3分子变异和生态学问题教学课件

3分子变异和生态学问题分子变异和生态学问题21、静念园林好，人间良可辞。22、步步寻往迹，有处特依依。23、望云惭高鸟，临木愧游鱼。24、结庐在人境，而无车马喧；问君何能尔？心远地自偏。25、人生归有道，衣食固其端。1.1.1核苷酸替换核苷酸替换核苷酸单碱基对替换(single base-pair substitution)又称替代或置换，也称为点突变(point mutation)。核苷酸替换分为转换(transition)和颠换(transversions)两类。转换是A和G(嘌呤)之间或T和C(嘧啶)之间的替换。颠换是一个嘌呤和一个嘧啶之间的替换。转换比颠换更常见。图图6-2核苷酸点突变类型核苷酸点突变类型表示转换；表示颠换转换和颠换如发生在基因的蛋白质编码区内，根据点突变对基因转录和蛋白质翻译产生的影响定性，可以把点突变分为同义突变(synonymous mutation)和非同义突变(non-synonymous mutation)二种。同义突变，碱基替换不引起氨基酸改变，则称为又称为中性突变(neutral mutation)或沉默突变(silent mutation)。同义突变的原因是点突变发生在密码子的第三个核苷酸，由于遗传密码的简并性，这个突变后的密码子恰恰同突变前的密码子编码同一氨基酸，这样，突变不会改变蛋白质中的氨基酸序列。引起编码氨基酸改变的碱基替换又称为非同义替换。非同义突变，又进一步分为错义突变(missense mutation)和无义突变(nonsense mutation。错义突变是指受到影响的密码子变成另一种新密码子，编码一个新的氨基酸，使氨基酸序列发生变化。错义突变大多发生在密码子的第一位或第二位核苷酸。无义突变是指一个编码氨基酸的密码子，在点突变后变成了一个终止密码子，使多肽合成提前中止，产生了缺失原有羧基端片段的缩短的肽链。在多数情况下，这种截短尾巴的蛋白质片段是没有活性的。图6-3发生在编码区的基因突变(a)同义突变；(b)错义突变；(c)无义突变1.1.2插入和缺失插入和缺失插入(insertions)和缺失(deletions),总称为indels变化，是指在原核苷酸序列中插入或丢失1个或多个相邻核苷酸。插入和缺失的形成机制主要有三种：第一种是复制滑脱(replication slippage)或复制链误配(slipped-strand mispairing)。这类事件发生在含有邻接短重复序列的DNA区域中。DNA复制期间，滑脱可因邻接重复间的误配而引起，而滑脱又可造成某一DNA片段缺失或重复的后果，至于是缺失还是重复，则要看滑脱发生在5-3方向或是相反的方向。第二种机制是不等价交换(ubequal crossing over)。两条染色体不等价交换，结果是在一条染色体上某一DNA片段缺失，而在另一条染色体上则出现同一序列的重复。第三种机制是DNA转座。图6-4滑脱误配所产生的重复和缺失DNA复制期间TA重复中发生的两碱基滑脱。3-5方向的滑脱造成一个TA重复单位插入(左半图)；5-3方向的滑脱造成一个未配对TA重复单位缺失(右半图)，该TA重复单位的缺失可能是由于DNA聚合酶3-5外切酶的活性所致。图6-5 基因中的不等价交换图中矩形表示某一特定长度的DNA。不等价交换，导致其中一个子链中某一DNA序列缺失，而另一子链中则出现同一序列的重复。缺失和插入统称为裂缝(gaps)，因为当一个带有缺失或插入的序列与原序列比较时，两序列中就会出现一个裂缝。裂缝事件中所涉及的核苷酸数目，范围从一个，几个或数千个核苷酸连续片段。裂缝的长度基本上展示出双峰型频率分布，短裂缝(130个核苷酸)常常是由于复制过程中的错误造成的，如上面所讲的滑脱链误配；而长片段的插入和缺失主要是由于不等价交换和基因转座造成的。