核酸分离纯化-经典版

核酸分离纯化核酸分离纯化-经典版经典版核酸核酸（nucleicacid）是遗传信息的携带者，是基因是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。概 述一、核酸分离、纯化原则一、核酸分离、纯化原则（一）保持核酸分子一级结构的完整性（一）保持核酸分子一级结构的完整性1.1.意意义义：遗遗传传信信息息全全部部储储存存在在一一级级结结构构之之中中，核核酸酸的的级级结结构构还还决决定定其其高高级级结结构构的的形形式式以以及及和和其其他他生生物物大大分子结合的方式。分子结合的方式。2.2.实验过程中，应注意以下条件及要求：实验过程中，应注意以下条件及要求：1 1）减少化学因素对核酸的降解）减少化学因素对核酸的降解:pH4-10:pH4-102 2）减少物理因素对核酸的机械剪切力：）减少物理因素对核酸的机械剪切力：0-40-4 C C 强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，反复冻强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，反复冻贮等造成的机械剪切力等条件都能明显破坏大分子量的线性贮等造成的机械剪切力等条件都能明显破坏大分子量的线性DNADNA分子，对于分子量小的环状质粒分子，对于分子量小的环状质粒DNADNA及及RNARNA分子，威胁相对小一分子，威胁相对小一些；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破些；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在在0 044的条件下进行。的条件下进行。（一）保持核酸分子一级结构的完整性（一）保持核酸分子一级结构的完整性3 3）抑制）抑制DNaseDNase或或RNaseRNase的活性：的活性：所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。制剂。4 4）简化步骤，缩短时间，减少破坏。）简化步骤，缩短时间，减少破坏。（一）保持核酸分子一级结构的完整性（一）保持核酸分子一级结构的完整性3.DNA3.DNA酶抑制剂酶抑制剂(1(1）金属离子螯合剂：）金属离子螯合剂：DNADNA酶需要金属二价离子酶需要金属二价离子MgMg2+2+、CaCa2+2+的激活，因此使用金属二价离的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制子螯合剂，可抑制DNADNA酶活性。如酶活性。如EDTAEDTA、柠檬酸盐络合、柠檬酸盐络合MgMg2+2+、CaCa2+2+等离子。等离子。(2(2）阴离于型表面活性剂：）阴离于型表面活性剂：如如SDSSDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。沉淀。（一）保持核酸分子一级结构的完整性（一）保持核酸分子一级结构的完整性4.RNA4.RNA酶（酶（RNAase)RNAase)抑制剂抑制剂RNAaseRNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是RNARNA提取过程中提取过程中的主要危害因素。的主要危害因素。(1)(1)皂土（皂土（bentonite bentonite）作用机制：皂土带负电荷，能吸附作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNaseRNase，使其失活。，使其失活。（一）保持核酸分子一级结构的完整性（一）保持核酸分子一级结构的完整性(2)DEPC(2)DEPC(二乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：作用机制：与蛋白质中与蛋白质中HisHis结合使蛋白变性。结合使蛋白变性。使用注意：使用注意：DEPCDEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大质变性的浓度大10010010001000倍。倍。容易降解，保存在容易降解，保存在44或液氮中；或液氮中；提提RNARNA时，时，0.1%DEPC0.1%DEPC浸泡器皿浸泡器皿37 2 h37 2 h。剧毒。剧毒。（一）保持核酸分子一级结构的完整性（一）保持核酸分子一级结构的完整性4.RNA4.RNA酶（酶（RNAase)RNAase)抑制剂抑制剂（3)3)肝素肝素（4 4）复合硅酸盐（）复合硅酸盐（Macaloid)Macaloid)（5 5）RNaseRNase阻抑蛋白（阻抑蛋白（RNasinRNasin）（6 6）氧钒核糖核苷复合物）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside(Vanadyl-Ribonucleoside Complex,VRC)Complex,VRC)4.RNA4.RNA酶（酶（RNAase)RNAase)抑制剂抑制剂（一）保持核酸分子一级结构的完整性（一）保持核酸分子一级结构的完整性一、核酸分离、纯化原则一、核酸分离、纯化原则(二二)尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度纯纯化化的的核核酸酸样样品品不不应应存存在在对对酶酶有有抑抑制制作作用用的的有有机机溶溶剂剂或或过过高高浓浓度度的的金金属属离离子子，蛋蛋白白质质、脂脂类类、多多糖糖分分子子的的污污染染应应降降低低到到最最低低程程度度；无无其其它它核核酸酸分分子子的的污污染染，如如提提DNADNA分子时，应去除分子时，应去除RNARNA分子。分子。破碎组织细胞破碎组织细胞提取提取纯化纯化I.I.材料与方法的选择材料与方法的选择II.II.