BD多色流式全面解决方案培训课件

BD多色流式全面多色流式全面解决方案解决方案 Identification of immune cell subsets by eight color antibody staining Nat Rev Immunol,20122BD多色流式全面解决方案Nat Rev Immunol,2012 Eight color antibody panels proposed by the Human Immunophenotyping Consortium 3BD多色流式全面解决方案v多色方案中荧光素选择的重要性v荧光素同抗原的搭配v优化仪器配置，提高分辨率v多色Panel设计实例分析主要内容主要内容4BD多色流式全面解决方案流式多色方案中流式多色方案中荧光素光素选择的重要性的重要性5BD多色流式全面解决方案V450BV510BV421BV605CD4CD3合适的荧光素选择帮助我们更好的理解实验对于弱的抗原，亮的染料尤为重要荧荧光素的光素的选择选择是关是关键键6BD多色流式全面解决方案荧荧光素的光素的选择选择是关是关键键CD3BV421V450FITCPerCP-Cy5.5PEPE-CF594Alexa Fluor647Alexa Fluor 700CD197(CCR7)选择正确的荧光素组合是回答生物学问题的关键7BD多色流式全面解决方案荧光素分辨率等光素分辨率等级等级由细胞经不同克隆，不同规格的抗体在多种流式细胞仪上的实验所得的染色指数（分辨率）的比较决定激光器的能量，PMT电压，光学部件，抗体克隆和生物样品等多种因素均会影响荧光素/试剂在某个特定仪器上的效果8BD多色流式全面解决方案基于基于仪仪器配置器配置选择荧选择荧光素光素BDAccuriC6BDFACSVerseBDFACSCantoIIBDFACSVerseBDFACSCantoIIBDLSRFortessaBDLSRFortessaX-20BDLSRFortessaBDLSRFortessaX-20488nmFITCPEPerCP-Cy5.5FITCPEPerCP-Cy5.5PE-Cy7FITCPEPerCP-Cy5.5PE-Cy7FITC（BB515）PEPE-CF594PerCP-Cy5.5PE-Cy7FITC（BB515）PerCP-Cy5.5640nmAPCAPCAPC-Cy7APCAPC-Cy7APCAlexaFluor700APC-H7/APC-Cy7APCAlexaFluor700APC-H7/APC-Cy7405nmBV421/V450BV510/V500BV421/V450BV510/V500BV605BV650BV711BV786BV421/V450BV510/V500BV605BV650BV711BV786561nmPEPE-CF594PE-Cy5PE-Cy7355nmBUV395BUV737BUV395BUV737#Lasers223459BD多色流式全面解决方案BD Horizon Brilliant Violet六种被紫激光激发的染料基础多聚体:BV421 and BV510串联体:BV605,BV650,BV711 and BV786亮的染料减少交叉激光激发减少样品制备影响10BD多色流式全面解决方案与其他染料的比与其他染料的比较较BV786BV605BV510BV421BV711BV650PEBV CD4 试剂与PE比较11BD多色流式全面解决方案Buffer Compatibility Surface StainFix/Perm-StainStain-Fix/PermPerm III SolutionHu CD4 BV786Transcription Factor BufferFix/Perm-StainStain Fix/PermHu CD4 BV51012BD多色流式全面解决方案Buffer compatibility:intracellular stainingUnstimulatedCMV pp65CD4CD8IFN-g PEIFN-g PESEB13BD多色流式全面解决方案紫激光配置紫激光配置检测光学部件需匹配所用的荧光素许多仪器已经配置可以使用纳米晶体染料为最大限度地发挥BD Horizon Brilliant Violet 的组合优势，仪器可能需要更新配置更新配置可提高扩展仪器的性能14BD多色流式全面解决方案BD Horizon Brilliant Ultraviolet(BUV)两种被355nm紫外激光激发的新荧光素BUV395:对其他检测其几乎无溢漏BUV737:对Alexa Fluor 700中等溢漏BUV395中等亮度Exmax/Emmax:348 nm/395 nm滤光片:379/28BPBUV737明亮Exmax/Emmax:348 nm/737 nm滤光片:740/35BP;690LP15BD多色流式全面解决方案与其他染料的比与其他染料的比较较BV421PEFITCBUV395BUV737BUV CD4 试剂与 PE,BV421 和 FITC 比较16BD多色流式全面解决方案BD Horizon Brilliant Blue(BB515)Brightness:Very BrightEx Max 490 nmEm Max 515nmFilter:Same as FITC(e.g.530/30 nm)17BD多色流式全面解决方案BB515 is