1.1.3移码突变移码突变在编码区，如果插入或缺失事件所涉及的核苷酸数目不是3的倍数，则会使处在突变发生位置下游的密码子阅读框架发生移动，这种突变称为移码突变(frameshift mutation)。结果是裂缝下游的编码序列将会按错误的相位阅读，它不仅可导致许多氨基酸的改变，而且还可能使终止密码子被抹掉或引入新的终止密码子，后果是产生长度异常的蛋白质(图6-6)。核苷酸插入引起的移码突变，可能通过缺失回复到野生型的DNA序列；但如果是由于缺失而引起的移码突变，则一般是不可能出现回复突变的。当插入或缺失连续排列的核苷酸是3的整倍数时，其结果是密码子的插入或缺失突变，而不引起移码突变。这种密码子整数倍的插入或缺失称为整码突变(inframe mutation)。移码突变同置换突变一样，都有突变热点(hotspot),即容易发生这些突变的位点。一些研究结果指出，重复的核苷酸序列易发生序列的插入或缺失，是移码突变的热点区。图6-6移码突变(a)缺失一个G，造成翻译提前终止；(b)插入一个G，结果去掉一个终止密码子，造成翻译长度增加。终止密码子下划有横线。1.2 突变的空间分布突变的空间分布突变不是在整个基因组中随机出现的,有些区域比另一些区域更容易突变它们被称为突变的热点(hotspots)。有一个突变热点是二核苷酸5 CG-3，其中胞嘧啶常常被甲基化并被错误地复制，最后它就变成为5-TG-3。二核苷酸5-TT-3 在原核生物中是一个突变热点，但在真核生物中却通常不是。在细菌中含有短回文（palindromes)(即两条互补链读起来相同的序列如5-GCCGGC-3，,5-GGCGCC-3 和5-GGGCCC-3）的DNA内的区域，被发现比其他区域更易于突变。在真核生物的基因组中，串接重复常常是缺失和插入的热点，或许这是滑脱链误配所造成的结果。1.3 基因突变和自然选择基因突变和自然选择基因突变可分为自发突变(spontaneous mutation)和诱发突变(induced mutation)。自发突变指在自然界的各种辐射、环境中的化学物质、生物体内的DNA复制错误、DNA自发损伤和修复能力的缺陷、转座因子等多种因素作用下引发的突变。诱发突发指用人工的方法诱发基因产生突变。所有能诱发基因突变的因子，称为诱变剂(mutagen)。由于癌的发生也同基因突变密切相关，因此，许多诱变剂往往具有致癌作用，也是一种致癌物(carcinogen)。突变的频率以突变率(mutation rate)表示。突变率是指在一个世代中或其它规定的单位时间内，一个细胞发生某一突变事件的概率。有性生殖生物中，突变率通常用一定数目配子中突变型配子数来表示；无性生殖生物，如细菌，则用一定数目的细菌在一次分裂过程中发生突变的次数来表示。一般情况下，生物的自发突变率是很低的。比如，高等生物的自发突变率为110-10110-5，即在10万到100亿个配子中可能有一个突变发生；细菌的自发突变率则在110-10410-4。不同的生物有不同的突变率；同一生物的不同基因也有不同的突变率。基因突变是不定向的，随机的；也就是说，突变的效应并不对应于诱变因子的性质。比如，低温并不引起抗寒的突变，使用青霉素并不引起抗青霉素的突变。可是，在低温条件下，的确可以找到抗寒的作物；用青霉素后，有些细菌确是出现了抗药性。其原因是低温和青霉素在这里充当一个选择因子。在自然界的生物群体中，每一个个体对温度或青霉素的耐受个体本来就是不同的。正常温度或不接触药物的环境中，耐低温或耐药物的性状没有表现，因为没有表现的环境。可是，当温度降低或使用药物时，不耐低温或药物或耐受程度较差的个体无法生存而被淘汰，只有耐低温或耐药的个体能够生存而被选择，并逐渐成为群体中的主体，于是出现了耐低温或耐药的生物群体。