破碎细胞或包膜破碎细胞或包膜核酸的释放核酸的释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.核酸的浓缩、沉淀、洗涤核酸的浓缩、沉淀、洗涤,并去除杂质并去除杂质V.V.核酸的鉴定与保存核酸的鉴定与保存二、分离提取核酸的主要步骤二、分离提取核酸的主要步骤临床常见的标本有临床常见的标本有血液血液、尿液尿液、唾液唾液、组织组织及及体外培养的细体外培养的细胞胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据实验的目的来确定。实验的目的来确定。不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。要求。p需考虑制备核酸所需的时间与成本：简便快速、安全、经济；需考虑制备核酸所需的时间与成本：简便快速、安全、经济；p应选择安全的试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符应选择安全的试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符合实验要求。合实验要求。（一）材料与方法的选择（一）材料与方法的选择临床常见的标本有临床常见的标本有血液血液、尿液尿液、唾液唾液、组织组织及及体外培养的细体外培养的细胞胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据实验的目的来确定。实验的目的来确定。不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。要求。p需考虑制备核酸所需的时间与成本：简便快速、安全、经济；需考虑制备核酸所需的时间与成本：简便快速、安全、经济；p应选择安全的试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符应选择安全的试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符合实验要求。合实验要求。（一）材料与方法的选择（一）材料与方法的选择DNADNA和和RNARNA均均位位于于细细胞胞内内（病病毒毒除除外外），因因此此核核酸酸分分离离与与纯纯化化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。的第一步即是裂解细胞、释放核酸。（二）细胞的破碎（二）细胞的破碎核酸的释放核酸的释放破碎细胞的方法有三种：破碎细胞的方法有三种：v机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；v化学试剂法：化学试剂法：用用SDSSDS处理细胞，处理细胞，SDSSDS可溶解细胞膜、可溶解细胞膜、核膜，去除脂质和蛋白质，并使组织蛋白与核膜，去除脂质和蛋白质，并使组织蛋白与DNADNA分离；分离；v酶解法：酶解法：加入溶菌酶或蛋白酶，都可使细胞膜破加入溶菌酶或蛋白酶，都可使细胞膜破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸分离。促进核酸分离。（二）细胞的破碎（二）细胞的破碎核酸的释放核酸的释放注意：注意：1.1.细胞破碎方法中机械剪切法不能用于基因组细胞破碎方法中机械剪切法不能用于基因组DNADNA的的提取；提取；2.2.非机械法常用化学试剂或酶细胞溶解法。非机械法常用化学试剂或酶细胞溶解法。（二）细胞的破碎（二）细胞的破碎核酸的释放核酸的释放细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物，核酸分子细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物，核酸分子本身可能仍与蛋白质结合在一起。本身可能仍与蛋白质结合在一起。核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸核酸与碱性蛋白的结合与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。、氢键和非极性的范德华力。分离核酸分离核酸最困难最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。开，同时避免核酸降解。（三）核酸的分离纯化（三）核酸的分离纯化 应该清除的杂质主要包括应该清除的杂质主要包括:1.1.非核酸的大分子污染物非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖及脂类物质等大分子物质蛋白质、多糖及脂类物质等大分子物质 2.2.非目的的核酸分子非目的的核酸分子 分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.3.加入的有机溶剂和某些金属离子加入的有机溶剂和某些金属离子（三）核酸的分离纯化（三）核酸的分离纯化1.1.加入浓盐溶液（如加入浓盐溶液（如NaClNaCl）RNARNA核蛋白和核蛋白和DNADNA核蛋白在不同浓度氯化钠溶液中的溶解度有核蛋白在不同浓度氯化钠溶液中的溶解度有显著区别。显著区别。DNADNA核蛋白在核蛋白在0.14mol/L 0.14mol/L 氯化钠中溶解度低，但在氯化钠中溶解度低，但在12mol/L12mol/L氯化钠中溶解度高；氯化钠中溶解度高；RNARNA核蛋白在核蛋白在0.14 mol/L0.14 mol/L氯化钠中溶解度氯化钠中溶解度仍有相当大的溶解度。调节氯化钠浓度，可使仍有相当大的溶解度。调节氯化钠浓度，可使RNARNA核蛋白和核蛋白和DNADNA核蛋白分步提取开来。核蛋白分步提取开来。核酸核酸-蛋白质加入蛋白质加入NaClNaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；白解聚；核酸分离纯化的基本方法核酸分离纯化的基本方法2.2.