基因重组与转座ppt课件

基因重组基因重组宋成义 博士/副教授2024/5/81基因重组宋成义 博士/副教授2023/8/11主要内容主要内容基因重组基因重组同源重组同源重组位点特异性重组位点特异性重组转座重组转座重组拷贝选择拷贝选择2024/5/82主要内容基因重组2023/8/12第一节第一节 基因重组概述基因重组概述第二节第二节 同源重组第三节第三节 位点特异性重组第四节第四节 转座重组转座重组2024/5/83第一节 基因重组概述2023/8/13一、定义：一、定义：二、意义：、意义：第一节第一节 基因重组概述基因重组概述是指由于不同是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换、插入等的重新组合，形成新片段的交换、插入等的重新组合，形成新的的DNA分子的过程。分子的过程。重组是遗传学的灵魂，没有重组就没有生物的进重组是遗传学的灵魂，没有重组就没有生物的进化；没有重组也就没有现代的分子克隆技术。化；没有重组也就没有现代的分子克隆技术。基因变化、物种演变、进化的基础2024/5/84一、定义：第一节 基因重组概述是指由于不同DNA链的断裂和三、遗传重组的类型三、遗传重组的类型 2024/5/85三、遗传重组的类型 2023/8/15同源重组同源重组（Homologous recombination）涉及两条携带同样遗传位点的染色体间的涉及两条携带同样遗传位点的染色体间的DNADNA序列交换。序列交换。位点特异性重组位点特异性重组（Site-specific recombination）发生在两个特异序列之间。发生在两个特异序列之间。转座重组转座重组（Transposition）指的是转座子移到基因组的新位点。指的是转座子移到基因组的新位点。拷贝选择拷贝选择（Copy choice）是一种是一种RNARNA病毒使用的重组。病毒使用的重组。2024/5/86同源重组（Homologous recombination）第二节第二节 同源重组1.1.定义定义2.2.特性特性3.3.真核生物的同源重组真核生物的同源重组4.4.原核生物的同源重组原核生物的同源重组2024/5/87第二节 同源重组定义2023/8/171.同源重组定义：同源重组（Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。2024/5/881.同源重组定义：同源重组（Homologus Recomb2.同源重组特性：p同源性，同源性，无特异性无特异性的要求，重组就可以在此的要求，重组就可以在此序列中的任何一点发生。序列中的任何一点发生。p同源区同源区越长越有利越长越有利，同源区太短，越难发生，同源区太短，越难发生重组重组;只要同源序列足够长，那么即使只要同源序列足够长，那么即使相差仅相差仅1bp的不同的遗传标记，仍然可能发生重组的不同的遗传标记，仍然可能发生重组2024/5/892.同源重组特性：同源性，无特异性的要求，重组就可以在此序列n大肠杆菌重组大肠杆菌重组:至少要求有至少要求有2040bp2040bp是相同的是相同的n大肠杆菌基因组与大肠杆菌基因组与 噬菌体或质粒重噬菌体或质粒重组组:大于大于13bp13bpn枯草杆菌基因组与质粒重组枯草杆菌基因组与质粒重组:大于大于70 70 bpbpn哺乳动物重组哺乳动物重组:150bp:150bp以上以上2024/5/810大肠杆菌重组:至少要求有2040bp是相同的2023/8/p同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。p同源重组可以双向交换DNA分子，也可以单向转移DNA分子，后者又被称为基因转换（Gene Conversion)。2024/5/811同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、p原核生物的同源重组通常发生原核生物的同源重组通常发生在在DNADNA复制复制过程中，而真核生物的同源重组则常见过程中，而真核生物的同源重组则常见于于细胞周期的细胞周期的S S期之后期之后。p重组热点重组热点:一些序列发生重组的频率高于一些序列发生重组的频率高于其他序列其他序列p真核生物的真核生物的染色质状态染色质状态影响重组，如异影响重组，如异染色质及其附近区域很少发生重组。染色质及其附近区域很少发生重组。p在真核生物中，双链在真核生物中，双链DNADNA分子间基因重组分子间基因重组是完成减数分裂所必需的是完成减数分裂所必需的2024/5/812原核生物的同源重组通常发生在DNA复制过程中，而真核生物的同3.真核生物的真核生物的同源重组模型同源重组模型Holliday model，相互侵入（交换）模型Robin Holliday于于1964年提出了重组的杂和年提出了重组的杂和DNA模型，又称模型，又称Holliday模型。解释了交互重组现象：模型。解释了交互重组现象：对称的杂合双链对称的杂合双链Meselson-Radding model（单链侵入模型）Holliday模型中为对称的杂合双链，而实际情况模型中为对称的杂合双链，而实际情况有不均等分离现象，有不均等分离现象，1975年年Meselson-Radding 提提出模型解释这种不对称重组现象：出模型解释这种不对称重组现象：交互重组和基因转换交互重组和基因转换Double-strand breaks initiate recombination（双链断裂重组模型）2024/5/8133.真核生物的同源重组模型Holliday model，相互Holliday model2024/5/814Holliday model2023/8/1142024/5/8152023/8/115Meselson-Radding（单链侵入模型）Holliday模型中为对称的杂合双链，而实际情况有不模型中为对称的杂合双链，而实际情况有不均等分离现象，均等分离现象，1975年年Meselson-Radding 提出模型解提出模型解释这种不对称重组现象：释这种不对称重组现象：2024/5/816Meselson-Radding（单链侵入模型）Holli1.