up to seven times brighter than FITCHu CD4 Hu CD3Ms CD11b Hu CD19Hu CD12718BD多色流式全面解决方案Better resolution of dim markersCD25 FITC or CD25 BB515 and CD3 PerCP-Cy5.5,CD4 APC,CD127 PECD25 FITCCD25 BB51519BD多色流式全面解决方案荧荧光素同抗原的搭配光素同抗原的搭配理解抗原表达的特性选择最合适荧光素偶联的抗体20BD多色流式全面解决方案三大三大类:Primary:很好鉴定，容易区分阴阳性细胞群，阴阳性峰分得很开Examples:CD3,CD4,CD45Secondary:很好鉴定，较高水平表达，经常连续性表达Examples:CD27,CD28,CD45RA,CD45ROTertiary:低水平表达，激活性marker，或者表达区分不明显Example:CD25抗原的分抗原的分类类CD4CD45RACD25Mahnke YD,Roederer M.Optimizing a multicolor immunophenotyping assay.Clin Lab Med.2007;27:469-485.21BD多色流式全面解决方案在表达最低密度的抗原上匹配最亮的在表达最低密度的抗原上匹配最亮的荧光素光素抗原密度一定是在细胞亚群水平上确定的这个规则会由于通道间相互溢漏，共表达等原因有所改变抗原密度也会由于激活状态而有所改变抗原密度列表抗原密度列表22BD多色流式全面解决方案抗原和抗原和荧光素的光素的组合合high lowmedium23BD多色流式全面解决方案抗原共表达抗原共表达 Marker的共表达：的共表达：Population resolution is impacted by spillover.细胞群的分辨率会受到通道溢漏的影响Markers co-expressed on specific cell types should be conjugated to spectrally separated fluorochromes.在特定细胞亚群共表达的marker应该偶联光谱分离的荧光素T 细胞胞panel中中-可能用到的可能用到的marker:CD3,CD4,CD8,CD45RA,CD27,CCR7,CD25,CD12724BD多色流式全面解决方案优优化化仪仪器配置，提高分辨率器配置，提高分辨率分辨率的重要性优化仪器设置：CS&T荧光溢漏25BD多色流式全面解决方案分辨率分辨率分辨率 流式细胞仪区分弱染色信号和未染色信号的程度在多色情景下更为复杂清晰分群的能力取决于背景和阴性群体的分散度。清晰分群的能力取决于背景和阴性群体的分散度。26BD多色流式全面解决方案分辨率分辨率 vs.背景背景阴性群体背景高，不能清晰分群。阴性群体背景低但分散度（相对标准偏差）大，不能清晰分群。“Negative”DimBright阴性群体背景低，分群清晰。27BD多色流式全面解决方案染色指数染色指数:分辨率的度量分辨率的度量标准准亮度阴性信号的宽度阴性阴性群体群体的的宽度取决于度取决于仪器器性能性能检测效率,背景荧光和电子噪音 单色溢漏 多色方案亮度取决于亮度取决于试剂 抗原密度，所用荧光素仪器器通道电压增益，激光器能量28BD多色流式全面解决方案流式流式细胞胞仪设置和跟踪置和跟踪(CS&T)系系统CS&T是一个由软件（是一个由软件（FACSDiva 和和 FACSuite）和试剂（）和试剂（CST微球微球）整合而成的完整系统。整合而成的完整系统。CS&T 系统的作用系统的作用确定决定仪器性能，影响灵敏度/群体分辨率的因素相对荧光检测效率(Qr)相对光学背景(Br)系统电子背景噪音(SDen)标准化仪器设置应用设置跟踪仪器性能29BD多色流式全面解决方案CS&T 系系统的益的益处科学家科学家/使用使用者者从多色实验中得到高质量的数据每天提供稳定并可重复的数据根据实验条件优化仪器设置提供每次实验时仪器状态的参数平台负责人平台负责人/操作者操作者尽早发现仪器性能的下降帮助确定问题的来源提供设置仪器的信息（系统电子背景噪音）30BD多色流式全面解决方案仪器器设置置优化化 PMT电压使弱使弱荧光光细胞的分辨率最大化胞的分辨率最大化阴性阴性细胞胞标准偏差法准偏差法调整PMT电压使得o这种方法简单容易，对所有检测器提供更稳定的值o用未经染色的细胞CS&T 设置置对每个参数，设置PMT电压值使弱荧光微球的平均荧光强度等同于10倍的电子噪音o这是CS&T设置目标MFI值的PMT电压o对大多数参数适用，但对紫激光(V450,BV421)和远红外激光(APC-Cy7,PE-Cy7)通道电压倾向于将电压设置得过高31BD多色流式全面解决方案调整整PMT电压以使分辨率以使分辨率(SI)最大化最大化rSD is 2.5 SDen(20)FITC 检测器器(SDen=20)将电压从373升高至473后，该检测器的分辨率（染色指数）得到显著提高，变为原来的2.6倍将电压从473升至573后，阳性和阴性细胞的荧光强度得到同等程度的增强，对分辨率没有明显改进约473 V是理想的PMT电压设置值，其阴性细胞的相对标准偏差（rSD）大于电子噪音（SDen）的2.5倍PMT电压染色指数阳性细胞平均荧光强度阴性细胞平均荧光强度阴性细胞相对标准偏差32BD多色流式全面解决方案荧荧光溢漏光溢漏33BD多色流式全面解决方案荧荧光溢漏的重要性光溢漏的重要性1.