加入加入SDSSDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；核酸分离纯化的基本方法核酸分离纯化的基本方法3.3.酚酚/氯仿抽提氯仿抽提细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚氯仿异戊醇混合液，混匀后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。在含核酸的水相中加入醋酸钾或醋酸钠，形成核酸盐，核酸盐可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核酸可以用70%乙醇洗涤以除去多余的盐分，即可获得一定纯度的核酸。核酸分离纯化的基本方法核酸分离纯化的基本方法酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。核酸分离纯化的基本方法核酸分离纯化的基本方法 (1 (1）使用注意）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。(2(2）安全操作）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。使用酚时应注意使用酚时应注意核酸分离纯化的基本方法核酸分离纯化的基本方法 沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度，提高样品浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤v沉淀的方法：沉淀的方法：p常用的常用的盐类盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁。氯化镁。p常用的常用的有机溶剂有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇乙醇、异丙醇和聚乙二醇v洗涤：洗涤：核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%70%75%75%的乙醇的乙醇洗涤洗涤去除。去除。（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤当核酸溶液的当核酸溶液的pHpH值大于值大于4 4时，核酸时，核酸分子呈多聚阴离子状态，它与一价分子呈多聚阴离子状态，它与一价或二价阳离子形成的盐在许多有机或二价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中不溶解，也不会被有机溶剂溶剂中不溶解，也不会被有机溶剂变性。变性。DNADNA不溶于乙醇等有机溶剂，不溶于乙醇等有机溶剂，因此可以通过乙醇沉淀来纯因此可以通过乙醇沉淀来纯化和浓缩化和浓缩DNADNA。核酸沉淀的温度和时间核酸沉淀的温度和时间 一一般般强强调调，核核酸酸沉沉淀淀在在低低温温长长时时间间下下进进行行。低低温温长长时时间间沉沉淀淀，易易导导致致盐盐与与DNADNA共共沉沉淀淀，影影响响以以后后的的实实验验。一一般般使使用用00冰冰水水，10-15min10-15min，DNA DNA样品足可达到实验要求。样品足可达到实验要求。（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤1.核酸的鉴定核酸的鉴定浓度鉴定浓度鉴定纯度鉴定纯度鉴定完整性鉴定完整性鉴定（五）核酸的鉴定与保存（五）核酸的鉴定与保存紫紫外外分分光光光光度度法法：核核酸酸分分子子中中的的碱碱基基具具有有共共轭轭双双键键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm260nm。p前前提提：核核酸酸样样品品要要较较纯纯，无无显显著著蛋蛋白白质质、酚酚、琼琼脂脂糖糖及及其其他他核酸污染。测定浓度应大于核酸污染。测定浓度应大于0.25g/ml 0.25g/ml。p结结论论：在在波波长长260nm260nm紫紫外外光光下下，1OD1OD值值的的吸吸光光度度相相当当于于双双链链DNADNA浓度为浓度为50g/ml50g/ml；单链；单链DNADNA为为37 g/ml37 g/ml；RNARNA为为40 ug/ml40 ug/ml。浓度鉴定浓度鉴定（五）核酸的鉴定与保存（五）核酸的鉴定与保存荧光光度法：荧光光度法：核酸的荧光染料核酸的荧光染料溴化乙锭溴化乙锭嵌入碱基平面后，本嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在身无荧光的核酸在UV UV 激发下发出红色荧光。荧光强度的强激发下发出红色荧光。荧光强度的强度与溶液中核酸的含量呈正比。度与溶液中核酸的含量呈正比。使用一系列已知的不同浓度使用一系列已知的不同浓度DNADNA溶液作标准对照，可比较出被测溶液作标准对照，可比较出被测DNADNA溶液浓度。溶液浓度。注意：注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。此法的比较主要基于目测，是估计水平。（五）核酸的鉴定与保存（五）核酸的鉴定与保存EBEB与与DNADNA的结合的结合浓度鉴定浓度鉴定 紫外分光光度法：紫外分光光度法：主主要要通通过过A A260260与与A A280280的的比比值值来来判判定定有有无无蛋蛋白白质质的的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。