在两个DNA分子中的一个单链发生断裂2.游离出一个单链末端侵人到另一个DNA分子中。2.被切割的DNA留下的缺口由DNA聚合酶进行修复。3.在另一个DNA分子中被替代的链降解，而两个末端被连接。4.开始，一个异源双链将只在两个DNA分子中的一个形成，支链迁移将在另一个DNA分子上产生另一个异源双链。像在Holliday模型一样，异构化使两侧的DNA分子重组。通过这个模型，异源双链首先只在两个DNA分子中的一个形成。然后一旦Holliday连接体形成，支链迁移能在另一个DNA分子上产生异源双链。（单链侵入模型）2024/5/8171.在两个DNA分子中的一个单链发生断裂（单链侵入模型）20Double-strand breaks initiate recombination(双链断裂重组模型)虽然Holliday模型以及随后的Meselson和Radding所作的修改可以解释生物中发生的大多数同源重组事件，但仍有一些例外的重组现象，最典型的例子为基因转换(gene conversion)。基因转换首先在酵母及真菌中被发现，现已证实在许多生物中存在。一种等位基因形式转变为另一种等位基因形式，只发生在减数分裂时期。2024/5/818Double-strand breaks initiate 异常分离与基因转变异常分离与基因转变 在一个杂合体中，如果一染色体把基因A交给它的同源染色体，则它的同源染色体必定把基因a交回给它，所以在真菌中，一个座位上的两等位基因分离时，应该呈现2：2或1：1：1：1或1：2：1的分离(表8-1)，这就说明重组通常总是交互的。可是Lindegren在面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）中发现，有的子囊含有（3A+1a）或（1A3a）的子囊孢子。以后在脉孢霉、酿酒酵母、子囊菌Ascobolus immersus及果蝇中也发现这种现象。2024/5/819异常分离与基因转变 在一个杂合体中，如果一2024/5/8202023/8/120同源重组机制的应用:基因敲除小鼠2024/5/821同源重组机制的应用:基因敲除小鼠2023/8/1214.4.原核生物的同源重组原核生物的同源重组细菌同源重组的特点细菌同源重组的特点 细菌的细菌的接合、转化接合、转化以及以及转导转导重组都是同源重重组都是同源重组，而且这种重组是发生在一个完整的环状组，而且这种重组是发生在一个完整的环状双螺旋双螺旋DNA分子与一个双链或单链分子与一个双链或单链DNA分子分子片段之间的。且重组需要片段之间的。且重组需要3种基因所编码的种基因所编码的RecA和和RecBCD蛋白质。蛋白质。2024/5/8224.原核生物的同源重组细菌同源重组的特点2023/8/122A、转化（、转化（transformation）概念：概念：受体菌直接摄取供体菌裂解后受体菌直接摄取供体菌裂解后游离的游离的DNA片段而获得新性状。片段而获得新性状。转化因子：转化因子：在转化过程中转化的在转化过程中转化的DNA片片段。分子量段。分子量1107,10-20个基因。个基因。2024/5/823A、转化（transformation）概念：受体菌直接摄机制：感受态受体菌摄取同源机制：感受态受体菌摄取同源DNA后发生重组后发生重组+吸附吸附摄入入重重组突突变株株DNA受体受体2024/5/824机制：感受态受体菌摄取同源DNA后发生重组+吸附摄入重组B、接合（、接合（conjugation）概念：通过性菌毛连接沟通，将遗传物质（质概念：通过性菌毛连接沟通，将遗传物质（质粒或染色体粒或染色体DNA)从供体菌转移给受体菌的过程。从供体菌转移给受体菌的过程。接合性质粒：接合性质粒：F质粒、质粒、R质粒、质粒、Col质粒、质粒、Vi质粒质粒 非接合性质粒非接合性质粒(不要求不要求)：机制机制2024/5/825B、接合（conjugation）概念：通过性菌毛连接沟通电镜下的接合电镜下的接合F菌菌F 菌菌2024/5/826电镜下的接合F菌F 菌2023/8/126F质粒的接合质粒的接合 F-菌菌F+菌菌F-菌菌F+菌菌F-菌菌F+菌菌F+菌菌F+菌菌性菌毛末端性菌毛末端-受体接合桥形成受体接合桥形成F F质粒形成切口，一条质粒形成切口，一条DNADNA链进入受体菌内链进入受体菌内F F质粒留在供体细胞的一质粒留在供体细胞的一条链进行复制并形成互条链进行复制并形成互补链补链2024/5/827F质粒的接合 FFFF-vF质粒的接合粒的接合2024/5/828FFFF-F质粒的接合2023/8/128C、转导（、转导（Transduction）1 1）概念：以温和噬菌体为载体，将供菌体的一）概念：以温和噬菌体为载体，将供菌体的一段段DNADNA转移到受体菌体内，使受体菌获得新转移到受体菌体内，使受体菌获得新的性的性状。状。2）类型型局限性转导局限性转导/特异性转导特异性转导普通性转导普通性转导2024/5/829C、转导（Transduction）1）概念：以温普遍性转导普遍性转导(generalized transduction):噬菌体转导供体菌染色体上全部噬菌体转导供体菌染色体上全部DNA片段，片段，发生于裂解期。发生于裂解期。完全转导：供体菌完全转导：供体菌DNA片段与受体菌染色片段与受体菌染色 体整合并随之传代。体整合并随之传代。流产转导：供体菌流产转导：供体菌DNA片段不与受体菌染片段不与受体菌染 色体整合也不可自我复制。色体整合也不可自我复制。