食品中菌落总数和大肠菌群的检测

食品中菌落总数和大肠菌食品中菌落总数和大肠菌群的检测群的检测菌落总数与大肠菌群的测定菌落总数与大肠菌群的测定二、二、大肠菌群的检测大肠菌群的检测一、一、菌落总数测定法菌落总数测定法太仓市产品质量监督检验所 主讲人：詹克航主讲人：詹克航 2011.09.15 目目前前，食食品品卫卫生生标标准准中中的的微微生生物物指指标标一一般般分分为为菌菌落落总数总数、大肠菌群和致病菌大肠菌群和致病菌三项。三项。细菌计数细菌计数 食食品品中中菌菌落落总总数数通通常常指指1g，1ml或或1cm2面面积积食食品品上上的的细菌数目而言的，而不考虑其种类。细菌数目而言的，而不考虑其种类。由由于于检检测测计计数数方方法法的的不不同同,一一般般有有两两种种表表示示方方法法（菌菌落落总数总数和和细菌总数细菌总数）。）。食品卫生标准中的微生物指标概论食品卫生标准中的微生物指标概论菌落总数:菌落（Colony）菌落菌落(colony)：生长在固生长在固体培养基上，来源于一个体培养基上，来源于一个细胞，肉眼可见的细胞群细胞，肉眼可见的细胞群体。体。一一种种是是在在严严格格规规定定条条件件下下（样样品品处处理理，培培养养基基及及其其pH培培养养温温度度与与时时间间、计计数数方方法法等等），使使适适应应这这些些条条件件的的每每一一个个活活菌菌细细胞胞必必须须而而且且只只能能生生成成一一个个肉肉眼眼可可见见的的菌菌落落，经经过过计计数数所所获获得得的的结结果果称称为为该该食品的菌落总数食品的菌落总数。另一种另一种是将食品经过适当处理（溶解和稀是将食品经过适当处理（溶解和稀释）后，在显微镜下对细菌细胞数进行直释）后，在显微镜下对细菌细胞数进行直接计数，这样计数的结果，既包括活菌，接计数，这样计数的结果，既包括活菌，也包括尚未被分解的死菌体，因此称为也包括尚未被分解的死菌体，因此称为细细菌总数菌总数。目前我国食品卫生标准中规定的细菌总目前我国食品卫生标准中规定的细菌总数实际上是指数实际上是指菌落总数菌落总数。即指的是在平板。即指的是在平板计数培养基上长出的菌落数。计数培养基上长出的菌落数。那么检测食品中的菌落总数有何卫生学意义呢？那么检测食品中的菌落总数有何卫生学意义呢？一一方方面面，它它可可以以作作为为食食品品被被污污染染程程度度的的标标志志。检检测测食食品品中中的的菌菌落落总总数数，可可以以了了解解食食品品在在生生产产中中，从从原原料料加加工工到到成成品品包包装装受受外外界界污污染染的的情情况况从从而而反反映映食食品品的的卫卫生生质质量量。一一般般来来说说、菌菌落落总总数数越越多多，说说明明食食品品的的卫卫生生质质量量越越差差，遭遭受受病病原原菌菌污污染染的的可可能能性性越越大大。而而菌菌落落总总数数仅仅少少量量存在时，存在时，病原菌污染的可能性就会降低或者几乎不存在。病原菌污染的可能性就会降低或者几乎不存在。许许多多实实验验结结果果表表明明，食食品品中中细细菌菌总总数数能能够够反反映映出出食食品品的的新新鲜鲜程程度度、是是否否变变质质以以及及生生产产过过程程的的一一般般卫卫生生状状况况等等。一一般般来来讲讲，食食品品中中细细菌菌总总数数越越多多，则则表表明明该该食食品品污污染程度越重，腐败变质的可能性越大。染程度越重，腐败变质的可能性越大。另另一一方方面面，它它可可以以用用来来预预测测食食品品可可能能存存放放的的期期限限程程度度。如如实实验验表表明明，菌菌数数为为105cfu/cm2的的鱼鱼，在在0下下可可保保持持6d，而而菌数为菌数为103cfu/cm2时，保存期可达时，保存期可达12d。但但上上述述规规则则也也有有例例外外，有有些些食食品品成成品品的的菌菌落落总总数数并并不不高高，但但由由于于已已有有细细菌菌繁繁殖殖并并已已产产生生了了毒毒素素，且且毒毒素素性性状状稳稳定定，仍仍存存留留于于食食品品中中；再再有有一一些些食食品品如如酸酸泡泡菜菜和和酸酸乳乳等等，本本身身就就是是通通过过微微生生物物的的作作用用而而制制成成的的，且是活菌制品。且是活菌制品。自自然然界界细细菌菌的的类类很很多多，各各种种细细菌菌的的生生理理特特性性和和所所要要求求的的生生活活条条件件不不尽尽相相同同，（如如嗜嗜温温菌菌30-37，4.83hr；嗜嗜冷冷菌菌 20-25 5-7d或或5-10 10-14d；嗜嗜热热菌菌 45-55 2-3天天）如如果果要要检检验验样样品品中中所所有有种种类类，必必须须用用不不同同培培养养基基及及不不同同培培养养条条件件去去满满足足其要求，才能把各种细菌都检验出来，这样工作量将会很大。其要求，才能把各种细菌都检验出来，这样工作量将会很大。我我们们也也知知道道，自自然然界界尽尽管管细细菌菌种种类类很很多多，但但异异养养、中中温温、好好气气性性细细菌菌占占绝绝大大多多数数。因因此此，严严格格讲讲，用用这这种种方方法法所所得得到到的的结结果果，主主要要是是一一些些能能在在平平板板计计数数琼琼脂脂培培养养基基上上生生长长的的，好好氧氧性性嗜嗜温温细细菌菌的的菌菌落落总总数数。但但是是把把它它们们作作为为细细菌菌总总数数已已得得到到公公认认。