纯度鉴定纯度鉴定（五）核酸的鉴定与保存（五）核酸的鉴定与保存纯度鉴定纯度鉴定（五）核酸的鉴定与保存（五）核酸的鉴定与保存判断核酸样品的纯度：判断核酸样品的纯度：DNA DNA纯品纯品:ODOD260260/OD/OD280 280=1.8=1.8 RNA RNA纯品纯品:OD OD260260/OD/OD280 280=2.0=2.0比值降低：蛋白质污染（比值降低：蛋白质污染（280280）、酚污染（）、酚污染（270270）比值升高：比值升高：DNADNA变性、变性、RNARNA污染污染混合污染：比值正常混合污染：比值正常荧光光度法：荧光光度法：EBEB等等荧荧光光染染料料示示踪踪的的核核酸酸电电泳泳可可判判定定核核酸酸制制品品的的纯度。纯度。（五）核酸的鉴定与保存（五）核酸的鉴定与保存纯度鉴定纯度鉴定琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：v以以EBEB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性；为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性；v根据电泳条带的数目、位置和形状判定，根据电泳条带的数目、位置和形状判定，RNARNA分子可以分子可以通过荧光强度强弱来判定有无降解。通过荧光强度强弱来判定有无降解。v基因组基因组DNADNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状。如果发生降解，电泳图呈拖尾状。完整性鉴定完整性鉴定（五）核酸的鉴定与保存（五）核酸的鉴定与保存DNADNA的降解的降解（五）核酸的鉴定与保存（五）核酸的鉴定与保存 完完整整的的或或降降解解很很少少的的总总RNARNA电电泳泳图图谱谱中中，原原核核生生物物5S5S、16S16S、23S23S三三条条带带；真真核核生生物物：5S5S和和5.8S5.8S、18S18S、28S28S三三条条带带；而而且且三三条条带带荧荧光光强强度度应应呈呈特特定定的的比值。比值。v沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高v沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低 （五）核酸的鉴定与保存（五）核酸的鉴定与保存 完整性鉴定完整性鉴定v28S28S（或或23S23S）RNARNA的的荧荧光光强强度度一一般般约约为为18S18S（或或16S16S）RNARNA的的2 2倍倍，否则提示有否则提示有RNARNA的降解；的降解；v若若在在点点样样孔孔附附近近有有着着色色条条带带，提提示示可可能能存存在在DNADNA的污染。的污染。（五）核酸的鉴定与保存（五）核酸的鉴定与保存核酸保存的主要条件是温度和介质核酸保存的主要条件是温度和介质温度：温度：4样品经常使用样品经常使用-70是长期保存的良好温度，为一次性保存是长期保存的良好温度，为一次性保存-20保存保存,避免反复冻融避免反复冻融保存介质：保存介质：灭菌水灭菌水TE缓冲溶液缓冲溶液(最常用最常用)：10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0（五）核酸的鉴定与保存（五）核酸的鉴定与保存2.核酸的保存核酸的保存DNA的保存的保存DNADNA样样品品溶溶于于pH8.0pH8.0的的TETE缓缓冲冲液液中中，44或或-20-20保保存存，-70-70冰箱可保存数年。冰箱可保存数年。TETE的的pHpH为为8.08.0时时，DNADNA的的脱脱氨氨反反应应减减少少，pHpH低低7.07.0时时DNADNA易变性易变性长期保存样品中可加入长期保存样品中可加入1 1滴氯仿。滴氯仿。（五）核酸的鉴定与保存（五）核酸的鉴定与保存2.核酸的保存核酸的保存DNA的保存的保存RNARNA样品溶于样品溶于0.3 mol/L NaAc(pH5.2)0.3 mol/L NaAc(pH5.2)或双蒸灭菌或双蒸灭菌水中，水中，-70-70保存保存长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;在在RNARNA溶液中，加溶液中，加1 1滴滴0.2 mol/L VRC(0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷氧钒核糖核苷复合物复合物)冻贮于冻贮于-70,-70,可保存数年。可保存数年。（五）核酸的鉴定与保存（五）核酸的鉴定与保存2.核酸的保存核酸的保存RNA的保存的保存A：测：测DNA：纯的纯的DNA样品样品OD260/OD280应为应为1.8，OD260mOD230应大于应大于2.0。1)OD260/OD280大于大于1.9时，表明有时，表明有RNA污染。污染。2)小于小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD230小于小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：注：可能可能出现既含蛋白质又含出现既含蛋白质又含RNA的的DNA溶液比值为溶液比值为1.8的情况。的情况。测定结果分析测定结果分析B：测：测RNA 纯的纯的RNARNA样品其样品其OD260OD260OD280OD280应介于应介于1.7-2.01.7-2.0之间，之间，OD260/OD230OD260/OD230比值应大于比值应大于2.02.0。1 1）若）若RNARNA样品样品OD260/OD280OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；2 2）比值大于）比值大于2.02.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；时，可能被异硫氰酸胍等污染；3 3）OD260/OD230OD260/OD230比值小于比值小于2.02.0时表明有小分子及盐存在。时表明有小分子及盐存在。