生物芯片分类及应用

1一、一、概念、分类及应用概念、分类及应用2（一）、（一）、两两 个个 概概 念念FF生生生生物物物物芯芯芯芯片片片片 主主要要指指通通过过平平面面微微细细加加工工技技术术在在固固体体芯芯片片表表面面构构建建的的微微流流体体分分析析单单元元和和系系统统，以以实实现现对对细细胞胞、蛋蛋白白质质、核核酸酸以以及及其其它它生生物物组组分分的的准准确确、快速、大信息量的检测。快速、大信息量的检测。FF基基基基因因因因芯芯芯芯片片片片 技技术术是是通通过过微微阵阵列列技技术术,将将高高密密度度DNADNA片片段段阵阵列列通通过过高高速速机机器器人人以以一一定定的的顺顺序序或或排排列列方方式式使使其其附附着着在在如如玻玻璃璃片片等等固固相相表表面面，以以荧荧光光标标记记的的DNADNA探探针针，借借助助碱碱基基互互补补杂杂交交原原理理，进进行行大大量量的的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。3微阵列芯片（Microarray）微型实验室芯片(Lab-on-a-chip)液体芯片(Liquichip)（二）、生物芯片分类及应用（二）、生物芯片分类及应用4Lab-on-a-chip 微型实验室芯片是通过在芯片上刻微型实验室芯片是通过在芯片上刻成微流路径从而将涉及生物检测的主要成微流路径从而将涉及生物检测的主要步骤步骤样品准备样品准备/生化反应生化反应/结果检测结果检测整合在一张芯片上。整合在一张芯片上。567Liquichip Bead,Capture molecule,Analyte,Reporter molecule是构成liquichip 的4个主要部分。Bead上带有两种荧光，根据这两种荧光的比例可以 将bead分为多种。目前已有48种，正在开发中。Capture molecule:作用相当于探针，能特异性的与被检测物结合。Analyte:样品中被检测的成分。Reporter molecule:带有荧光的报告分子，能特异性的与被检测物结合。8Liquichip反应的一般步骤：反应的一般步骤：capture molecule 结合在bead 上，bead与样品反应。Capture molecule 可以与相应的 analyte 特异性的结合，3.此时再加入荧光标记的，特异结合analyte的reporter molecule。4.检测：用liquichip workstation 进行检测。原理是同时对bead和reporter molecule 上的荧光进行检测。从而确定被结合的analyte的种类和数量。9Liquichip技术特点描述技术特点描述1基于bead的这种固相反应技术，具有 灵敏度高、信号强度高、灵活性好、所需样品量少的特点。2与传统的蛋白芯片相比，有两大优势，反应速度更快，灵活性更好。3由于检测方法的特点，在大部分的实验过程中，都不需要洗脱步骤，省时，且不会破坏反应的动态平衡。4有配套的蛋白表达和纯化体系。（his-tag）10Lquichip应应 用用 领领 域：域：蛋白质定量蛋白质定量蛋白质功能研究蛋白质功能研究蛋白表达谱分析。蛋白表达谱分析。蛋蛋白白质质与与蛋蛋白白质质、蛋蛋白白质质与与核核酸酸相相互互作作用用的的研研究究。包括：免疫分析、酶分析、受体-配基分析、蛋白质核酸相互作用分析分析。11微阵列芯片蛋白芯片基因芯片 12蛋白芯片蛋白芯片(Protein Chips)高通量微阵列蛋白分析方法高通量微阵列蛋白分析方法高通量微阵列蛋白分析方法高通量微阵列蛋白分析方法 利用抗体抗原结合原理，采用化学发光或荧利用抗体抗原结合原理，采用化学发光或荧光检测光检测 标记抗体或抗原，来检测抗原或抗体。标记抗体或抗原，来检测抗原或抗体。13蛋白芯片应用蛋白芯片应用FF免疫学分析免疫学分析 FF蛋白与蛋白之间相互作用蛋白与蛋白之间相互作用 FFDNADNA与蛋白质分子相互作用与蛋白质分子相互作用14基因芯片基因芯片是通过微阵列技术,将高密度DNA片段阵列通过高速机器人以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。微阵列技术巨大优势在于它可以并行地宏量获取生物信息，借助此技术发展的生物芯片则提供了以核酸杂交为基础的基因水平的表达监控，多态性研究和基因分型。从而使我们对基因表达调控有更深入的了解。15基因芯片发展历史基因芯片发展历史Southern&Northern Southern&Northern BlotBlotDot Dot BlotBlotMacroarrayMacroarrayMicroarrayMicroarray16基因芯片 按内涵划分：按内涵划分：cDNAcDNA芯片芯片 OligoOligo芯片芯片:25:25mer(affymetrix),mer(affymetrix),70mer(Operon)70mer(Operon)，80mer 80mer（ClontechClontech）,按功能划分：按功能划分：基因组芯片：基因组芯片：检测某一基因是否存在，若检测某一基因是否存在，若检测某一基因是否存在，若检测某一基因是否存在，若 存在，拷贝数是多少。