这这不不仅仅在在食食品品的的卫卫生生检检验验中中，而而且且在在一一切切微微生生物物区区系系分分析析中中，都把它们作为了细菌总数的指标。都把它们作为了细菌总数的指标。注注意意：是是并并不不是是所所有有食食品品都都规规定定细细菌菌指指标标，如如酸酸乳乳、酸酸泡泡菜等。菜等。因因此此，菌菌落落总总数数的的测测定定对对评评价价食食品品的的新新鲜鲜度度和和卫卫生生质质量量有有着着一一定定的的卫卫生生指指标标的的作作用用，但但本本能能单单凭凭此此一一项项指指标标来来判判定定食食品品的的卫卫生生质质量量，还还必必须须配配合合大大肠肠菌菌群群和和致致病病菌菌等等检检验，才能作出比较全面、准确的评价。验，才能作出比较全面、准确的评价。一、菌落总数测定法一、菌落总数测定法菌落总数菌落总数（aerobicplatecount）食品检样经过处理，在一定条件下培养后食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培养如培养基成分、培养温度和时间、基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等、需氧性质等)，所得，所得1mL(或或1g)检样中形成菌落的总数。本标准规定的培检样中形成菌落的总数。本标准规定的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。GB/T 4789.2-2010本标准与本标准与GB/T4789.2-2008相比主要修改如下：相比主要修改如下：修改了标准的中英文名称；修改了标准的中英文名称；(食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定/食品卫生微生物学检验 菌落总数测定)修改了菌落总数计算公式中的解释；修改了菌落总数计算公式中的解释；修改了培养基和试剂；修改了培养基和试剂；删除了第二法删除了第二法菌落总数菌落总数PetrifilmTM测试片法。测试片法。(培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂；培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂；菌落总数计算公式进行了修改；菌落总数计算公式进行了修改；增加了第二法增加了第二法“菌落总数菌落总数PetrifilmTM测试片法测试片法”；)-20083.设备和材料设备和材料 3.1恒温培养箱：恒温培养箱：361301。3.2冰箱：冰箱：25。3.3恒温水浴箱：恒温水浴箱：461。3.4天平：感量天平：感量0.1g。3.5均质器均质器3.6振荡器振荡器3.7无菌吸管：无菌吸管：1mL（具（具0.01mL刻度）、刻度）、10mL（具（具0.1mL刻度）或微量移液器及其吸头。刻度）或微量移液器及其吸头。3.8无菌锥形瓶：容量为无菌锥形瓶：容量为250mL、500mL。3.9无菌培养皿：直径为无菌培养皿：直径为90mm。3.10pH计或计或pH比色管或精密比色管或精密pH试纸。试纸。3.11放大镜或放大镜或/和菌落计数器或和菌落计数器或PetrifilmTM自动自动判读仪。判读仪。3.12无菌刀、剪子、镊子等无菌刀、剪子、镊子等。4培养基和试剂培养基和试剂4.1平板计数琼脂培养基平板计数琼脂培养基(PlatecountagarPCA)，见附录见附录A中中A.1。pH7.00.2 4.2磷酸盐缓冲稀释液，见附录磷酸盐缓冲稀释液，见附录A中中A.2。pH7.24.3无无菌菌生生理理盐盐水水,见见附附录录A中中A.3：称称取取8.5g氯氯化化钠钠溶溶于于 1000mL蒸蒸 馏馏 水水 中中，1 2 1高高 压压 灭灭 菌菌15min。(4.41mol/L氢氧化钠（氢氧化钠（NaOH）：称取）：称取40g氢氧化钠溶于氢氧化钠溶于1000mL水中。水中。4.51mol/L盐酸（盐酸（HCl）：移取浓盐酸）：移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至，用蒸馏水稀释至1000mL4.6PetrifilmTM菌落总数测试片（菌落总数测试片（aerobiccountplate）和压板。）和压板。)4.775%乙醇。乙醇。区别：区别：pH值（值（08：pH7.00.2；03：pH7.27.4）细细 菌菌 学学 检检 验验 程程 序序-细菌总数细菌总数5、第一法第一法平板菌落计数法平板菌落计数法6、操作步骤、操作步骤6.1.1固体和半固体食品：固体和半固体食品：以无菌操作称取以无菌操作称取25g样品，放入于装有样品，放入于装有225mL磷酸盐缓冲稀释液或磷酸盐缓冲稀释液或0.85生理盐水的无菌均质杯内，于生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min10000r/min均质均质1min2min，制成，制成1:10样品匀样品匀液；或放入于液；或放入于225mL稀释液的无菌均质袋中，用稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打拍击式均质器拍打1min2min制成制成1:10的样品的样品匀液。