（大多为此）（大多为此）2024/5/830普遍性转导(generalized transductio细菌裂解期菌裂解期细菌菌DNA（将供菌任意（将供菌任意DNA装配）装配）噬菌体噬菌体DNA普遍性普遍性转导模式模式图整合整合未整合未整合完全完全转导流流产转导细菌被普遍性菌被普遍性转导噬菌体感噬菌体感染染2024/5/831细菌裂解期细菌DNA（将供菌任意DNA装配）噬菌体DNA普遍局限性转导局限性转导(restrictedtransduction)32 前噬菌体从宿主菌染色体上脱离时发生偏差，将前噬菌体从宿主菌染色体上脱离时发生偏差，将前噬菌体两侧的宿主染色体基因转移到受体菌，前噬菌体两侧的宿主染色体基因转移到受体菌，使受体菌的遗传性状发生改变的过程使受体菌的遗传性状发生改变的过程噬菌体转导供体菌染色体上特定部位的噬菌体转导供体菌染色体上特定部位的DNA片段片段,发生于溶原期发生于溶原期噬菌体将自身一段噬菌体将自身一段DNA留在供菌染色体上，留在供菌染色体上，却却将相邻供菌的部分将相邻供菌的部分DNA带给受菌并整合至受体菌带给受菌并整合至受体菌染色体上染色体上2024/5/832局限性转导(restrictedtransduction)33 局限性局限性转导模式模式图正常脱离正常脱离断裂和断裂和 再接再接断裂和断裂和 再接再接偏差脱离偏差脱离galgalgalgalbiobiobiobio2024/5/83333 局限性转导模式图正常脱离断裂和 再接断裂和 再RecA和和RecBCD系统重组机制系统重组机制1.1.Rec BCDRec BCD蛋白在蛋白在chichi位点位点33侧的一条链侧的一条链上产生切口。上产生切口。2.2.Rec BCDRec BCD蛋白同时具有解螺旋酶的活蛋白同时具有解螺旋酶的活性，使性，使chichi位点附件切口的位点附件切口的DNADNA解链解链3.3.单链区被单链区被Rec ARec A蛋白和蛋白和SSBSSB蛋白覆盖蛋白覆盖4.4.RecA RecA 蛋白使单链蛋白使单链DNADNA取代双链取代双链DNADNA中的同源部分中的同源部分 5.5.D Dlooploop区域的区域的DNADNA产生切口，新切产生切口，新切口的口的33端（端（the tail of newly nicked the tail of newly nicked DNA DNA）与另一条）与另一条DNADNA的单链区互补的单链区互补配对配对6.6.DNADNA连接酶封闭切口，形成连接酶封闭切口，形成Holliday Holliday junctionjunction7.7.RuvA RuvA 和和RuvBRuvB发动迁移反应发动迁移反应8.8.RuvCRuvC拆分重组中间体拆分重组中间体2024/5/834RecA和RecBCD系统重组机制Rec BCD蛋白在chi第三节第三节 位点特异性重组定义：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间的重组。如噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组。2024/5/835第三节 位点特异性重组定义：发生在专一序列而顺序极少相同的特性这类重组依赖于小范围同源序列的联会，重组重组事件只涉及事件只涉及特定位置的短同源区特定位置的短同源区或是或是特定的碱特定的碱基序列之间基序列之间，重组的蛋白不是rec 系统而是int 等，如噬菌体l 的定点插入。重组时发生精确的切割、连接反应，DNA不失去、不合成。两个DNA分子并不进行对等的交换，有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子上，因此将这种形式的重组又称为插入重组。2024/5/836特性2023/8/136例、噬菌体的对例、噬菌体的对E.coliE.coli的的整合整合：POP+BOB BOPPOB 需要整合酶(Int拓扑异构酶活性)和整合宿主因子(IHF)参与,非可逆反应。2024/5/837例、噬菌体的对E.coli的整合：2023/8/137 通过通过attP和和attB间的相互重组，环状的噬菌体间的相互重组，环状的噬菌体DNA转换为整合的原噬转换为整合的原噬菌体，原噬菌体通过菌体，原噬菌体通过attL和和attR间的相互重组而切除间的相互重组而切除A.具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与attP和attB位点结合；B.Int的拓扑异构酶活性，使两条双链各自断开一条单链，瞬间旋转然后交换连接，形成Holliday中间提，C.在另两条单链之间发生同样的断裂重接，从而完成双链间的重组。2024/5/838 通过attP和attB间的相互重组，环状的噬菌体DNA转换2024/5/8392023/8/139三类位点特异性重组系统的重组酶Cre、FLP和R均属于整合酶家族Cre/loxP 系统FLP/FRT 系统R/RS 系统/Sce系统等位点特异性重组系统2024/5/840三类位点特异性重组系统的重组酶Cre、FLP和R均属于整合GATEWAY Cloning 2024/5/841GATEWAY Cloning 2023/8/1412024/5/8422023/8/1422024/5/8432023/8/143Cre and loxP mouse strainsCre expressing strains:contain a transgene that expresses cre under the control of a widespread(general)or tissue-specific(conditional)promoter.They are used to produce general or conditional knockouts respectively.Inducible Cre strains:contain a transgene that expresses a