病原微生物检测方法

原 理 ： 生 化 方 法 检 测 病 原 微 生 物 实 际 上 是 测 定 微 生物 特 异 性 酶 。 由 于 各 种 微 生 物 所 具 有 的 系 统 不 完 全相 同 ,对 许 多 物 质 的 分 解 能 力 亦 不 一 致 。 因 此 可 利 用不 同 底 物 产 生 的 不 同 代 谢 产 物 来 间 接 检 测 该 微 生 物内 酶 的 有 无 ,从 而 达 到 检 测 特 定 微 生 物 的 目 的 。 辛 酯 酶 法 ： 快 速 检 测 沙 门 氏 菌 。 沙 门 氏 菌 能 产 生 辛酯 酶 ,这 一 性 能 是 除 沙 门 氏 菌 外 的 各 属 肠 杆 菌 科 细 菌所 不 具 备 的 。 以 4-甲 基 伞 形 酮 辛 酯 (MUCAP)为 底 物 ,经 沙 门 氏 菌 的 辛 酯 酶 降 解 后 ,释 放 出 4-甲 基 伞 形 酮(4MU),在 紫 外 灯 下 观 察 其 发 出 的 蓝 色 荧 光 。 免 疫 学 技 术 是 利 用 特 异 性 抗 原 抗 体 反 应 ,观 察 和 研 究组 织 细 胞 、 特 定 抗 原 (抗 体 )的 定 性 和 定 量 技 术 。 为 了显 示 和 观 察 这 种 抗 原 抗 体 反 应 ,需 要 预 先 将 某 种 标 记物 结 合 到 抗 体 上 ,借 标 记 物 的 荧 光 或 酶 的 有 色 反 应 、放 射 性 或 高 电 子 密 度 ,在 光 镜 或 电 镜 下 进 行 定 性 、 定位 或 定 量 研 究 。 荧 光 抗 体 技 术 酶 联 免 疫 技 术 分 子 生 物 学 及 分 子 遗 传 学 的 发 展 ,使 人 们 对 微 生 物 的认 识 逐 渐 从 外 部 结 构 特 征 转 向 内 部 基 因 结 构 特 征 ,微生 物 的 检 测 也 相 应 的 从 生 化 、 免 疫 方 法 转 向 基 因 水平 的 检 测 。 核 酸 杂 交 法 PCR及 其 衍 生 技 术 基 于 16S rRNA的 检 测 技 术 免 疫 PCR (immuno polymerase chain reaction , IM PCR) PCR-ELISA 生 物 传 感 器 是 将 新 兴 的 传 感 器 技 术 和 分 子 诊 断技 术 相 结 合 而 成 的 一 种 新 技 术 。 生 物 传 感 器 包含 两 部 分 ,即 分 子 识 别 器 件 和 换 能 器 。利 用 大 肠 杆 菌 抗 体 的 免 疫 吸 附 反 应 ,使 用 集 成化 SPR 传 感 器 快 速 检 测 大 肠 杆 菌 O157 : H7 ,采 用 亲 和 素 - 生 物 素 系 统 放 大 检 测 的 反 应 信 号 ,并 引 入 复 合 抗 体 作 为 二 次 抗 体 ,使 该 传 感 器 对大 肠 杆 菌 的 检 测 限 由 106 cfu/ ml 下 降 到 105 cfu/ ml。 生 物 芯 片 技 术 是 将 生 物 大 分 子 ,如 寡 核 苷 酸cDNA、 基 因 组 DNA、 肽 、 抗 原 以 及 抗 体 等 固 定在 诸 如 硅 片 、 玻 璃 片 、 塑 料 片 、 凝 胶 和 尼 龙 膜等 固 相 介 质 上 形 成 生 物 分 子 点 阵 ,当 待 测 样 品中 的 生 物 分 子 与 生 物 芯 片 的 探 针 分 子 发 生 杂 交或 相 互 作 用 后 ,利 用 激 光 共 聚 焦 显 微 扫 描 仪 对杂 交 信 号 进 行 检 测 和 分 析 。