如果温度再降低，青霉素的剂量再增加，则只有耐受性更高的个体被选择保留下来，并形成一个群体，于是出现了温度不断降低，青霉素剂量不断增加，生物体更能耐低温和耐药物。因此，突变是不定向的，只有选择是定向的。群体基因型的定向变异，是由选择作用造成的，而不是个体的定向变异造成的。这样说来，抗DDT的昆虫难道在人类发明DDT以前就有抗DDT的能力？或者人类每发明一种新的杀虫剂，昆虫就会有对付这种新药剂的抗性基因？其实，这是一个生物化学问题。任何一种化学药物都作用于一定的靶分子，以期打乱和阻断生物体内物质代谢和能量代谢的正常路线，导致生物体的死亡。所以生物体内的基因产物如能与药物分子相拮抗，保护靶分子不受药物的作用，或者从其它代谢途径来补偿药物分子所起的破坏作用，就会表现出抗药性。例如，抗DDT的果蝇体内的脱氯化氢酶(dehydrochlorinating enzyme)基因的活性很高，可把DDT转变成无毒的乙稀化合物DDE。只有抗药性的昆虫才能存活下来，通过繁殖形成耐药性的群体。基因突变是生物群体中遗传变异的主要来源，也是生物进化过程中自然选择的主要原因。基因突变不仅发生在DNA编码区，而且也会发生在启动子区、剪接部位、内含子和多腺苷酸化位置。只要是影响基因表达和蛋白质活性的核苷酸突变，都属于基因突变的范围。发生的大多数突变对生物体而言都是有害的，因为基因突变破坏了生物体与生存环境之间的一种适应性平衡，不利于生物体的生存。1.4 动态突变动态突变在研究与人类神经系统遗传性疾病相关的基因时，在患者基因的编码序列中，或是编码序列两侧的序列中发现某个密码子的拷贝数目远远多于正常个体的拷贝数。换句话说，患者基因中某种三核苷酸的重复拷贝数急剧增加，这种突变导致了疾病的发生。这种三核苷酸重复拷贝数增加，不仅可发生在上代生殖细胞中而遗传给下一代，而且在当代的体细胞中也可发生，并同样具有表型效应。除此之外，一个个体的不同类型细胞或同一类型细胞中，三核苷酸重复拷贝数也可以是不同的。这不同于以往发现的基因突变。过去观察到的基因突变体仍然有着与上代相同的突变率，突变率是很低的，而且变动是很小的。比如，编码血纤维原肽(400个氨基酸组成)的基因的突变率，估计是每20万年改变一个氨基酸，这些突变可以说是近于“静止”的。由于三核苷酸突变不同于此，所以称之为动态突变(dynamic mutation)。动态突变也可称为基因组不稳定性(genomic instability)。动态突变最初是在与人类神经系统疾病相关的基因中发现的。在动态突变和疾病相关的研究中，发现扩增的重复序列是不稳定地传给下一代，往往倾向于在后代增加几个拷贝数，重复拷贝数增加的越多，病情越严重，发病年龄越小，这种现象称为遗传早现(anticipation)。随后发现，不仅是与神经系统遗传性疾病相关基因中有三核苷酸拷贝数增加，在一些与发育相关的基因中同样也有此现象。另外还发现，三核苷酸扩增突变达到一定程度后，影响性状的显隐性表达；三核苷酸拷贝数扩增突变在其它物种(如小鼠)中，也有发现。因此，动态突变在生物界中也许是相当普遍的。1.5 DNA 分子变异的异质性分子变异的异质性DNA 分子异质性体现在进化速率的不同。不同分子之间，或同一分子不同序列结构之间，突变速率，固定速率以及选择压力等有很大差异。许多生物体的基因组具有不同的遗传方式和序列进化率，通过比较，可以得到有价值的认识。另外，各种分子技术提供了不同的敏感程度。这样，从近缘个体到远缘物种，不同亲缘关系程度，通过选用不同的DNA标记和分子技术得到一个研究特定类群的最适宜的方法。如何检测发生在不同个体之间的这种分子如何检测发生在不同个体之间的这种分子变异？变异？分子遗传学的发展产生了许多新技术。