modified form of Cre recombinase that is non-functional until an inducing agent(such as doxycycline,tetracycline,RU486,or tamoxifen)is administered at a desired time point in embryonic development or adult life LoxP-flanked(floxed)strains:contain loxP sites flanking(on each side of)a critical portion of a target gene or genomic region of interest Cre repoter strains:contain loxP sites in combination with visible(fluorescent or lacZ)marker proteins used to trace Cre recombination sucess and/or alterations in gene expression.2024/5/844Cre and loxP mouse strainsCre 第四节第四节 转座重组转座重组1.定义：定义：转座子转座子(元元)或转座元件或转座元件(transposon/transposable element)即能够反复插入到基因中许多位点的特即能够反复插入到基因中许多位点的特殊殊DNA片段，它们可从一个位点转移到片段，它们可从一个位点转移到另一个位点，从一个复制子到另一个复另一个位点，从一个复制子到另一个复制子。（在转移时原来位置上的这些结制子。（在转移时原来位置上的这些结构依然存在或不存在）。构依然存在或不存在）。2024/5/845第四节 转座重组定义：转座子(元)或转座元件2023/8 2.转座重组特点：转座重组特点：不必借助同源序列就可移动的不必借助同源序列就可移动的DNA片段，片段，即转座作用与供体和受体之间的序列无关。即转座作用与供体和受体之间的序列无关。原核生物和真核生物均有转座子。原核生物和真核生物均有转座子。转座序列可沿染色体移动，甚至在不同染转座序列可沿染色体移动，甚至在不同染色体间跳跃。色体间跳跃。2024/5/846 2.转座重组特点：2023/8/1463.种类与结构特征种类与结构特征（1 1）两种类型：两种类型：两种类型：两种类型：A A 简单转座子（简单转座子（简单转座子（简单转座子（simple transposonsimple transposon）或（插入序列或（插入序列或（插入序列或（插入序列 insertion sequence IS insertion sequence IS）B B 复合转座子（复合转座子（复合转座子（复合转座子（composite transposoncomposite transposon）（2 2）特征：特征：特征：特征：a a）两端有）两端有）两端有）两端有202040bp40bp的反向重复序列的反向重复序列的反向重复序列的反向重复序列(IR)(IR)b b）具有编码转座酶（）具有编码转座酶（）具有编码转座酶（）具有编码转座酶（transposasetransposase）的基因）的基因）的基因）的基因 c c）复合转座子除转座酶基因外还有）复合转座子除转座酶基因外还有）复合转座子除转座酶基因外还有）复合转座子除转座酶基因外还有11数个基因。数个基因。数个基因。数个基因。d d）转座酶催化转座子插入新位点。）转座酶催化转座子插入新位点。）转座酶催化转座子插入新位点。）转座酶催化转座子插入新位点。2024/5/8473.种类与结构特征（1）两种类型：（2）A 插入序列插入序列 最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分，是一个自主的单位，每种正常组分，是一个自主的单位，每种IS均编码自身均编码自身转座所需的蛋白质。转座所需的蛋白质。特点（特点（1）比较小，）比较小，0.751.5kb;（2）只有转座酶）只有转座酶基因；（基因；（3）两端有反向重复序列）两端有反向重复序列 命名：命名：IS编号（鉴定类型）编号（鉴定类型）长度长度 7002000bpIR（inverted repeat）ISTransposaseIR2024/5/848A 插入序列 最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌每种每种IS元件具有不同序列，但有共同的组织形式元件具有不同序列，但有共同的组织形式插入序列插入序列插入序列插入序列IS1IS1的结构的结构的结构的结构2024/5/849每种IS元件具有不同序列，但有共同的组织形式插入序列IS1的2024/5/8502023/8/1502024/5/8512023/8/151B 复合转座子复合转座子（composite transposons，Tn）特点：特点：（1）2-25kb;（2）两端有两个相同或高度同源）两端有两个相同或高度同源IS序列序列（3）含转座酶基因）含转座酶基因/抗生素基因等抗生素基因等反向重复序列反向重复序列 组成组成 转座酶基因转座酶基因特殊基因：如抗性基因、调节基因等特殊基因：如抗性基因、调节基因等表示法：通常以表示法：通常以Tn和后面加上数码表示，如和后面加上数码表示，如Tn903。调节基因2024/5/852B 复合转座子（composite transposonTn/TnA family l 具有具有IR、转座酶基因、调节基因（解离酶）、抗生素基因、转座酶基因、调节基因（解离酶）、抗生素基因 Tn3 IR TnpA TnpR AmpR IR 38bp 38bp 转座酶转座酶 regulator -内酰胺酶内酰胺酶 2024/5/853Tn/TnA family l 具有IR、转座酶基因、2024/5/8542023/8/1541）转座的模式）转座的模式4.4.