根 据 芯 片 上 探 针 的 分 子 种 类 而 将 之 分 为 ： DNA 芯 片 (即 基 因 芯 片 ) 和 蛋 白 质 芯 片 。 蛋 白 质 指 纹 图 谱 技 术 用 于 各 种 疾 病 特 异 性 蛋 白 指纹 的 识 别 和 判 断 ,可 以 直 接 检 测 不 经 处 理 的 尿 液 、血 液 或 细 胞 裂 解 液 等 。 人 体 血 清 里 有 成 千 上 万 个蛋 白 ,人 一 旦 发 生 了 某 种 疾 病 ,蛋 白 质 成 分 就 必 然会 起 变 化 。 可 以 分 析 得 出 SARS与 非 SARS 病 人 血 清 中 的 蛋 白质 成 分 变 化 。 该 技 术 不 是 利 用 单 独 的 蛋 白 质 峰 的出 现 和 消 失 来 判 断 SARS ,而 是 用 5 个 蛋 白 质 峰 的出 现 和 消 失 来 判 断 ,好 比 刑 侦 破 案 中 甄 别 5 个 手指 的 指 纹 ,故 此 称 为 “ 指 纹 图 谱 ” 。 环 介 导 等 温 扩 增 (loop mediated isothermal amplification， LAMP)技 术 是 近 年 来 发 展 出 的 一种 敏 感 、 特 异 、 方 便 快 捷 的 核 酸 扩 增 技 术 。 与 传统 PCR方 法 相 比 ， LAMP不 需 要 热 循 环 ， 为 等 温 扩 增 。且 由 于 LAMP反 应 中 产 生 大 量 的 副 产 物 一 白 色 焦 磷酸 钾 沉 淀 ， 扩 增 产 物 可 不 经 过 电 泳 ， 通 过 肉 眼 观察 或 浊 度 计 即 可 判 定 结 果 。 用 于 检 测 ： 丙 型 肝 炎 病 毒 (HCV) 、 严 重 急 性 呼 吸综 合 征 冠 状 病 毒 (SARS CoV) 、 乙 脑 病 毒 (JEV) 、甲 型 流 感 病 毒 (AIV) 、 腮 腺 炎 病 毒 (MV)等 。 荧 光 抗 体 技 术 是 根 据 抗 原 抗 体 反 应 具 有 高 度 的特 异 性 ,把 荧 光 素 作 为 抗 原 标 记 物 ,在 荧 光 显 微镜 下 检 查 呈 现 荧 光 的 特 异 性 抗 原 抗 体 复 合 物 及其 存 在 部 位 。直 接 法 是 在 检 测 样 品 上 直 接 滴 加 已 知 特 异 性 荧光 标 记 的 抗 血 清 ,经 洗 涤 后 在 荧 光 显 微 镜 下 观察 结 果 。 间 接 法 是 在 检 测 样 品 上 滴 加 已 知 的 细菌 特 异 性 抗 体 ,待 作 用 后 经 洗 涤 ,再 加 入 荧 光 标记 的 第 二 抗 体 。 酶 联 免 疫 技 术 是 根 据 抗 原 - 抗 体 的 免 疫 反 应 与 酶的 高 效 催 化 作 用 原 理 有 机 结 合 ,通 过 酶 催 化 底 物进 而 发 生 一 系 列 的 化 学 反 应 ,使 溶 液 呈 现 出 颜 色变 化 ,从 而 显 示 抗 原 抗 体 特 异 性 反 应 的 存 在 。 Dot-ELISA法 （ DIBA法 ） ： Dot-ELISA 以 纤 维 素膜 代 替 常 规 ELISA 中 常 用 的 聚 苯 乙 烯 酶 标 板 ， 这种 微 孔 滤 膜 对 样 品 吸 附 量 大 ， 且 包 被 牢 固 ， 所 以样 品 用 量 少 ， 试 验 结 果 可 通 过 颜 色 斑 点 的 出 现 与否 和 色 泽 进 行 判 定 ， 不 需 特 殊 仪 器 。 