匀液。6.1.2液体样品：液体样品：以无菌吸管吸取样品以无菌吸管吸取样品25mL放放入装有入装有225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充中，充分混匀，制成分混匀，制成1:10的样品匀液（的样品匀液（表面取样的样品表面取样的样品按一定的比例制成按一定的比例制成1:1样品匀液和样品匀液和/或或1:10样品匀样品匀液。液。）。）。6.1样品的稀释样品的稀释6.1.3用用1mL无菌吸管或微量移液器吸取无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀样品匀液液1.0mL，沿管壁缓慢注于装有，沿管壁缓慢注于装有9mL稀释液的无菌试管稀释液的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品的样品匀液。匀液。6.1.4另取另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做操作顺序，做10倍递增样品匀液，如此每递增稀释一次，倍递增样品匀液，如此每递增稀释一次，即换用即换用1次次1mL灭菌吸管或吸头。灭菌吸管或吸头。6.1.5根据对样品污染情况的估计，选择根据对样品污染情况的估计，选择23个适宜个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），分别在做稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），分别在做10倍递增稀释的同时，吸取倍递增稀释的同时，吸取1.0mL样品匀液于无菌平样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时分别取皿内，每个稀释度做两个平皿。同时分别取1mL稀释液稀释液加入加入两个无菌平皿两个无菌平皿作空白对照。作空白对照。6.1.6样品匀液移入平皿后，应及时将凉至样品匀液移入平皿后，应及时将凉至46平板平板计数琼脂培养基计数琼脂培养基(可放置于可放置于461恒温水浴箱中保温恒温水浴箱中保温)注入平皿约注入平皿约15mL20mL，并转动平皿使混合均匀。同，并转动平皿使混合均匀。同时将平板计数琼脂培养基倾入时将平板计数琼脂培养基倾入加有加有1.0mL空白稀释液空白稀释液的的无菌平皿内作对照。无菌平皿内作对照。6.2培养培养6.2.1琼脂凝固后，将琼脂凝固后，将平板翻转平板翻转，361培养培养箱内培养箱内培养48h2h。水产品采用水产品采用301培养培养72h3h(08新增新增)。6.2.2琼脂凝固后，如果怀疑样品中含有在琼脂琼脂凝固后，如果怀疑样品中含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在表面覆盖一培养基表面弥漫生长的菌落时，可在表面覆盖一薄层琼脂培养基（约薄层琼脂培养基（约4mL），并在报告上记录该），并在报告上记录该操作，待覆盖层凝固，翻转平板，按操作，待覆盖层凝固，翻转平板，按6.2.1条件条件进行操作进行操作 6.3菌落计数菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录相应的菌落数量和稀释倍数。菌落计数器，记录相应的菌落数量和稀释倍数。菌落计数以菌落形成单位（以菌落形成单位（colonyformingunits,CFU）表示。表示。6.3.1平板菌落数的选择平板菌落数的选择选取菌落数在选取菌落数在30CFU300CFU个之间、无个之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于低于30CFU个菌落的平板记录具体菌落数，大于个菌落的平板记录具体菌落数，大于300的可记的可记录为多不可计录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用。每个稀释度的菌落数应采用两个两个平板平均数。平板平均数。6.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个，即可计算半个平板后乘平板后乘2，代表全平板菌落数。，代表全平板菌落数。6.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，生长时，即将每条链作为一个菌落计数。如有链即将每条链作为一个菌落计数。如有链状菌落生长时状菌落生长时(菌落之间无明显界线菌落之间无明显界线)，若仅有一条，若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。则应将每条链作为一个菌落计。1、平皿分、平皿分4部分点数（见图）部分点数（见图）2、求同一、求同一稀释度的平均菌落数稀释度的平均菌落数如：如：A1数数+A2数数26.4、菌落计数方法、菌落计数方法1.