扫描电镜生物样品制备技术

第五章第五章 扫描电镜生物样扫描电镜生物样品制备技术品制备技术第一节第一节 常规常规生物样品生物样品SEM制备技术制备技术Features of SEM高分辨率高分辨率Features of SEM强立体感强立体感Features of SEM广泛的放大倍率广泛的放大倍率Features of SEM应用范围广应用范围广生物、医学、动物、材料、生物、医学、动物、材料、化学、化学、物理、地质、冶金、矿物、污泥物理、地质、冶金、矿物、污泥(杆菌杆菌)、机械、电机及导电性样、机械、电机及导电性样品如半导体电子材料等品如半导体电子材料等材材料料学学土土聚聚水水泥泥 制备扫描电镜样品的总要求制备扫描电镜样品的总要求 在不损伤样品原始结构状态在不损伤样品原始结构状态的情况下，保证样品的体积和表的情况下，保证样品的体积和表面积不发生改变，充分面积不发生改变，充分暴暴露样品露样品表面的微细结构表面的微细结构。生物样品的特性生物样品的特性含水量高含水量高质地柔软质地柔软导电性差导电性差二次电子产率低二次电子产率低对热、电子束等敏感对热、电子束等敏感扫描电镜生物样品要求扫描电镜生物样品要求：不含水份不含水份 具有较高的二次电子发射率具有较高的二次电子发射率 良好的导电性良好的导电性 耐热性耐热性 最大限度的保持样品的形貌最大限度的保持样品的形貌 扫描电镜样品常规制备的操作程序扫描电镜样品常规制备的操作程序 1.取取 材材 2.清清 洗洗 3.固固 定定 4.脱脱 水水 5.干干 燥（燥（置换置换）6.粘粘 托托 7.镀镀 膜膜（导电处理）（导电处理）一、一、取取 材材 要要 点：点：确定观察样品的目标确定观察样品的目标要求及注意事项：要求及注意事项：做好充分准备（试剂、仪器、器械等）做好充分准备（试剂、仪器、器械等）保护观察面，作好标记保护观察面，作好标记 速度要快速度要快，每次取材数量不宜过多，每次取材数量不宜过多 大小要合适大小要合适 10 10 5毫米毫米 避免拉割、挤压避免拉割、挤压二、二、清洗清洗目的：去除观察面的杂质，充分目的：去除观察面的杂质，充分暴暴露观察面露观察面方法：物理方法方法：物理方法:漂洗、换洗、加压冲洗、漂洗、换洗、加压冲洗、振荡超声振荡超声。化学方法化学方法:用酶消化法用酶消化法注意事项：注意事项：在保证不破坏观察面的条件下，充分暴露观察面在保证不破坏观察面的条件下，充分暴露观察面 不要损伤观察面或者使样品膨胀、收缩等不要损伤观察面或者使样品膨胀、收缩等 不要将样品裸露在空间，防止样品皱缩变型不要将样品裸露在空间，防止样品皱缩变型清洗液的选择清洗液的选择n n一般组织：等渗生理盐水一般组织：等渗生理盐水n n游离组织细胞：缓冲液、等张液游离组织细胞：缓冲液、等张液n n表面覆有大量黏液的组织（如胃肠粘膜）：表面覆有大量黏液的组织（如胃肠粘膜）：低浓度蛋白水解酶低浓度蛋白水解酶n n组织培养细胞：组织培养液组织培养细胞：组织培养液n n特殊样品：特殊洗液（如生药表面的蜡质，特殊样品：特殊洗液（如生药表面的蜡质，选用去垢剂选用去垢剂Triton X-100）三、三、固定固定目的：目的：保存样品表面的真实结构；保存样品表面的真实结构；硬化组织，减少脱水干燥时水的表面张力对样品硬化组织，减少脱水干燥时水的表面张力对样品的损伤；的损伤；提高样品的二次电子发射率；提高样品的二次电子发射率；提高样品的耐热性和导电性。