目的基因的克隆与鉴定

实 验 24 目 的 基 因 的 克 隆 与 鉴 定 一 、 实 验 目 的n 学 习 和 掌 握 细 菌 转 化 与 目 的 基 因 DNA分子 增 殖 及 其 鉴 定 的 原 理 和 方 法 。 n 重 组 DNA（ 基 因 克 隆 ） 示 意 图 载体DNA(限制性内切酶切开) 目的基因 宿主细胞 重组体已转化的宿主细胞 阳性克隆株繁殖表达 重 组 载 体 的 构 建 二 、 主 要 仪 器 设 备 及 器 材n 设 备 ： 低 温 离 心 机 、 恒 温 水 浴 器 、 台 式 离 心 机 、 超净 工 作 台 、 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 系 统 、 恒 温 培 养 箱 、 高压 灭 菌 锅 、 陶 瓷 研 钵 、 吸 头 、 紫 外 分 光 光 度 计 、 PCR仪 、 电 泳 仪 、 水 平 式 电 泳 槽 、 微 量 离 心 管 、 紫 外 线透 射 仪 。n 试 剂 ： TRIzol TM试 剂 、 高 保 真 DNA 聚 合 酶 混 合 物 、Reverse Transcription System、 氯 仿 、 异 丙 醇 、 乙醇 、 琼 脂 糖 、 溴 化 乙 锭 、 Tris、 EDTA、 SDS、 pUCm-T载 体 、 大 肠 杆 菌 、 琼 脂 糖 、 T4 DNA连 接 酶 。 三 、 实 验 内 容 与 基 本 要 求 n 1、 用 碱 裂 解 法 提 取 质 粒 DNA： 方 法 同 前 。n 2、 目 的 基 因 DNA分 子 的 PCR扩 增 ： 方 法 同 前 。n 3、 PCR产 物 的 检 测 与 回 收 ： 方 法 同 前 。n 4、 质 粒 DNA与 目 的 基 因 DNA分 子 的 连 接 ： 利用 pUCm-T载 体 构 建 T-A重 组 克 隆 。 将 上 述 PCR产 物 和 质 粒 DNA， 利 用 T4 DNA连 接 酶 体 系14 连 接 过 夜 ， 获 得 连 接 产 物 。 三 、 实 验 内 容 与 基 本 要 求 n 5、 在 感 受 态 细 胞 中 加 入 连 接 产 物 转 化 入 大 肠杆 菌 BL21中 ， 获 得 转 化 的 感 受 态 细 胞 ： 取 感 受态 细 胞 悬 液 100L转 移 到 无 菌 的 微 量 离 心 管 中 ,每 管 加 连 接 产 物 10L， 轻 轻 混 匀 ， 在 冰 上 放 置30min。 42 的 循 环 水 浴 中 2min。 快 速 将 反 应管 转 移 到 冰 浴 中 ， 使 细 菌 冷 却 2min。 每 管 加500L 无 氨 苄 青 霉 素 的 LB培 养 液 。 37 ， 200 rpm， 培 养 1h。 三 、 实 验 内 容 与 基 本 要 求 n 6、 已 转 化 的 感 受 态 细 胞 涂 板 培 养 ， 观 察 并 鉴 定 ： 将 400L 菌涂 在 氨 苄 青 霉 素 平 板 上 。 平 板 在 37 正 向 放 置 1h， 以 吸 收 过多 液 体 ， 然 后 倒 置 平 皿 ， 于 37 培 养 过 夜 。 挑 取 阳 性 克 隆 至 含氨 苄 青 霉 素 的 LB培 养 液 中 ， 37 培 养 过 夜 ， 小 规 模 扩 增 后 ，用 碱 变 性 法 制 备 质 粒 并 鉴 定 。 n 7、 阳 性 克 隆 目 的 基 因 DNA分 子 的 鉴 定 ： 挑 取 阳 性 菌 落 至 含 氨苄 青 霉 素 的 LB培 养 液 中 ， 37 培 养 过 夜 ， 小 规 模 扩 增 后 ， 用碱 变 性 法 制 备 质 粒 并 鉴 定 。 取 阳 性 克 隆 菌 液 ， 采 用 PCR方 法 和鉴 定 阳 性 克 隆 。 超 净 工 作 台 高 速 冷 冻 离 心 机 和 超 速 离 心 机 等 漩 涡 混 匀 器 垂 直 电 泳 装 置 凝 胶 成 像 系 统 四 、 实 验 结 果 报 告 1、 转 化 效 率 的 计 算 ： 转 化 子 总 数 菌 落 数 （ 转 化 反 应 原 液 总 体 积 /涂板 菌 液 体 积 ） 转 化 效 率（每微克质粒DNA的转化子数） 转 化子 总 数 （ 个 转 化 子 ） /加 入 质 粒 DNA的 量 （ g） 2、 质 粒 提 取 与 酶 切 鉴 定 结 果 ， 贴 上 打 印 实 验 照片 并 标 明 照 片 上 各 DNA条 带 的 含 义 。 五 、 思 考 题1、 何 谓 感 受 态 细 胞 ？ 制 备 感 受 态 细 胞 的 理 论依 据 是 什 么 ？2、 CaCl2制 备 细 菌 感 受 态 细 胞 及 其 转 化 的 基本 原 理 。3、 阳 性 克 隆 鉴 定 的 方 法 有 哪 些 ？ 简 述