若若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（毫升）中菌落总数结果。克（毫升）中菌落总数结果。（见表例（见表例1）。）。2.若若有两个连续稀释度在适宜计数范围内有两个连续稀释度在适宜计数范围内（30300个菌落）时，个菌落）时，按如下公式计算：按如下公式计算：N=C/(n1+0.1n2)d式中：式中：N样品中菌落数；样品中菌落数；C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2适宜范围菌落数的第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；适宜范围菌落数的第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）；稀释因子（第一稀释度）；7.结果的表述结果的表述7.1菌落总数的计算方法：菌落总数的计算方法：示例：示例：稀释度稀释度1:100（第一稀释度）（第一稀释度）1:1000（第二稀释度）（第二稀释度）菌落数菌落数232，24433，35N=C/(n1+0.1n2)d(232+244+33+35)/(2+0.12)10-2=544/0.022=24727上述数据经上述数据经“四舍五入四舍五入”后，表示为后，表示为25000或或2.5104。3.若所有平均菌落数均大于若所有平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表例均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表例4）。）。4.若所有稀释度的平均菌落数若所有稀释度的平均菌落数均小于均小于30，则应，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表例见表例5）5.若所有稀释度的平均菌落数若所有稀释度的平均菌落数均不在均不在30-300之间之间，其中一，其中一 部分大于部分大于300或小于或小于30时，则以最接时，则以最接近近30或或300的平均菌的平均菌 落数乘以稀释倍数报告之落数乘以稀释倍数报告之 （见表例见表例6）。）。6.若所有稀释度的菌落数均不可计数，则以若所有稀释度的菌落数均不可计数，则以最高稀释倍数无法计数最高稀释倍数无法计数 报告之（报告之（见表例见表例7）。）。菌落计数的报告菌落计数的报告:菌落数菌落数报告结果报告结果1、30300之间之间平均菌落数平均菌落数X稀释稀释倍数倍数2、在在30300之间之间(若有两个稀释度若有两个稀释度)按新公式计算按新公式计算（旧标旧标准：求比值准：求比值2取较小稀释倍数取较小稀释倍数；300最高稀释度平均菌落数最高稀释度平均菌落数X最高稀释最高稀释倍数倍数4、300或或30取最接近的取最接近的X稀释稀释倍数倍数6、无法计数无法计数报告无法计报告无法计数数稀释度选择及细菌总数报告方法（表稀释度选择及细菌总数报告方法（表7）稀释液及菌落数稀释液及菌落数 10-1 10-2 10-3 1 1,365 164 20 16，400 16，000或或1.6104 2 2,760 295 46 37，750 3.1000或或3.1103 2,890 271 60 27，100 3 不可计不可计 4，650 513 513，000 510，000或或5.1 105 4 27 11 5 270 270或或2.7 102 5 无菌落无菌落 无菌落无菌落 无菌落无菌落 1 10 10 6 不可计不可计 305 12 30，500 31，000或或3.110-3 稀释稀释 倍数倍数 平均平均 菌落菌落数数例例 次次细菌总数细菌总数(个个/g或个或个/ml)报告方式报告方式(个个/g或个或个/ml)7.2.1菌落数在菌落数在100以内时，按以内时，按“四舍五入四舍五入”方式方式修约，采用两位有效数字报告。修约，采用两位有效数字报告。7.2.2大于或等于大于或等于100时，前第时，前第3位数字采用位数字采用“四四舍五入舍五入”方式修约后，取前方式修约后，取前2位数字，后面用位数字，后面用0代替代替位数来表示结果；也可用位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，的指数形式来表示，此时也按此时也按“四舍五入四舍五入”方式修约，采用两位有效数方式修约，采用两位有效数字。字。7.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。报告菌落蔓延。7.2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效果无效。7.2.5称重取样以称重取样以CFU/g为单位报告，按体积取为单位报告，按体积取样的以样的以CFU/mL为单位报告为单位报告(表面取样以表面取样以CFU/cm2报告报告)。