探针是存在，拷贝数是多少。探针是存在，拷贝数是多少。探针是存在，拷贝数是多少。探针是DNA.DNA.DNA.DNA.表达谱芯片表达谱芯片：确定基因表达的途径与表达产确定基因表达的途径与表达产确定基因表达的途径与表达产确定基因表达的途径与表达产 物。探针是物。探针是物。探针是物。探针是RNARNARNARNA或或或或cDNAcDNAcDNAcDNA 测序芯片测序芯片：通过探针与微阵列的配对分析获通过探针与微阵列的配对分析获 得探针的序列结果。得探针的序列结果。17基因芯片应用基因芯片应用H基因表达检测基因表达检测H多态性分析多态性分析H遗传图谱定位遗传图谱定位H基因分型基因分型H通过杂交反应测定序列通过杂交反应测定序列18基因芯片应用领域基因芯片应用领域FF遗传疾病研究遗传疾病研究*癌症癌症癌症癌症*家系遗传疾病家系遗传疾病家系遗传疾病家系遗传疾病*普通基因突变疾病普通基因突变疾病普通基因突变疾病普通基因突变疾病FF感染性疾病感染性疾病FF药物筛选药物筛选FF动物植物遗传筛选育种动物植物遗传筛选育种 FF个人基因身份证个人基因身份证FF环境监测环境监测19（三）、生物芯片应用优势（三）、生物芯片应用优势F高通量平行分析样品高通量平行分析样品F自动化程度高省时省力自动化程度高省时省力F所需样品试剂少保护环境所需样品试剂少保护环境F成本低成本低20生物芯片应用优势生物芯片应用优势生物信息数据累积生物信息数据累积F为生物信息公共数据库添加更多数据为生物信息公共数据库添加更多数据F有利于研究基因序列与生物表型之间的关系有利于研究基因序列与生物表型之间的关系F有助于理解疾病发生的机制有助于理解疾病发生的机制21二、二、生物芯片制作技术介绍生物芯片制作技术介绍22生物芯片制作方法分类生物芯片制作方法分类23 原位合成原位合成 (In Situ Synthesis)In Situ Synthesis)化学合成化学合成原子印章原子印章原位光刻合成原位光刻合成24原位光刻合成原位光刻合成 美国著名的Affymetrix公司率先开发的寡聚核苷酸原位光刻专利技术，是生产高密度寡核苷酸基因芯片的核心关键技术。25 原位光刻合成原理Light directed oligonucleotide synthesis.A solid support is derivatized with a covalent linker molecule terminated with a photolabile protecting group.Light is directed through a mask to deprotect and activate selected sites,and protected nucleotides couple to the activated sites.The process is repeated,activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to be constructed at each site.26预先合成后点样(off-chip synthesis)接触式点样非接触式点样27基因芯片点样的方式接触式点样-适合于DNA芯片的制作 即点样针直接与固相支持物表面接触，将DNA样品留在固相支持物上28接触式点样Best!Best!29ArrayIt ChipMaker Pins带有细槽的不锈钢针尖载样能力:200 to 600 nL点样体积:250 pL to 2.5 nL(pin size)点样直径:100 m to 500 m(pin size)1.Dippingofpinforsamplepickup2.Touchingofslidewithpintoleavespot3.Controlprintvolumewithpinsize30Stealth and Chipmaker Pin(TeleChem)31Chipmaker 点样技术32Stealth Pins33CatalogNumberSpot Diameter(m)Uptake volume (l)Delivery Volume(nl)Minimum spot spacing(m)Maximum subgrid per pin(spots)Density(spots/cm2)Maximum numberOf