提高样品的耐热性和导电性。常用的固定剂：常用的固定剂：2.5%戊二醛戊二醛（13h)1.0%四氧化锇四氧化锇(301h)固定温度：固定温度：室室 温，一般以温，一般以4为宜。为宜。四、四、脱水脱水 要求：不改变样品的体积和表面积的情况要求：不改变样品的体积和表面积的情况 下，去除样品中的水份。下，去除样品中的水份。常用的脱水剂：乙醇、丙酮常用的脱水剂：乙醇、丙酮 方法：梯度脱水方法：梯度脱水时间：视样品大小而定时间：视样品大小而定注意事项：避免裸露，夹伤注意事项：避免裸露，夹伤五、五、干燥干燥目的：去除样品中的脱水剂目的：去除样品中的脱水剂 方法：空气干燥法、冷冻干燥法、方法：空气干燥法、冷冻干燥法、叔丁醇干燥法、叔丁醇干燥法、临界点干燥法等临界点干燥法等常用干燥法：叔丁醇干燥法、临界点干燥法常用干燥法：叔丁醇干燥法、临界点干燥法空气干燥法空气干燥法n n方法方法：脱水至无水状态，为减缓其挥发速度，：脱水至无水状态，为减缓其挥发速度，退回至退回至85%脱水剂，取出，空气中自然干脱水剂，取出，空气中自然干燥。燥。n n优点优点：脱水剂为低表面张力物质，挥发过程：脱水剂为低表面张力物质，挥发过程中减少了样品的收缩及损伤中减少了样品的收缩及损伤n n缺点缺点：常常使样品发生变形收缩：常常使样品发生变形收缩n n适用范围适用范围：铸型或体表比较坚硬的甲壳昆虫：铸型或体表比较坚硬的甲壳昆虫等含水量较少的样品等含水量较少的样品冷冻干燥法冷冻干燥法n n方法方法：将含大量水分的生物样品迅速投入液：将含大量水分的生物样品迅速投入液氮中，使样品冷冻固化，而后将样品移入真氮中，使样品冷冻固化，而后将样品移入真空镀膜仪内，在高真空状态下升华，脱水剂空镀膜仪内，在高真空状态下升华，脱水剂直接由固态转为气态，样品随之得到干燥。直接由固态转为气态，样品随之得到干燥。n n优点优点：不存在气相与液相间的表面张力问题，：不存在气相与液相间的表面张力问题，故对样品损伤较小。故对样品损伤较小。n n缺点缺点：需特殊的低温条件，易出现冰晶损伤，：需特殊的低温条件，易出现冰晶损伤，费时。费时。n n适用范围适用范围：含水量较多的生物样品：含水量较多的生物样品叔丁醇干燥法叔丁醇干燥法（1）乙醇梯度脱水至）乙醇梯度脱水至100/2次次 （2）叔丁醇与乙醇混合液置换至叔丁醇与乙醇混合液置换至100%叔丁醇叔丁醇 70、80、90、95和和 100/2次次 5-10min/次次（3）在样品表面滴上）在样品表面滴上 100%叔丁醇叔丁醇（4）将标本置于）将标本置于4以下使样品快速固化以下使样品快速固化（5）移入镀膜仪中让样品在真空下升华干燥。）移入镀膜仪中让样品在真空下升华干燥。临界点干燥法临界点干燥法 原理原理：利用物质在临界状态时，：利用物质在临界状态时，气气相与液相相与液相 的界面消失，样品在没有表面张力的的界面消失，样品在没有表面张力的 情况下进行干燥。情况下进行干燥。