7.2、菌落计数的报告：、菌落计数的报告：二、食品微生物学检验二、食品微生物学检验大肠菌群计数大肠菌群计数在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。革兰氏阴性无芽胞杆菌。GB4789.3-2003GB4789.3-2010其中包括大肠杆菌、产气杆菌和一些中间其中包括大肠杆菌、产气杆菌和一些中间类型的细菌，这群细菌能在含有胆盐的培类型的细菌，这群细菌能在含有胆盐的培养基上生长。实际上包括埃希氏菌属、柠养基上生长。实际上包括埃希氏菌属、柠檬酸细菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等，檬酸细菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等，其中以埃希氏菌属为主，称为典型大肠杆其中以埃希氏菌属为主，称为典型大肠杆菌，其它三属称为非典型大肠杆菌。菌，其它三属称为非典型大肠杆菌。由于大肠菌群都是直接或间接来自人或温血动物的粪由于大肠菌群都是直接或间接来自人或温血动物的粪便，来自粪便以外的极为罕见，便，来自粪便以外的极为罕见，所以大肠菌群作为食品卫所以大肠菌群作为食品卫生标准有以下两方面的意义。生标准有以下两方面的意义。一方面，它可以作为粪便污染食品的指标菌。如果食一方面，它可以作为粪便污染食品的指标菌。如果食品中检出大肠菌群，表明该食品曾受到人或温血动物粪便品中检出大肠菌群，表明该食品曾受到人或温血动物粪便污染。如有典型大肠杆菌存在，说明该食品受到粪便近期污染。如有典型大肠杆菌存在，说明该食品受到粪便近期污染。如有非典型大肠杆菌存在，说明该食品受到粪便陈污染。如有非典型大肠杆菌存在，说明该食品受到粪便陈旧污染。旧污染。另另一一方方面面，它它可可以以作作为为肠肠道道致致病病菌菌污污染染食食品品的的指指标标菌菌。威胁食品安全性的主要是肠道致病菌。威胁食品安全性的主要是肠道致病菌。我我国国和和许许多多国国家家的的大大肠肠菌菌群群检检验验结结果果均均采采用用大大 肠肠 菌菌 群群 MPN来来 表表 示示，2003标标 准准 采采 用用 每每100ml（g）样样品品中中大大肠肠菌菌群群最最近近似似数数来来表表示示，20082010标标准准采采用用每每1mL(g)样样品品中中大大肠肠菌菌群群最最近似数表示。近似数表示。MPN值值是是按按一一定定方方案案检检验验结结果果的的统统计计数数值值，这这种种检检验验方方案案，在在我我国国GB/T4789.3-2010 中中将将过过去去的的“采采用用样样品品三三个个稀稀释释度度各各三三管管的的乳乳糖糖发发酵酵三三步法步法”修改修改“两步法两步法”。GB/T5009.3-2010 食品安全国家标准食品微食品安全国家标准食品微生物学检验生物学检验大肠菌群计数大肠菌群计数修改了标准的中英文名称；修改了标准的中英文名称；“第二法大肠菌群平板计数法第二法大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围的平板菌落数的选择范围修改为修改为“15CFU150CFU”；删除了删除了“第三法大肠菌群第三法大肠菌群PetrifilmTM测试片法测试片法”。二、二、细细细细 菌菌菌菌 学学学学 检检检检 验验验验 程序程序程序程序-大肠菌群大肠菌群大肠菌群大肠菌群GB 4789.3-2010GB 4789.3-2010GB 4789.3-2003GB 4789.3-20033.设备和材料3.1恒温培养箱：恒温培养箱：361。3.2冰箱：冰箱：25。3.3恒温水浴箱：恒温水浴箱：461。3.4天平：感量天平：感量0.1g。3.5均质器。均质器。3.6振荡器。振荡器。3.7无菌吸管：无菌吸管：1mL（具（具0.01mL刻度）、刻度）、10mL（具（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。刻度）或微量移液器及吸头。3.8无菌锥形瓶：容量无菌锥形瓶：容量500mL。3.9无菌培养皿：直径无菌培养皿：直径90mm。3.10pH计或计或pH比色管或精密比色管或精密pH试纸。试纸。3.11菌落计数器。菌落计数器。4.培养基和试剂区别：培养基区别：培养基区别：培养基区别：培养基pHpH值值值值（4.1:6.84.1:6.80.2;4.2:7.20.1;4.3:0.2;4.2:7.20.1;4.3:7.47.40.10.1；4.4:7.24.4:7.2）灭菌温度灭菌温度（121121/15min/15min）4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤：）肉汤：见附录见附录A中中A.1。4.2煌绿乳糖胆盐（煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤：）肉汤：见附录见附录A中中A.2。4.3结晶紫中性红胆盐琼脂（结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：）：见附录见附录A中中A.3。4.4磷酸盐缓冲液：见附录磷酸盐缓冲液：见附录A中中A.4。