这些技术的直接作用是有效检测生物个体间的DNA差异。2、检测分子变异的技术2.1 材料来源:提取DNA任何细胞或组织都是合适的DNA 来源脊椎动物，血液。鸟类的血液(它的红细胞是具核的)中获得只需1-2ul；哺乳动物来讲只有白细胞具核则需要1ml。低等动物：组织或个体。组织保存：新鲜组织：液氮或低温冰箱。固定组织：70%酒精2.2 DNA-DNA 杂交n杂交方法被用来：n(i)估计两个种基因组间总的相似性，n(ii)在克隆之前，检测一个特殊的序列。n方法：（1）固定，将等分试样的DNA(或血液)点到滤膜上并固定；（2）杂交，与探针杂交；（3）检测，杂交的检测可以通过X 射线,放射自显影,或膜上探针的直接化学染色。通过各种合适的对照来比较其杂交强度可以测定目标样品中探针序列的存在。n当研究一特异性序列时，探针可以是克隆的DNA 片段或人工合成的寡核苷酸序列（典型的是20-30 个碱基对）。一旦一个克隆被测序后，就可以设计寡核苷酸探针，并且原则上允许相对快速而方便地对序列变异数据的收集。2.3 限制性片段分析估测DNA 序列变异的最简单方法是应用限制性片段(或限制性片段长度多态性,RFLP)来分析。首先，样品DNA 被某一限制性内切酶消化，切成一定的片段，然后依它们的长度将这些片段通过电泳分离。限制性片段可以通过电泳凝胶片的染色观察或如上所述，DNA 片段的存在与否暗示着应用特定限制性内切酶来识别的特异性目标序列的变异。2.4 DNA 指纹分析两种不同级别的两种不同级别的DNA 指纹分析，多位点和单位点指纹。指纹分析，多位点和单位点指纹。单位点指纹单位点指纹通过与一克隆的小卫星探针的Southern 杂交，可以检测在一个单位点上等位DNA 限制性片段的不同大小。一个典型的小卫星DNA 序列的长度大于20,000 个碱基对,它包括一个短的10-60 碱基对的非编码序列的重复拷贝。重复的次数有显著的差异，可以产生易于检测的不同长度的限制性片段，从而在一些小卫星位点得到了很高水平的多态性(杂合率达100%)。小卫星位点是“可变数量的串联重复(VNTR)”位点的例子。多位点多位点DNA 指纹指纹，用到一个“多核心(poly-core)”探针，它可与部分重复单位(即核心)自动杂交，这种重复单位在微卫星的很多分离的位点上是很普通的。可以用不同的核心探针来检测非依赖性小卫星带谱。多位点指纹法的一个主要优点是核心探针可用在广泛的生物体中。多位点指纹法的一个缺点是指纹谱复杂，难以比较，特别是在不同的凝胶上得到的谱。组成的DNA片段也不能归因于特异性位点。单位点指纹法通过允许基因型归因于常常是高度变异的位点,避免了这些问题。但它也有缺点，就是在所研究的每一个物种中或至少在一个近缘种中都得找出一种标记系统。另外一种级别的 VNTR 位点包括了简单的序列，或微卫星多态性(Tautz,1989)。微卫星(microsatellite)包含不同数量简单而短的串联重复，如(GT)n 或(CAC)n。小卫星和微卫星的区别是随意的，但实际的区别是微卫星总的长度小到允许应用PCR 技术分析。所以微卫星的变异分析比小卫星容易得多(见Rassmann 等1991,Schiotterer 等(1991)的方法)。特异位点微卫星系统常在宽范围的近缘种中适用(Schltterer 等,1991),在一定程度上比小卫星探针更有用。由于这里数据太少而不能在两个级别的两个位点进行典型变异的细致比较。高水平的多态性很可能在小卫星位点上得到，但微卫星的变异似乎适合作大量的应用。2.4 PCRPCR可以产生足量的特定长度的DNA,适合各种方法的进一步分析，如RFLP、测序和与特异探针的杂交。