spots(18mm72mm)SMP390-1000.250.612036*366,35082,944SMP4120-1300.251.016028*283,84250,176SMP5150-1600.251.320022*222,37230,967SMP6180-1900.251.524018*181,58820,736SMP7200-2200.271.726016*161,25416,384SMP8210-2300.281.827516*161,25416,384SMP9260-2900.282.034012*127069,216SMP10300-3300.292.340010*104906,40034TeleChem公司点样针技术公司点样针技术不断发展的专利针技术不断发展的专利针技术不断发展的专利针技术不断发展的专利针技术共有共有共有共有3030种针供选择种针供选择种针供选择种针供选择与斯坦福大学共同发展与斯坦福大学共同发展专利专利 pin,带样带样稳定，样品利用率高稳定，样品利用率高单次带样可连续点样达单次带样可连续点样达200-1500次次特殊不锈钢材料，适用于各种溶液特殊不锈钢材料，适用于各种溶液实际点样直径实际点样直径75-250um,可根据不同样品选择可根据不同样品选择相应相应pin相当容易更换相当容易更换pin和和pin head以以适应不同需要适应不同需要35基因芯片点样的方式非接触式点样-适合于蛋白芯片的制作 它是以电磁阀或压电原理将样品直接喷至固相支持物表面36非接触式喷点技术ThermalSolenoid螺线管螺线管PiezoelectricDP37Synquad：通过高分辨率注射器泵和微螺线管阀门有机结合起来精确控通过高分辨率注射器泵和微螺线管阀门有机结合起来精确控制滴液制滴液 Piezoelectric：用压电晶体将液体从孔中喷出的压电技术，用压电晶体将液体从孔中喷出的压电技术，两个压电晶两个压电晶体同时加脉冲通电触发这两个压电晶体往喷管中间变形挤压喷管侧壁，体同时加脉冲通电触发这两个压电晶体往喷管中间变形挤压喷管侧壁，喷管出现收缩压迫液体从喷嘴喷出。喷管出现收缩压迫液体从喷嘴喷出。DP38非接触式点样：synQUAD Technology39Aspirate and Print for Making Arrays40Characteristics of synQUAD TechnologyWide dispense rangeLow nanoliter to high microliterExcellent linearityPrecise and accurateCVs typically less than 10%Precision less than 5%Non-contact dispense mechanismEasier mechanical alignment(384,1536,)“On-the-fly”printing possibleCapable of dispensing onto membranes or slidesMultiple liquid handling modesAspirate/DispenseContinuous Reagent Dispensing41synQUAD vs Piezoelectric PrintingsynQUAD/nQUADl Patented by Cartesian l Uses commercially available componentsl Robust and reliable delivery mechanisml Low nanoliter to low microliter dispense volume l maximum density:200 to 400 spots/cm2 Piezoelectric Abbott holds key patents on technology Dispense susceptible to air bubbles Mid-picoliter dispense volume 2500 spots/cm242三、三、生物芯片检测系统生物芯片检测系统CCD扫描仪 非共聚焦激光扫描仪激光共聚焦扫描仪43数值孔径与采光效率NA=sin(),where is the angle of the cone44激光共聚焦（聚焦）激光共聚焦（聚焦）FThe fluorescence source is at the objective lens focusFLight goes through the pinhole to the detector45激光共聚焦（非聚焦）激光共聚焦（非聚焦）FFluorescence source below focus(e.g.out of focus)FOut of focus light is mostly blocked at the pinhole46Confocal Artifact RejectionNo Pinhole With PinholeDust artifacts reduced by at least a factor of 1047CCD Camera