多色方案群体分辨率多色方案群体分辨率为了使感兴趣的群体获得最好的分辨率，荧光溢漏是方案设计时唯一最为重要的因素。2.复复杂数据的可数据的可视性性不正确或欠佳的溢漏值计算会对实验所得的数据质量产生负面的影响。34BD多色流式全面解决方案 NegativePositiveMFIrSDMFIrSDNoComp123098Comp荧光溢漏到其他光溢漏到其他检测器器导致背景及信号分散，致背景及信号分散，影响分辨率影响分辨率荧光溢漏到其他检测器：比如PerCP-Cy5.5溢漏到PE-Cy7的检测器荧光溢漏导致：背景信号(MFI)增强信号分散/分散度（rSD）PE-Cy7PerCP-Cy5.5当样品经过正确地补偿后，被溢漏的检测器所检测到的阳性群体和阴性群体的平均荧光强度是相等的。然而，溢漏所致的信号分散（rSD）及因此引起的分辨率降低并不能被补偿所消除。rSDrSD29291432928935BD多色流式全面解决方案单单色色对对照照计算溢漏值的工具36BD多色流式全面解决方案补偿对补偿对照照 微球微球补偿微球的优势易用不需要细胞对于多数荧光素，所得的补偿值与细胞所得的一致37BD多色流式全面解决方案多色多色Panel设计实设计实例分析例分析For Research Use Only.Not for use in diagnostic or therapeutic procedures.APC-Cy7:US Patent 5,714,386Alexa Fluor is a registered trademark of Life Technologies Corporation.CF is a trademark of Biotium,Inc.Cy is a trademark of GE Healthcare.Cy dyes are subject to proprietary rights of GE Healthcare and Carnegie Mellon University and are made and sold under license from GE Healthcare only for research and in vitro diagnostic use.Any other use requires a commercial sublicense from GE Healthcare,800 Centennial Avenue,Piscataway,NJ 08855-1327,USA.BD,BD Logo and all other trademarks are property of Becton,Dickinson and Company.2014 BD23-16447-0038BD多色流式全面解决方案依据 机器性能(光路配置)分析中的生物学内在关系(目的细胞群，抗原密度和共表达)选择的荧光素优先顺序(荧光亮度和通道间溢漏)应用逻辑规则分配荧光素给特异性抗体多色多色实验实验Panel设计实设计实例分析例分析39BD多色流式全面解决方案6色色Treg细细胞配色胞配色实实例例40BD多色流式全面解决方案举例例1-遵循遵循规则根据抗原表达分配荧光素的原则来优化panel举例例2-最好的最好的实践践进一步优化panel使Treg的分辨率最大化抗原密度&共表达荧光素的亮度由于通道间溢漏导致的分散程度6色色Treg细细胞配色胞配色实实例例双激光双激光6色色Blue(488 nm)FITC/Alexa Fluor 488/BB515PEPerCP-Cy5.5/PerCPPE-Cy7Red(640 nm)APC/Alexa Fluor 647APC-H7/APC-Cy741BD多色流式全面解决方案Fluorochrome抗原密度和抗原密度和荧荧光素亮度匹配光素亮度匹配PEAPCPE-Cy7FITCPerCP-Cy5.5APC-Cy7CD25CD127CD45RACD4CD8CD3SpecificityANTIGENASSIGNMENTLaser荧光染料的强度与抗原表达水平相匹配低密度表达抗原需要更亮的荧光素荧光染料之间的重叠最小避免偶联染料带来的假阳性42BD多色流式全面解决方案优优化化Panel设计设计来提高来提高Treg的分辨率的分辨率 通过 分配PerCP-Cy5.5给CD8来减少PerCP-Cy5.5溢漏到溢漏到PE-Cy7通道的影响CD8 APC-H7CD4 PerCP-Cy5.5CD127 PE-Cy7 CD25 PECD3 FITCCD45RA APC CD8 PerCP-Cy5.5CD4 APC-H7CD127 Alexa Fluor 647 CD25 PECD3 FITCCD45RA PE-Cy7 通过分散CD25和CD127到不同激光管和选择最小溢漏荧光素来提高Treg分辨率43BD多色流式全面解决方案6色色Panel中例中例1，例，例2结果比果比较1st Example2nd Example例2中CD127和CD25的分辨率都得到提高例2中比较容易对Treg圈门CD127 PE-Cy7CD25 PECD25 PECD25 PECD25 PECD127 Alexa Fluor 647CD45RA PE-Cy7CD45RA