在聚合酶链式反应中，应用一耐高温的DNA 聚合酶循环复制相反的两条DNA 链上两个引物部位之间的序列,这个反应需要两个合成的寡核苷酸引物的存在与DNA 上的这些部位互补，每循环一次,产量成倍增加。这个过程的灵敏度使得它可以对极少量DNA 进行分析,例如这些DNA 可来自单个精子细胞，单根头发，单个羽毛，古代的骨胳或博物馆中的标本。由于所研究的序列只需要很少的完整拷贝,甚至固定的或包埋了的组织都适合来提取DNA作PCR(Greer等1991)，所以，很简单的野外样品保存和实验室提取的操作程序都会令人满意。因为扩增的PCR 产品有足够的量可供直接在电泳凝胶片上检测,所以PCR 为杂交方法提供了另一个很好的选择。例如可以检测引物部位间的序列长度变异或检测在一个引物部位本身的变异。PCR 产物可以用作点印迹DNA-DNA 杂交时的靶材料,也可用作限制性分析，和其它技术结合，可以不进行广泛地测序，就可以相对方便地收集有用的基于序列的标记数据。2.6 DNA 测序对整个基因的DNA多态性的研究,需要分别地从每个个体克隆基因。一旦在一个亲缘生物体中得到克隆并测得序列，由此可设计出寡核苷酸引物，进行PCR,PCR 的优点是通常可以绕过克隆这一步。设计通用的引物,在不同物种中扩增某一特定基因序列。2.7 变性梯度凝胶电泳这种方法需要为所研究的具有长G-C 尾的区域准备一个引物，这种具有抗变性的G-C 键的扩增产物，可在含有脲的梯度凝胶上电泳，不同序列的产物在不同的脲浓度上部分地变性,对长度小于500bp 的产物,小到只有1 个碱基对替换的变化，能够通过移动距离的不同而分辨出来，频率数据(包括杂合子的辨别)可直接由凝胶上得到。在这种应用中,DGGE 对研究DNA 片段在种群内或其它研究单位内的中等变异是最有用的。2.8 随机扩增多态性DNA（RAPD）随机扩增多态性DNA(RAPD),不同生物提取的DNA，应用多组短单链随机引物，通过PCR获得不同长短的产物，经过琼脂糖电泳和溴化乙锭染色后,比较扩增产物时,一些引物将产生少许分离的带,它们的一部分在种群内或种群间是多态的。当检测时,这些标记通常呈现显著的孟德尔遗传特性。在动植物中,这些标记可用来制作基因连锁图。这种方法仅需要DNA 分离、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳过程,就可提供丰富的多态性标记数据，避免了限制性酶和放射性标记的高消耗和复杂性。3 生态学应用3.1 性别鉴定 许多生物体由于在幼年期难于作性别鉴定,因此，相关的研究无法开展。性别是由遗传决定的，关键是至少在一种性别具某些特异性DNA，用分子标记去鉴别特殊的性染色体的序列特征,已有了一些实例，如使用一种减法克隆(subtraction cloning)技术分离了食鲱鱼鸥(Larus argentatus)的W 染色体(雌性特异的)的特异性探针，遗憾的是,这个探针只对很少一些近缘种有应用价值。最近分离了在Y-染色体上的性别决定区(SRY)的基因,并认为它对人类来说是性别决定位点，它能够作为一个探针，用印迹分析来确定一系列哺乳动物的性别。虽然在其它脊椎动物分类群中,它好象可能具有一个相同功能的同源物,但首次在鸟类寻找这样一个同源基因并不成功。一旦得到了合适的序列数据,至少就可以设计和合成在大范围的哺乳动物物种中有用的寡核苷酸探针,或至少可以设计寡核苷酸引物应用于PCR。3.2 交配制度进化生态学家对交配制度特别感兴趣,他们希望能够度量个体在自然条件下的生殖成功情况，也需测量不同个体间的亲缘关系，在实践中,父本和母本的检验是测量亲缘关系的一种特殊情况。为这个目的,应用分子方法特别是多位点DNA 指纹和RFLP 分析进行研究,多位点分析已应用于一些完全在野外进行的繁殖系统研究上,现在几乎已经成为常规方法。