4.5无菌生理盐水：见附录无菌生理盐水：见附录A中中A.5。4.6无菌无菌1mol/LNaOH：见附录：见附录A中中A.6。4.7无菌无菌1mol/LHCl：见附录：见附录A中中A.7。6.1样品的稀释样品的稀释6.1.1固体和半固体样品：固体和半固体样品：称取称取25g样品样品,放入盛有放入盛有225mL磷酸盐缓磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min10000r/min均质均质1min2min,或放入盛有或放入盛有225mL磷酸磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打中，用拍击式均质器拍打1min2min，制成，制成1:10的样品匀液。的样品匀液。6.1.2液体样品：液体样品：以无菌吸管吸取以无菌吸管吸取25mL样品置盛有样品置盛有225mL磷酸盐缓磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成充分混匀，制成1:10的样品匀液。的样品匀液。6操作步骤操作步骤6.1.3样样品品匀匀液液的的pH值值应应在在6.57.5之之间间，必必要要时分别用时分别用1mol/LNaOH或或1mol/LHCl调节。调节。6.1.4用用1mL无无菌菌吸吸管管或或微微量量移移液液器器吸吸取取1:10样样品品匀匀液液1mL，沿沿管管壁壁缓缓缓缓注注入入9mL磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液或或生生理理盐盐水水的的无无菌菌试试管管中中（注注意意吸吸管管或或吸吸头头尖尖端端不不要要触触及及稀稀释释液液面面），振振摇摇试试管管或或换换用用1支支1mL无无菌菌吸吸管管反反复复吹吹打打，使使其其混混合合均均匀匀，制制成成1:100的样品匀液。的样品匀液。6.1.5根根据据对对样样品品污污染染状状况况的的估估计计，按按上上述述操操作作，依依次次制制成成十十倍倍递递增增系系列列稀稀释释样样品品匀匀液液。每每递递增增稀稀释释1次次，换换用用1支支1mL无无菌菌吸吸管管或或吸吸头头。从从制制备备样样品品匀匀液液至至样样品品接接种种完完毕毕，全全过过程程不不得得超超过过15min。6.2 初发酵试验每个样品，选择每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（胰蛋白胨（LST）肉汤）肉汤/乳糖胆盐发酵管乳糖胆盐发酵管，每管接种，每管接种1mL（如接种量超过如接种量超过1mL，则用双料，则用双料LST肉汤肉汤），），361培养培养24h2h，观察倒管内是否有气泡产生，观察倒管内是否有气泡产生，24h2h产产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。2003版增加版增加-分离培养分离培养:伊红美蓝琼脂平板伊红美蓝琼脂平板(361,24h2h)操作示意图操作示意图1mL1mL1mL10-110-210-310-410mL10mL10mL1mL1mL1mL1mL1mL1mL空白空白S1S21mL1mL1mL灭菌灭菌生理生理盐水盐水双料双料复发酵复发酵(BGLB/乳糖发酵管乳糖发酵管)阳性管进行阳性管进行伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂6.3 复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管/乳糖发酵管中，36 1培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6.4大肠菌群最可能数（大肠菌群最可能数（MPN）的报告）的报告 按按6.3确确证证的的大大肠肠菌菌群群LST阳阳性性管管数数，检检 索索 MPN表表（见见 附附 录录 B），报报 告告 每每g（mL）样品中大肠菌群的）样品中大肠菌群的MPN值。值。8.1样品的稀释样品的稀释按按6.1进行。进行。8.2平板计数平板计数8.2.1选取选取2个个3个适宜的连续稀释度个适宜的连续稀释度,每个稀释每个稀释度接种度接种2个无菌平皿，每皿个无菌平皿，每皿1mL。同时取。同时取1mL生生理盐水加入无菌平皿作空白对照。理盐水加入无菌平皿作空白对照。8.2.2及时将及时将15mL20mL冷至冷至46的结晶紫中的结晶紫中性红胆盐琼脂（性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加脂凝固后，再加3mL4mLVRBA覆盖平板表层。覆盖平板表层。翻转平板，置于翻转平板，置于361培养培养18h24h。8.3平板菌落数的选择平板菌落数的选择选取菌落数在选取菌落数在15CFU150CFU之间的平板，之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为环，菌落直径为0.5mm或更大。或更大。