转座子的转作机制与模式转座子的转作机制与模式复制型转座复制型转座非复制型转座非复制型转座非复制型转座非复制型转座保守型复制保守型复制2024/5/8551）转座的模式4.转座子的转作机制与模式复制型转座20232）复制型转座模式（）复制型转座模式（replicative transposition）转座子作为可移动的元件被复制，一个拷贝保留在供转座子作为可移动的元件被复制，一个拷贝保留在供转座子作为可移动的元件被复制，一个拷贝保留在供转座子作为可移动的元件被复制，一个拷贝保留在供体原来的部位不变；另一个拷贝则插入到受体的位点上，体原来的部位不变；另一个拷贝则插入到受体的位点上，体原来的部位不变；另一个拷贝则插入到受体的位点上，体原来的部位不变；另一个拷贝则插入到受体的位点上，结果供体和受体都有一个转座子的拷贝。结果供体和受体都有一个转座子的拷贝。结果供体和受体都有一个转座子的拷贝。结果供体和受体都有一个转座子的拷贝。需两种酶：需两种酶：需两种酶：需两种酶：转座酶转座酶转座酶转座酶(transposase)(transposase)：作用于靶位点和原来转座子两端。：作用于靶位点和原来转座子两端。：作用于靶位点和原来转座子两端。：作用于靶位点和原来转座子两端。解离酶解离酶解离酶解离酶(resolvase)(resolvase)：作用于复制后的拷贝。：作用于复制后的拷贝。：作用于复制后的拷贝。：作用于复制后的拷贝。2024/5/8562）复制型转座模式（replicative transpos2024/5/8572023/8/157过程过程 a)a)共合体形成共合体形成共合体形成共合体形成 切口连接复制切口连接复制切口连接复制切口连接复制2024/5/858过程 a)共合体形成2023/8/158 b)拆分拆分 靶位点的靶位点的DR形成形成2024/5/859 b)拆分 靶位点的DR形成2023/8/1593 3）非复制型转座（非复制型转座（非复制型转座（非复制型转座（nonreplicative transposition)nonreplicative transposition)转座子从供体一个位点转移到受体新位点处，供体转座子从供体一个位点转移到受体新位点处，供体转座子从供体一个位点转移到受体新位点处，供体转座子从供体一个位点转移到受体新位点处，供体位点留下缺口，受到损伤（严重时致死）或宿主修复系位点留下缺口，受到损伤（严重时致死）或宿主修复系位点留下缺口，受到损伤（严重时致死）或宿主修复系位点留下缺口，受到损伤（严重时致死）或宿主修复系统识别修复。只需转座酶统识别修复。只需转座酶统识别修复。只需转座酶统识别修复。只需转座酶2024/5/8603）非复制型转座（nonreplicative trans4）保守型复制（保守型复制（conservative transpositionJ)保守转座的转座因子保守转座的转座因子从供体位点上切离，从供体位点上切离，插入到靶位点上，供插入到靶位点上，供体位点恢复原状。这体位点恢复原状。这种因子的转座酶和种因子的转座酶和 整合酶家族相关。整合酶家族相关。注意：某些转座子只具注意：某些转座子只具有一种转座机制，而另有一种转座机制，而另一些可能具备两种途经一些可能具备两种途经,如如IS1IS1和和IS903IS9032024/5/8614）保守型复制（conservative transpos2024/5/8622023/8/1625）TnA家族转座需要转座酶和解离酶TnpA介导转座分为两步,分别由tnpA编码的转座酶转座酶,tnpR编码的解离酶解离酶（resolvase）来完成。转座酶可以结合在末端38bp IR中的25bp的序列上。转座酶识别末端重复序列，并可交错5bp切割靶DNA，使转座子插入。解离位点（res）是内部的特殊位点，只有TnA家族才具有这一位点。Res位点中包含3个 tnpR结合序列（I,II,III），每个序列长3040bp。三个序列同时和tnpR解离酶结合，使DNA保持一个适当的拓扑结构。2024/5/8635）TnA家族转座需要转座酶和解离酶2023/8/163a)不依赖不依赖供体序列供体序列与靶位点间序列的同源性与靶位点间序列的同源性b)转座不是简单的转移，涉及转座子的复制转座不是简单的转移，涉及转座子的复制Hotspots(热点热点)Regional preference(在在3kb区域内的随机插入区域内的随机插入)d)某些转座因子（某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性）对同类转座因子的插入具有排他性 （免疫性）（免疫性）e)靶序列在转座因子两侧会形成正向重复靶序列在转座因子两侧会形成正向重复 f)转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应 转座的特点转座的特点转座的特点转座的特点c)转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）2024/5/864a)不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性b)转座不是5.5.转座子转座频率的调控转座子转座频率的调控转座酶的水平转座酶的水平-控制自身转座的核心控制自身转座的核心通过反义通过反义RNA的翻译水平控制的翻译水平控制-IS10RIS10R外侧边缘两个启动子外侧边缘两个启动子外侧边缘两个启动子外侧边缘两个启动子甲基化作用控制转座酶合成甲基化作用控制转座酶合成过表达过表达转座酶转座酶抑制转座抑制转座2024/5/8655.