迄今多数的研究集中在鸟类上,反映了鸟类作为行为生态学研究对象的普遍性,并且涉及到基本上是单配制度中，确定是父性或是母性，或者关注互助繁殖群成员之间的血统分布以及亲缘关系的程度。3.3 种群结构种群结构,包括从种群内到种群间在各种水平上研究亲缘关系与遗传分化。线粒体DNA(mtDNA)是用于许多种群分化研究的DNA序列。在植物中,质粒DNA 也是类似分子，同样的进展,并已在少数的种群结构研究中得到应用。3.4 迁移和基因流迁移是种群结构的一个重要成分,应用分子的方法可以推断迁移模式。例如,现代人的地理起源，这是个有争议的问题,通过从多类人种和黑猩猩中取样和获取的mtDNA D-loop区序列比较,确认了人类mtDNA 进化树的非洲起源(Vigilant 等 1991)。3.5 渐渗现象与杂交地带适用于种群结构分析的技术也适于特殊情况的杂交地带。分析沿着杂交地带的基因渐渗，mtDNA特别有价值(Harrison 1989 综述)。核糖体DNA 也应用于某种程度的研究(如Baker 等1989)。3.6 物种的鉴定 不同物种总DNA之间的杂交程度，已被广泛地用来估测物种间的亲缘关系。特别是在原核生物之间,当一些生物具90%以上的杂交值时,就把它们粗定为物种(Woese 1987)。然而,这种方法的分辨率和分类学范围经常是低的,需要作比较，就要求有大量的DNA。物种特异性探针在研究宿主传播媒介(vector)寄生物系统中特别有用。Kukla 等(1987)使用包含有重复序列的放射活性标记的限制片段克隆,鉴定了一种蝇类组织中锥虫的种和亚种。他们发展了一种应用于野外的方法,将分离的蝇腹部整个地放在尼龙膜上与标记的探针杂交,就能确认和鉴定肠锥虫。通过筛选一个基因文库,Harnett 等(1989)发现并测定了一寡核苷酸探针的序列,它能区别引起人类河盲症(river blindness)的一种线虫Onchocerca volvulus 和形态上相似但不是病原体的另外一个Onchocerca 种,它们携带在同样的蚋(blackfly)媒介上。3.7 分子系统学分子技术可广泛地应用于系统学的研究。实际上,任何基于遗传的信息都可为分类学提供有价值的资料。PCR技术更是广泛应用于分子系统学的研究。设计通用引物，应用PCR 扩增特定序列，如 线粒体细胞色素b 序列,通过构树软件，建立这些群体的系统发育。不仅可以解释不同类群之间的系统发育关系，亲缘关系和共同祖先的分化，而且还可以解释物种形态学，取食行为和生态学适应。3.8 群落多样性 16s rRNA的扩增提供了一个检测微生物多样性的有用方法。Giovannoni 等(1990)把从浮游细菌的自然种群得到的16s rRNA 基因扩增片段进行了克隆测序，发现一些以前未知的分类群，在系统发育上是分离的,又是微生物群落中重要组成成员。Ward 等(1990)检测一陆地温泉中蓝藻细菌丛中微生物物种的组成。用一通用引物，从环境样品中扩增16s rRNA DNA，经过克隆和测序,序列比较后发现，所检测的8 个序列类型没有一个同该地点以前已知的14 种生物相一致。表明分子工具可以揭示出微生物群落中以前未检测出的多样性。谢谢你的阅读v知识就是财富v丰富你的人生71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。康德72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。西塞罗73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。伏尔泰74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。屈原75、内外相应，言行相称。韩非