后接种至适量（不少于100ml100ml）的沙氏葡萄糖液体培养基中，）的沙氏葡萄糖液体培养基中，培养培养48487272小时，取上述培养物，划线接种于沙氏葡萄糖琼脂小时，取上述培养物，划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养培养基平板上，培养24482448小时。小时。n n菌落特征：乳白色，偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培菌落特征：乳白色，偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深，质地变硬或有皱褶。养时间稍久则菌落增大，颜色变深，质地变硬或有皱褶。n n若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于上述特征，判供试品若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于上述特征，判供试品未检出白色念珠菌。未检出白色念珠菌。n n若平板上生长的菌落与上述特征相符或疑似，应挑选若平板上生长的菌落与上述特征相符或疑似，应挑选2323个菌个菌落，分别接种念珠菌显色培养基平板上，培养落，分别接种念珠菌显色培养基平板上，培养24482448小时。若小时。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。菌。n n若有绿色或翠绿色的菌落生长，则挑取相符或疑似菌落接种于若有绿色或翠绿色的菌落生长，则挑取相符或疑似菌落接种于1%1%聚山黎脂聚山黎脂80-80-玉米琼脂培养基培养玉米琼脂培养基培养24482448小时，进行染色镜小时，进行染色镜检及芽管试验。检及芽管试验。n n若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜下未见厚膜孢子、假菌若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜下未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。58白色念珠菌检验取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml59结果判断结果判断n n供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。不再复试。n n供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以两次，以3 3次结果的平均值报告菌数。次结果的平均值报告菌数。n n眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时，须以两次复试结果均不眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时，须以两次复试结果均不得长菌，方可判供试品的霉菌和酵母菌数符合该品种项下得长菌，方可判供试品的霉菌和酵母菌数符合该品种项下的规定。的规定。n n若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。59结果判断供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为60谢谢大家！60知识回顾知识回顾Knowledge Knowledge ReviewReview知识回顾Knowledge Review