8.4证实试验证实试验从从VRBA平板上挑取平板上挑取10个不同类型的典型个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，肉汤管内，361培养培养24h48h，观察产气情况。，观察产气情况。凡凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。群阳性。8.5大肠菌群平板计数的报告大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中）样品中大肠菌群数。例：大肠菌群数。例：10-4样品稀释液样品稀释液1mL，在，在VRBA平板上平板上有有100个典型和可疑菌落，挑取其中个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种个接种BGLB肉汤肉汤管，证实有管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。）。8.6培养基和试剂培养基和试剂A.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤）肉汤A.1.1成分成分胰蛋白胨或胰酪胨胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化钠氯化钠5.0g乳糖乳糖5.0g磷酸氢二钾（磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g磷酸二氢钾（磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75g月桂基硫酸钠月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水蒸馏水1000mLpH6.80.2A.1.2制法制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。分装到有玻璃小。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管倒管的试管中，每管10mL。121高压高压灭菌灭菌15min。A.2煌绿乳糖胆盐（煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤）肉汤A.2.1成分成分蛋白胨蛋白胨10.0g乳糖乳糖10.0g牛胆粉（牛胆粉（oxgall或或oxbile）溶液）溶液200mL0.1%煌绿水溶液煌绿水溶液13.3mL蒸馏水蒸馏水800mLpH7.20.1A.2.2制法制法将蛋白胨、乳糖溶于约将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL（将（将20.0g脱水牛胆粉溶于脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节蒸馏水中，调节pH至至7.07.5），用蒸馏水稀释到），用蒸馏水稀释到975mL，调节，调节pH，再加，再加入入0.1%煌绿水溶液煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管每管10mL。121高压灭高压灭菌菌15min。A.3结晶紫中性红胆盐琼脂（结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）A.3.1成分成分蛋白胨蛋白胨7.0g酵母膏酵母膏3.0g乳糖乳糖10.0g氯化钠氯化钠5.0g胆盐或胆盐或3号胆盐号胆盐1.5g中性红中性红0.03g结晶紫结晶紫0.002g琼脂琼脂15g18g蒸馏水蒸馏水1000mLpH7.40.1A.3.2制法制法将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸。煮沸2min，将培养基冷却至，将培养基冷却至4550倾注平板。使用前临时制备，不倾注平板。使用前临时制备，不得超过得超过3h。A.5无菌生理盐水无菌生理盐水A.5.1成分成分氯化钠氯化钠8.5g蒸馏水蒸馏水1000mLA.5.2制法制法称取称取8.5氯化钠溶于氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，蒸馏水中，121高压灭菌高压灭菌15min。A.61mol/LNaOHA.6.1成分成分NaOH40.0g蒸馏水蒸馏水1000mLA.6.2制法制法称取称取40g氢氧化钠溶于氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中，蒸馏水中，121高压灭菌高压灭菌15min。A.71mol/LHClA.7.1成分成分HCl90mL蒸馏水蒸馏水1000mLA.7.2制法制法移取浓盐酸移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至，用蒸馏水稀释至1000mL，121高压灭菌高压灭菌15min。GB/T 4789.3-2003结果报告结果报告