转座子转座频率的调控转座酶的水平-控制自身转座 表观修饰表观修饰转座元件的甲基化，不同转座子不一样，转座元件的甲基化，不同转座子不一样，SB促进，促进，PB抑制抑制组蛋白作用相关因子组蛋白作用相关因子 细胞细胞/生物类型生物类型2024/5/866 表观修饰2023/8/1665 5、转座子的某些遗传学效应转座子的某些遗传学效应转座子的某些遗传学效应转座子的某些遗传学效应 转座引起插入突变转座引起插入突变转座引起插入突变转座引起插入突变;ISIS、Tn Tn 和和和和 Mu Mu 噬菌体都可能引起插入突变。噬菌体都可能引起插入突变。噬菌体都可能引起插入突变。噬菌体都可能引起插入突变。插入位点若在一个顺反子（插入位点若在一个顺反子（插入位点若在一个顺反子（插入位点若在一个顺反子（cistron)cistron)的前端的前端的前端的前端功能基因功能基因功能基因功能基因中，中，中，中，可能造成可能造成可能造成可能造成极性突变极性突变极性突变极性突变（移码或终止密码突变）。（移码或终止密码突变）。（移码或终止密码突变）。（移码或终止密码突变）。指减低蛋白质合成速度的基因突变2024/5/8675、转座子的某些遗传学效应 转座引起插入突变;指减低蛋白质2024/5/8682023/8/168 造成插入位点靶造成插入位点靶DNA的少量碱基对重复的少量碱基对重复IS1、Tn10：造成造成9bp的重复。的重复。IS3：造成造成3或或4bp的重复。的重复。IS4：造成造成11bp的重复。的重复。插入位点出现新基因插入位点出现新基因 复合转座子带有抗性基因（如抗药性基因复合转座子带有抗性基因（如抗药性基因ampc)，可产生两方面效应：一个基因的插入突，可产生两方面效应：一个基因的插入突变；出现抗药基因。变；出现抗药基因。2024/5/869 造成插入位点靶DNA的少量碱基对重复IS1、Tn10 引起染色体畸变引起染色体畸变 在一个染色体上（甚至不同染色体上）若有同一转座在一个染色体上（甚至不同染色体上）若有同一转座子的两个拷贝，其提供的相同重组位点，可导致缺失、倒子的两个拷贝，其提供的相同重组位点，可导致缺失、倒位、插入。位、插入。方向相同：产生缺失。方向相同：产生缺失。方向相反：发生倒位。方向相反：发生倒位。转座引起的生物进化转座引起的生物进化2024/5/870 引起染色体畸变 在一个染色体上（甚至不同2024/5/8712023/8/171通过转座子介导的姐妹染色单体间的染色体内异位交换通过转座子介导的姐妹染色单体间的染色体内异位交换 2024/5/872通过转座子介导的姐妹染色单体间的染色体内异位交换 2023/切除效应切除效应切除效应切除效应指转座子从原来位置上消失。指转座子从原来位置上消失。指转座子从原来位置上消失。指转座子从原来位置上消失。准确切除：使原插入发生恢复突变。准确切除：使原插入发生恢复突变。准确切除：使原插入发生恢复突变。准确切除：使原插入发生恢复突变。不准确切除：留下转座子残迹，产生插入突变，但不准确切除：留下转座子残迹，产生插入突变，但不准确切除：留下转座子残迹，产生插入突变，但不准确切除：留下转座子残迹，产生插入突变，但转座子标志消失。转座子标志消失。转座子标志消失。转座子标志消失。2024/5/873 切除效应2023/8/173转座子切离所造成的序列变异 2024/5/874转座子切离所造成的序列变异 2023/8/174 外显子改组外显子改组 当二个转座子被同一转座酶识别而整合到染色体的邻近当二个转座子被同一转座酶识别而整合到染色体的邻近位置时，则位于它们位置时，则位于它们之间的序列之间的序列有可能被转座酶作用而有可能被转座酶作用而转座转座，如果这如果这DNA序列中含有外显子，则被切离并可能插入另一基序列中含有外显子，则被切离并可能插入另一基因中，这种效应称为外显子改组因中，这种效应称为外显子改组(exon shuffling)(图图)。外显子改组将导致基因组中外显子改组将导致基因组中新基因的产生新基因的产生。2024/5/875 外显子改组2023/8/175双转座子插入所引起的外显子改组示意图双转座子插入所引起的外显子改组示意图 2024/5/876双转座子插入所引起的外显子改组示意图 2023/8/176（1）可使原来相距较远的基因组合在一起，形成一个操纵子。可使原来相距较远的基因组合在一起，形成一个操纵子。（2）产生一个新蛋白，把原来两段分离的产生一个新蛋白，把原来两段分离的DNA序列连在一序列连在一 起。起。（3）启动子部位的插入可使基因打开或关闭。启动子部位的插入可使基因打开或关闭。（4）过多转座（频率过高）对细胞不利，细胞在长期进化中形成）过多转座（频率过高）对细胞不利，细胞在长期进化中形成 了一些不利于转座的代谢途径，可与转座过程平衡。了一些不利于转座的代谢途径，可与转座过程平衡。（5）转座基因插入时，大多数受体基因均被钝化，但也有基因被转座基因插入时，大多数受体基因均被钝化，但也有基因被 激活。（这是因为转座子有自己的启动子，在使转位酶转录激活。（这是因为转座子有自己的启动子，在使转位酶转录 的同时，也可使相邻基因转录）。的同时，也可使相邻基因转录）。6 6、转座子效应的意义、转座子效应的意义2024/5/8776、转座子效应的意义2023/8/177第五节第五节 原核和真核生物转座成原核和真核生物转座成分分2024/5/878第五节 原核和真核生物转座成分2023/8/1781.原核生物转座因子：原核生物转座因子的类型：插入序列；转座子；转座噬菌体 2024/5/8791.原核生物转座因子：原核生物转座因子的类型：A.插入序列(IS，inserted sequence):简单的转座因子,携带有转座酶基因,两端有反向重复序列.eg.E.coli中的IS1IS11等。发现：E.coli中一种突变体：A.不能通过核酸置换回复非点突变；B.可自然回复不是缺失；C.突变比野生型密度梯度大增加一段DNA;D.变性单链电镜下出现颈环结构反向重复序列。2024/5/880A.插入序列(IS，inserted sequenceB.