APC45BD多色流式全面解决方案8色色T细胞胞Panel设计46BD多色流式全面解决方案8色色T细细胞胞Panel设计设计2个不同方案个不同方案Expanding the 6-color panel to an 8-color panel从已有的6色panel开始，在拓展的机器配置上添加marker优化6色方案按照多色panel设计的原则，根据机器配置建立特异性的8色方案Scenario#1Scenario#2Blue(488 nm)FITC/Alexa Fluor 488/BB515PEPerCP-Cy5.5/PerCPPE-Cy7Red(640 nm)APC/Alexa Fluor 647APC-H7/APC-Cy7Violet(405 nm)BV421/V450BV510/V50047BD多色流式全面解决方案方案方案1:6色色Panel优化到化到8色色PanelCD3CD4CD8CD25CD127CD45RACCR7CD27FITCAPC-Cy7PerCP-Cy5.5PEAPCPE-Cy7BV421BV510紫激光可得紫激光可得BV421 and BV510:2个最亮的荧光素亮度和少的溢漏允许被添加进panel然而6色panel并没有考虑添加更多marker，因此对于8色panel来说，并不是最佳的添加了2个新的marker，但整个panel并没有遵循panel设计的原则48BD多色流式全面解决方案方案方案1 SSCCD3 FITCCD27 BV510CD8 PerCP-Cy5.5CD4 APC-Cy7CD25 PECD45RA PE-Cy7CD27 BV510CCR7 BV421CD45RA PE-Cy7CCR7 BV421CD127 Alexa Fluor 64749BD多色流式全面解决方案FluorochromeV450V500SpecificityASSIGNMENTBV421 CCR7PECD27PE-Cy7CD25APC/Alexa Fluor 647CD127FITCCD45RAPerCP-Cy5.5CD8BV510CD3APC-Cy7CD4Laser方案方案2:按照按照3激光配置激光配置优优化最佳化最佳8色方案色方案50BD多色流式全面解决方案SSCCD3 BV510CD27 PECD45RA FITCCCR7 BV421CD8 PerCP-Cy5.5CD4 APC-Cy7CD127 Alexa Fluor 647CD25 PE-Cy7CD27 PECD45RA FITCCCR7 BV421方案方案2:按照按照3激光配置激光配置优优化最佳化最佳8色方案色方案51BD多色流式全面解决方案8-Color Panels:例例1和例和例2中的中的补偿1st:UsingExisting 6-ColorPanelCD25 PECD45RA FITCCD127 Alexa 647CD25 PE-Cy7CCR7 BV421CD45RA PE-Cy7CCR7 BV4212nd:Building From ScratchCD45RA FITCCD45RA FITCCD27 PECCR7 BV421CD27 BV510CCR7 BV421CD45RA PE-Cy7CD45RA PE-Cy7CD25 PE gives slightly better resolution than CD25 PE-Cy7.CD45RA negatives have significant less spread in scenario 2.Better CD27 resolution in scenario 2.CD127 Alexa 64752BD多色流式全面解决方案拓展拓展8色色panel到到11色色panelCCR4,CD95,CD122是非常重要的对于鉴定新的Treg亚群，我们想尽可能解决这个问题在8色panel设计策略的基础上添加新的marker，荧光素的分配显得很容易我们做了如下分配，尽量挑选亮的荧光素，其中有的荧光素只有很小的溢漏，是不同的激光管激发的CCR4 APC,CD95 PE-Cy7,CD122 BV421添加添加Treg marker到到这个个panel中中53BD多色流式全面解决方案11色色Panel:拓展新的拓展新的panel后，后，Effector/Memory Marker 分辨率没有分辨率没有改改变8-color panel built for drop-ins11-color:8 Color+Tregdrop-insCD27 BV510CD45RA AF700CCR7 PE-CF594(YG)CD27 BV510CD45RA AF700CCR7 PE-CF594(YG)CD27 BV510CCR7 PE-CF594(YG)CD27 BV510CD45RA AF700CCR7 PE-CF594(YG)CD45RA AF70054BD多色流式全面解决方案根据根据panel设计的的规则得到最佳数据得到最佳数据根据机器配置选择荧光素对抗原进行分类，在表达特性基础上分配荧光素优化机器配置和补偿Panel设计是一个反复的是一个反复的过程程决定一个决定一个panel是否是最佳的唯一是否是最佳的唯一办法是和相关法是和相关对照一起照一起上机上机检测总结总结55BD多色流式全面解决方案多色流式方案多色流式方案设计设计56BD多色流式全面解决方案让让可得更多，可可得更多，可见见更清晰更清晰 多色流式多色流式 Thank you judy_ 57BD多色流式全面解决方案