SystemslAdvantages:lFew moving partslFast scanning of bright sampleslDisadvantages:lNA limited to about 0.40:Less appropriate for dim sampleslOptical scatter can limit performancelNeed to“stitch”together large imagesConfocal Laser ScannerslAdvantageslSmall depth of focus reduces artifactslhigh light collection efficiency.l PMT detectors have the highest sensitivity in the visible range48DNAscope LM+激光共聚焦芯片扫描仪激光共聚焦芯片扫描仪49xxyzxMACROscopeFilters50How the Scan System WorksF-thetaTelecentricScanSystemSampleScanning MirrorLaser Scan LensBAC51How to scan a whole sampleHome SensorScanning MirrorSampleLaser Scan Lens52DNAscope LM+优点优点 共聚焦面积宽共聚焦面积宽:20mm 70mm可以扫描多种介质可以扫描多种介质(Images both Glass Slide Microarrays and CLONDIAG AT tubes)背景噪声低，信噪比高背景噪声低，信噪比高全自动成像，分析结果全自动成像，分析结果 Small footprint(W20cm x L30cm x H20cm)53Imaging Arrays Both Dry&WetDryPBSbufferCy3 Cy5Cy3 and Cy5 labeled protein dotted on glass substrate and imaged at 5 micron resolution in both dry and wet formats54Tube1Tube2Cy3 Images of two Clondiag Array Tubes 55四、生物芯片技术思路的比较56Comparison of DNA Chip Technologies Sensitivity of DNA chip based assays is a function of:*Probe and target DNA/RNA(Complexity)*Chip surface(autofluorescence&non-spec.bkg)*Attachment chemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)*Hybridization efficiency(lots of factors)*Detection technology(signal type,efficiency,noise)Oligo-ChipOligo-Chip cDNA-Chip cDNA-Chip Genomic Chip Genomic Chip 20n or 80 n 50,000 n 20n or 80 n 50,000 nsequencingsequencingexpressionexpressionexpressionexpressiongenomic analysisgenomic analysis57cDNA芯片的缺点由于不同的基因长短不同，Tm值各异，成千上万的基因在同一张芯片上杂交，使得杂交条件很难同一。同一个体中总是存在一些基因家族的同源序列，加上有的物种存在基因重叠序列的相互干扰，使得传统的cDNA芯片的分辨能力受到限制，结果的准确性也受到影响。有些组织中在DNA双链中的无意义链中存在重叠的基因；而且不同RNA的剪切方式等基因表达方式很难用cDNA芯片来区分。PCR产物是结合稳定的DNA双链，加入探针后在杂交中必然存在竞争性抑制，影响探针和模板的结合能力和稳定性，进一步影响cDNA芯片的分辨能力和结果的可信度，这对于低丰度的基因影响尤为明显。PCR产物浓度不均一也可能导致错误的结论。58寡核苷酸芯片比cDNA芯片的优点 探针序列经过系统优化，减少非特异杂交，能有效区分有同源序列的基因；减少二级结构 及其对杂交结果的影响杂交温度均一，提高杂交效率；合成产物浓度均一，避免因样品浓度差异而造成点样量差异；可以设计检测不同剪切方式的基因；无需扩增，防止扩增失败影响实验。