转座子(Tn,transposon):携带有转座酶基因及抗性基因或其它基因，两端有相同的序列(IS)。eg.酵母(Yeast)中的Tn1、Tn2 Tn9等 Tn3:携带有tnpA、ampR、tnpR等基因，两端分别有36bp的IR;Tn9:末端是两个IS12024/5/881B.转座子(Tn,transposon):2023/8/C.转座噬菌体(mutator phage)，巨型转巨型转座子座子 携带有tnpA、tnpB基因，末端有E.coli DNA,近邻类似IS序列，具有高频的转座作用。2024/5/882C.转座噬菌体(mutator phage)，巨型转座C repressor for A,BB 33 kd 与转座有关与转座有关A 70 kd 转座酶转座酶U,S 毒性蛋白毒性蛋白attL,attR 与寄主同源，反向重复，转座必需与寄主同源，反向重复，转座必需 Gin G区倒位酶区倒位酶G 倒位区倒位区 38kb att L C A B S U att R 150bp 1.5kb Pgin 以以E.coli为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解）为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解）2024/5/883C repressor for A,BG 倒位区 38 Mu的插入途径的插入途径a）侵入的侵入的Mu在溶源化在溶源化过程中任意插入寄过程中任意插入寄DNAb）进入裂解生长后，进入裂解生长后，复制产生后代复制产生后代Mu DNA几乎全部插入寄主几乎全部插入寄主DNA中，并可继续转座（形中，并可继续转座（形成寄主成寄主DNA和和Mu的共合的共合体），噬菌体成熟时，体），噬菌体成熟时，切段共合体包装切段共合体包装2024/5/884 Mu的插入途径a）侵入的Mu在溶源化过程中任意插入寄D5 真核生物转座成分玉米地中的先知Barbara McClintock1902-1992 Nobel Prize for PhysiologyMedicine 19832024/5/8855 真核生物转座成分玉米地中的先知2023/8/185v McClintock 1938年，提出转座基因概念年，提出转座基因概念 1944-1950，阐明，阐明“Ds-Ac调控系统调控系统”1983年，获诺贝尔生理医学奖年，获诺贝尔生理医学奖v J.Shapiro等等 1980年，证实了可移位的遗传基因年，证实了可移位的遗传基因存在存在 2024/5/886 McClintock 2023/8/1861.真核生物的转座子分类真核生物的转座子分类 a)转座机制与细菌的转座子类似转座机制与细菌的转座子类似 遗传信息：遗传信息：DNADNA 玉米的玉米的Ac-Ds元件、果蝇的元件、果蝇的P元件和元件和FB元件等元件等 b)转作机制类似逆转录病毒转作机制类似逆转录病毒 遗传信息：遗传信息：RNADNARNA 如：逆转录病毒、果蝇的如：逆转录病毒、果蝇的Copia元件元件、酵母的、酵母的Ty元件元件根据转座机制目前分为两类：根据转座机制目前分为两类：2024/5/8871.真核生物的转座子分类 a)转座机制与细菌的转座Ac因子因子全长全长4.5kb，有，有5个外显子，其产物是转座酶。个外显子，其产物是转座酶。Ac因子因子两端是长两端是长11bp的反向重复序列的反向重复序列(IR)；Ds因子因子长长0.4-4kb，它的中间，它的中间(在在转座酶基因中转座酶基因中)有许多种长度有许多种长度不等的缺失不等的缺失,如如Ds9只缺失只缺失194bp，而，而Ds6则缺失则缺失2.5kb，Ds的两端也都有的两端也都有11bp的反向重复序列。的反向重复序列。2.玉米的玉米的Ac-Ds元件元件2024/5/888Ac因子全长4.5kb，有5个外显子，其产物是转座酶。Ac因 Ac-Ds转座元件结构示意图。右边示转座元件结构示意图。右边示Ac及及Ds元件的单链元件的单链DNA末端反向重复末端反向重复配对所形成的茎环结构，这种结构可能对转座有意义配对所形成的茎环结构，这种结构可能对转座有意义2024/5/889 Ac-Ds转座元件结构示意图。右边示Ac及Ds元件的单 由于缺失转座酶，由于缺失转座酶，Ds因子不能自主移动，因此因子不能自主移动，因此Ds因因子是非自主移动的受体因子子是非自主移动的受体因子(dissociator)，而，而Ac则为自主则为自主移动的调节因子移动的调节因子(activator)，Ds的转座依赖于的转座依赖于Ac元件的存元件的存在。在。Ac、Ds的转座属于的转座属于非复制机制非复制机制，即不是复制一份拷，即不是复制一份拷贝后将拷贝转移，而是直接从原来位置消失。贝后将拷贝转移，而是直接从原来位置消失。2024/5/890 由于缺失转座酶，Ds因子不能自主移玉米转座因子对胚乳颜色的影响 2024/5/891玉米转座因子对胚乳颜色的影响 2023/8/191Ds转座还可以导致染色体断裂：转座还可以导致染色体断裂：McCtinock还发现还发现Ds存在于玉米存在于玉米9号染号染色体的一条臂上（带有结节），色体的一条臂上（带有结节），Ds可导可导致染色体断裂致染色体断裂2024/5/892Ds转座还可以导致染色体断裂：McCtinock还发现Ds存spm因子影响基因的表达Spm因子：11个外显子，产生2.5kb左右的转录本，合成包含621 个氨基酸的tnpA 蛋白。tnpA 蛋白与切除功能有关。第一个内含子中包含ORF1 和ORF2 两个附加的开放阅读框。选择性剪切过程中产生包含ORF1 和ORF2 的mRNA，长约6kb，数量是tnpA mRNA的1，编码tnp B蛋白，该蛋白与末端重复序列的结合有关。2024/5/893spm因子影响基因的表达Spm因子：2023/8/193Spm因子的插入可以控制插入位点基因的表达：(1)dspm-suppressible allele：而自主性因子spm的介入，可导致基因的完全失活。