步骤步骤：脱水：脱水 置换（醋酸异戊酯）置换（醋酸异戊酯）预冷预冷 放入样品放入样品 注入液态注入液态CO2 CO2置换置换 CO2加温加温气气化化 排除排除CO2温度温度：31.4度度压力压力：73个大气压个大气压临界点干燥法临界点干燥法空气干燥法空气干燥法 Comparison between critical point drying and air drying 六、六、粘托粘托 SEM样品在干燥处理样品在干燥处理或金属镀膜之前，需用特或金属镀膜之前，需用特制导电胶或双面胶将样品制导电胶或双面胶将样品粘贴在金属样品台上。粘贴在金属样品台上。导电胶一般具有黏着导电胶一般具有黏着力较强、容易挥发固化、力较强、容易挥发固化、干燥后表面电阻率低、导干燥后表面电阻率低、导电性能好等特点。电性能好等特点。要点：稳，钝角要点：稳，钝角样样 品品 粘粘 托托Fixing the specimen 七、七、镀膜（样品的导电处理）镀膜（样品的导电处理）目的：使样品导电，增加二次电子的发射率目的：使样品导电，增加二次电子的发射率金属镀膜技术：包括金属镀膜技术：包括真空喷镀法真空喷镀法和和离子溅射法离子溅射法真空喷镀法真空喷镀法 方法方法：在高真空中使金属加热蒸发，在在高真空中使金属加热蒸发，在 样品表面沉积形成一层金属膜。样品表面沉积形成一层金属膜。缺点缺点：金属损耗大，容易产生污染和热：金属损耗大，容易产生污染和热 损伤，容易形成损伤，容易形成“死角死角”。离子溅射法离子溅射法原理：原理：利用气体在低真空中的辉光放电所产生的利用气体在低真空中的辉光放电所产生的高能离子，对靶极产生撞击，从靶极上打出金高能离子，对靶极产生撞击，从靶极上打出金属粒子，金属粒子在电场的作用下飞向样品。属粒子，金属粒子在电场的作用下飞向样品。在到达样品前，金属粒子之间以及金属粒子与在到达样品前，金属粒子之间以及金属粒子与气体分子之间要发生相互撞击，改变了金属粒气体分子之间要发生相互撞击，改变了金属粒子飞向样品的方向，具有子飞向样品的方向，具有“绕射绕射”效应，所以在效应，所以在样品表面能形成一层连续的、厚度均匀的金属样品表面能形成一层连续的、厚度均匀的金属膜。膜。离子溅射的优点：离子溅射的优点：要求的真空低要求的真空低 工作温度低工作温度低 金属粒子无方向金属粒子无方向 连续的、厚度均匀连续的、厚度均匀 甲甲 虫虫 3kV大肠杆菌耳蜗尿酸钠结晶尿酸钠结晶红红细细胞胞巨噬细胞吞噬巨噬细胞吞噬上左：兔肾小体细胞上左：兔肾小体细胞上右：血细胞发生上右：血细胞发生下图：十二指肠绒毛下图：十二指肠绒毛 SEMSEM觀察苗木下表皮氣孔分觀察苗木下表皮氣孔分觀察苗木下表皮氣孔分觀察苗木下表皮氣孔分佈及葉部組織之微細構造佈及葉部組織之微細構造佈及葉部組織之微細構造佈及葉部組織之微細構造 A A：氣孔密度：氣孔密度：氣孔密度：氣孔密度(橫線橫線橫線橫線=120mm)=120mm)B B：氣孔形：氣孔形：氣孔形：氣孔形態態態態(橫線橫線橫線橫線=12mm)=12mm)C C：葉組織：葉組織：葉組織：葉組織(橫線橫線橫線橫線=120mm)=120mm)ABCSEMSEM觀察泡桐根瘤線蟲微細構造觀察泡桐根瘤線蟲微細構造觀察泡桐根瘤線蟲微細構造觀察泡桐根瘤線蟲微細構造 SEMSEM觀察觀察觀察觀察A.scrobiculataA.scrobiculata孢子之外觀形態孢子之外觀形態孢子之外觀形態孢子之外觀形態 (橫線橫線橫線橫線=60mm)=60mm)SEMSEM觀察觀察觀察觀察G.mosseaeG.mosseae丛枝菌根真菌丛枝菌根真菌丛枝菌根真菌丛枝菌根真菌 孢子之外觀形態孢子之外觀形態孢子之外觀形態孢子之外觀形態 (橫線橫線橫線橫線=100mm)=100mm)接種菌根菌及接種菌根菌及接種菌根菌及接種菌根菌及2%2%鹽分處理草海桐苗木之根部微細構造鹽分處理草海桐苗木之根部微細構造鹽分處理草海桐苗木之根部微細構造鹽分處理草海桐苗木之根部微細構造(A(A：橫線：橫線：橫線：橫線=30mm=30mm；B B：橫線：橫線：橫線：橫線=12mm)=12mm)未接種菌根菌草海桐苗木之根部微細構造未接種菌根菌草海桐苗木之根部微細構造未接種菌根菌草海桐苗木之根部微細構造未接種菌根菌草海桐苗木之根部微細構造 (A(A：橫線：橫線：橫線：橫線=300mm=300mm；B B：橫線：橫線：橫線：橫線=12mm)=12mm)TRRT T.harzianum(T)寄生在立枯絲核菌寄生在立枯絲核菌(R)菌株上的情形菌株上的情形松材線蟲頭部口針松材線蟲頭部口針松材線蟲松材線蟲(雄雄)松材線蟲松材線蟲(雌雌)白粉病分生孢子白粉病分生孢子麻竹墊銹菌孢子麻竹墊銹菌孢子第二节第二节 扫描电镜特殊样品制备技术扫描电镜特殊样品制备技术特殊生物样品制备主要有：特殊生物样品制备主要有：（1）管道铸型样品）管道铸型样品 （2）冷冻断裂样品）冷冻断裂样品 （3）游离细胞样品）游离细胞样品 （4）组织消化样品）组织消化样品1.管道铸型样品管道铸型样品 用于研究血管淋巴管胆管等空腔性脏器用于研究血管淋巴管胆管等空腔性脏器的立体结构关系和内表面结构。的立体结构关系和内表面结构。铸型方法铸型方法:铸型剂灌入管腔铸型剂灌入管腔 硬化成型后将硬化成型后将组织腐蚀去掉组织腐蚀去掉 处理铸型进行观察处理铸型进行观察铸型铸型处理：干燥处理：干燥 喷镀喷镀 观察观察2 冷冻断裂样品冷冻断裂样品 用于实质性脏器内部组织结构的研究，观用于实质性脏器内部组织结构的研究，观察组织细胞内部各种复杂的细胞器及相互之间察组织细胞内部各种复杂的细胞器及相互之间的关系。的关系。步骤：取材步骤：取材 固定固定 清洗清洗 防冻防冻 冷冻冷冻 包埋包埋 割断割断 软化软化 后固定后固定 导电导电 及终末固定及终末固定 脱水脱水 临界点干燥临界点干燥 镀膜镀膜 观察观察要求：取材迅速要求：取材迅速，大小为，大小为1 1 5mm，用具要用具要 预冷，切忌夹持观察面，冷冻的速度要预冷，切忌夹持观察面，冷冻的速度要 快，外力要轻快，外力要轻3 游离细胞样品游离细胞样品样品制备要点：样品制备要点：将相对低浓度、分散、游离的细胞浓缩、集中、将相对低浓度、分散、游离的细胞浓缩、集中、固定固定步骤：预固定步骤：预固定 离心离心 涂片涂片 固定固定 脱水脱水 干燥干燥 镀膜镀膜血血细细胞胞5656 .4 组织消化样品组织消化样品 用化学腐蚀或酶消化方法，来充分用化学腐蚀或酶消化方法，来充分暴露和显示被检样品结构的表面形态。暴露和显示被检样品结构的表面形态。步骤：步骤：固定固定 清洗清洗 消化消化 表面稳定表面稳定 后固定后固定 脱水脱水 干燥干燥 镀膜镀膜 观察观察谢 谢！谢 谢！