59预合成后点样系统的综合成本cDNA芯片方法/步骤 试剂/仪器（万）人员（人）耗时（月）构建或购买基因文库 1-31-2 3-6 PCR引物设计与合成 55-65万（2000个片段）1 3PCR产物纯化及定量 1.2/20（2000个片段1 2点样 点样仪60万 1 3天 杂交 0.3万试剂 1 2扫描 扫描仪60万 1 1-2合计 197.5 209.56-7 11-15 60预合成后点样系统的综合成本自己合成寡聚核苷酸芯片方法方法/步步骤试剂/仪器（万）器（万）人人员（人）（人）耗耗时（月）（月）寡聚核苷酸的筛选及合成(2000个基因)200（每个基因用1个70碱基的寡核苷酸片段代替，合成1个碱基14元人民币计）。1(寡核苷酸片段的筛选，还需专业的软件)3-4个月，如购 置 DNA合成仪，成本？，但时间较长点样点样仪60万11个月 杂交0.3万试剂12个月扫描扫描仪60万11-2个月总计320.3万47-961预合成后点样系统的综合成本应用Operon探针寡聚核苷酸芯片方法/步骤试剂/仪器（万）人员（人）耗时（月）探针100点样60（点样仪）1 1 杂交0.3（试剂）1 2扫描60（扫描仪）1 1-2总计220.334-562Affymetrix技术平台综合成本芯片万杂交小时洗涤小时扫描分钟合计220万小时63总结采用Affymetrix公司的生物芯片系统平台比较适合于实力雄厚的科研实验室，可以在最短的时间内尽快获得精确可靠的并且可能是前人未曾获得的实验结果，并可在国际权威杂志上获发表，尽快在相关研究领域在国际领域占领一席之地。64总结采用合成后点样的生物芯片平台比较适合于目标定位于研研发发、生生产产的实实验验室室及及生生物物公公司司。虽然购买芯片点样扫描系统的经费看起来比购买Affymetrix系统的费用要低，研发的方向可以结合实验室的研究特点，比比较较灵灵活活，但前期研究需要投入较大的人力、物力和时间，综合成本并不低，而且获得的芯芯片片信信息息量量小小，可可靠靠性性较较低低，使用该系统生产的芯片为材料进行的研究一般为验证性工作，且因为材料的可靠性低，很难在国际权威杂志上获得认可。目前开发生产的生物芯片尚无获得医疗许可的产品。65五、五、生物芯片制作所需耗材生物芯片制作所需耗材66 Microarraying Accessories（芯片配件）（芯片配件）Pins and PrintheadsOmniGrid Slides and ReagentsOmniGrid Epoxy(环氧基修饰环氧基修饰)OmniGrid Amine(氨基修饰氨基修饰)OmniGrid Aldehyde(醛基修饰醛基修饰)Complete line of associated reagentsHybridization ChambersHybChamberHybChamber Mica67Slides:EpoxyAldehydeAmineBuffers:SpottingBlockingHybridizationOmniGrid Slides&Reagents芯片研究片基和试剂芯片研究片基和试剂68Substrates膜：膜：FS&S NC膜及膜及Supercharge尼龙膜尼龙膜玻璃片：玻璃片：FS&S FASTFCEL 醛基化、氨基化玻片醛基化、氨基化玻片FDAKO玻片玻片FTelechem SuperClean/SuperAmine/SuperAldehyde69Hybridization Cassete1.Telechem2.Clontech Plastic Hybridization CassetePlastic Hybridization Cassete70Wash Station71基因公司芯片系统客户生物芯片北京国家工程研究中心生物芯片上海国家工程研究中心东南大学吴建雄实验室湖州数康科技公司复旦张江生物医药有限公司联合基因集团西北大学基因芯片中心中国疾病控制中心病毒所浙江大学生命科学院华大基因组学研究中心北京军事医学科学院二所成都百奥生物信息科技有限公司第一军医大学分子生物学研究所宁波瑞星生物科技有限公司山东省医科院生物医药技术室上海博道公司上海数康公司湖州数康科技公司江南科技公司南京市妇幼保健医院中科院上海冶金研究所中科院生化细胞所中科院微系统与信息技术研究院南京农业大学香港科技大学生物工程系香港中文大学威尔斯亲王医院香港浸会大学生物系香港大学医学院玛丽医院香港中文大学生物系72完善的售后服务体系基因公司在全国各主要地区设有7处维修站，其中直接为生物芯片设备提供维护、维修服务的工程师有4人，主要集中在上海和北京。这些工程师都具有多年的生物芯片相关设备的安装、调试、维护、维修经验。上海晶泰生物技术有限公司作为基因有限公司的全资子公司，该公司的生物芯片实验室拥有目前国内领先的生物芯片点样、扫描设备，以及相关的如杂交炉、洗涤工作站等全套的实验设备。同时，公司目前拥有生物芯片领域的大量专业技术人才，目前，生物芯片实验室拥有本科以上20人，硕士5人、博士5人。该公司对外提供涉及生物芯片领域的各项商业服务：点样、扫描、芯片设计制作等全方位的服务。73谢谢各位老师谢谢各位老师！