原因是tnpA蛋白可以和非自主性spm因子的靶位点结合，使基因的转录无法继续。(2)dspm-dependent allele：在基因附近包含一个dspm因子（而不是基因内部），该因子可提供一个增强子，促进基因的表达2024/5/894Spm因子的插入可以控制插入位点基因的表达：2023/8/13.果蝇中的转座子P因子因子Copia因子因子2024/5/8953.果蝇中的转座子P因子2023/8/195 果蝇的果蝇的P因子有两种类型，一类是因子有两种类型，一类是全长全长P因子因子，长，长2907bp，两端有，两端有33bp的反向重复序列的反向重复序列(IR)，有，有4个外显子个外显子(4个个ORF)，编码转座酶编码转座酶(图图)；另一类为；另一类为缺失型缺失型P因子因子，它不能编码转座酶，它不能编码转座酶，它的转座依赖于全长它的转座依赖于全长P因子。缺失型因子。缺失型P因子都是由活性因子都是由活性P因子因子的中段缺失衍生而来的，长度从的中段缺失衍生而来的，长度从500bp到到1400bp不等。不等。不带有不带有P因子的品系称为因子的品系称为M品系，带有品系，带有P因子的品系称为因子的品系称为P品系。品系。P因子的转座也属于非复制型。因子的转座也属于非复制型。2024/5/896 果蝇的P因子有两种类型，一类是全长P因子，长果蝇P因子的结构 2024/5/897果蝇P因子的结构 2023/8/197果蝇杂种不育取决于基因组中P因子和不同细胞型中阻遏蛋白的相互作用 2024/5/898果蝇杂种不育取决于基因组中P因子和不同细胞型中阻遏蛋白的相互Copia因子因子是果蝇的一种反转录转座子是果蝇的一种反转录转座子(retrotransposon或或retroposon)，所谓反转录转座子是指通过，所谓反转录转座子是指通过RNA为中介，为中介，反转录成反转录成DNA后进行转座的可动元件。后进行转座的可动元件。Copia因子由于存在大量密切相关的编码高丰度因子由于存在大量密切相关的编码高丰度mRNAs的的序列而得名。序列而得名。家族数量巨大，分布广泛。家族数量巨大，分布广泛。2024/5/899Copia因子是果蝇的一种反转录转座子(retrotrans2024/5/81002023/8/1100Copia因子全长因子全长5000bp左右，两端各有一个相同的左右，两端各有一个相同的276bp的正向重复序列的正向重复序列(DR)，每个正向重复序列本，每个正向重复序列本身的两端还各有一个反向重复序列身的两端还各有一个反向重复序列(IR)。当。当Copia因子转座插入染色体时，在插入位点上产生因子转座插入染色体时，在插入位点上产生5bp的的正向重复序列。正向重复序列。Copia因子的转录产物是因子的转录产物是po1y(A)+mRNA，它有两，它有两种形式，一种是完整全长的转录本，另一种是部种形式，一种是完整全长的转录本，另一种是部分长度即截短的转录本，二者都有相同的分长度即截短的转录本，二者都有相同的5末端。末端。翻译产生的蛋白质可能参与翻译产生的蛋白质可能参与RNA的剪接和多肽的的剪接和多肽的切割。关于切割。关于Copia因子转座的具体过程和细节目前因子转座的具体过程和细节目前还不十分清楚。还不十分清楚。5 mRNA 32024/5/8101Copia因子全长5000bp左右，两端各有一个相同的276 直到直到1997年年Ivics等基于积累的系统发生数据等基于积累的系统发生数据,利用生物信息学的方法重建了脊椎动物中第一个利用生物信息学的方法重建了脊椎动物中第一个有活性的转座子系统有活性的转座子系统-“睡美人睡美人”转座子转座子（Sleeping Beauty transposon,SB）。）。睡美人（睡美人（SBSB）转座子转座子 作为基因转移和表达系统作为基因转移和表达系统的转座子只是在细菌，真菌，的转座子只是在细菌，真菌，植物和无脊椎动物中应用较植物和无脊椎动物中应用较多，长期以来在脊椎动物中多，长期以来在脊椎动物中仍然是空白。仍然是空白。2024/5/8102 直到1997年Ivics等基于积累的系统发生数据,图图1.“睡美人睡美人”转座酶的重建转座酶的重建 a）“睡美人睡美人”转座酶基因的重建过程转座酶基因的重建过程 b）“睡美人睡美人”转座酶基因各结构域的示意图转座酶基因各结构域的示意图 2024/5/8103图1.“睡美人”转座酶的重建 2023/8/1103A.A.转座子转座子 B.B.转座酶转座酶睡美人转座子系统结构睡美人转座子系统结构2024/5/8104A.转座子 B.转座酶睡美人转座子系统结构2023/8/1睡美人转座子系统转座机制睡美人转座子系统转座机制2024/5/8105睡美人转座子系统转座机制2023/8/1105一种转基因动物的制备方法一种转基因动物的制备方法（公开号：（公开号：CN 101289671A，2008年年10月受理）月受理）2024/5/8106一种转基因动物的制备方法（公开号：CN 101289671piggyBac(PB)复旦大学发育生物学研究所的科研人员将一种源于飞蛾甘蓝尺蠖中的DNA转座因子piggyBac(PB)2024/5/8107piggyBac(PB)复旦大学发育生物学研究所的科研人员2024/5/81082023/8/11082024/5/81092023/8/1109我国首创哺乳动物转座因子系统我国首创哺乳动物转座因子系统 （人民（人民日报日报 7月月26日日 第十一版）第十一版）piggyBac(PB)转座子在哺乳动物细胞和转座子在哺乳动物细胞和小鼠中的高效转座小鼠中的高效转座 2024/5/8110我国首创哺乳动物转座因子系统 （人民日报 7月26日 第十转座子的应用研究基因的功能基因治疗转基因动物2024/5/8111转座子的应用研究基因的功能2023/8/1111