1,NC膜 用 铅 笔 画 出 0.5cm正 方 格 2,单 头 灰 飞 虱 加 100ul碳 酸 盐 缓 冲液 ， 用 牙 签 捣 碎 ， 取 上 清 2ul加 样 ，室 温 晾 干3,将 干 燥 的 NC膜 浸 入 封 闭 液 中 ，37 ,30min4,取 出 NC膜 ， 浸 入 用 封 闭 液 稀 释 10000倍 的 单 抗 体 中 ， 37 ,1.5h5,取 出 膜 ， 用 0.01MPBST洗 3次 ， 每 次5min 6,将 膜 浸 入 用 封 闭 液 稀 释 5000倍的 酶 标 二 抗 中 ， 37 ,1.5h7,取 出 膜 ， 用 0.01MPBST洗 3次 ， 每 次 5min8,将 膜 浸 入 HRP底 物 显 色 液 中 ， 37 ,30min， 显 色 后 ， 用 自 来 水 冲 洗 ，室 温 晾 干 原 理 ： 是 通 过 标 记 根 据 病 原 体 核 酸 片 段 制 备 的探 针 ， 与 病 原 体 核 酸 片 段 杂 交 ,观 察 是 否 产 生特 异 的 杂 交 信 号 。 核 酸 杂 交 有 原 位 杂 交 、 打 点杂 交 、 斑 点 杂 交 、 Southern 杂 交 、 Northern 杂 交 等 。 核 酸 分 子 探 针 又 可 根 据 它 们 的 来 源 和性 质 分 为 DNA 探 针 、 cDNA 探 针 、 RNA 探 针 及人 工 合 成 的 寡 聚 核 苷 酸 探 针 等 。 被 广 泛 用 于 检 测 植 物 或 介 体 带 毒 及 核 酸 同 源 性 。 如果 用 于 检 测 RNA样 品 ， 称 为 Northern杂 交 ； 如 果 用 于检 测 DNA样 品 ， 称 为 Southern杂 交 。 操 作 程 序 如 下 ：1,从 病 株 材 料 中 提 取 少 量 汁 液 。 如 果 病 毒 核 酸 为 双 链 ，通 过 加 热 使 其 变 性 。2,点 样 。 将 病 株 汁 液 滴 在 NC膜 上 或 尼 龙 膜 上 。3,烘 烤 纤 维 素 膜 ， 使 核 酸 牢 固 地 结 合 到 纤 维 膜 上 。4,用 蛋 白 和 非 特 异 性 小 分 子 DNA溶 液 混 合 进 行 预 杂 交 约2小 时 ， 封 闭 膜 上 的 非 特 异 性 位 点 。5,用 标 记 的 核 酸 探 针 与 膜 上 样 品 在 封 闭 塑 料 袋 中 进 行 杂交 过 夜 ， 水 浴 65 。 洗 膜 后 进 行 放 射 自 显 影 分 析 。 DNA/RNA 样 品 放 射 自 显影 检 测点 样 Probe-32PAB 1 2 3 4 SOUTHERN BLOT PCR 技 术 又 称 体 外 扩 增 技 术 ,具 有 高 度 的 灵 敏性 和 良 好 的 特 异 性 。 。 各 种 衍 生 技 术 如 反 转 录PCR ( RT-PCR) 、 多 重 PCR 、 巢 式 PCR 、 PCR 单 链 构 象 多 态 性 ( PCR-SSCP ) 、 RFL P 、RAPD 技 术 、 荧 光 定 量 PCR 等 。 以 PCR 为 基 础的 DNA测 序 分 析 可 用 于 病 原 菌 的 鉴 定 和 亚 型 的区 分 ,以 及 同 种 病 原 菌 不 同 菌 株 的 区 分 。 1,病 毒 核 酸 样 品 制 备 。 取 单 头 饲 毒 (GPV)的 禾 谷 缢 管 蚜加 10ulTris-HCl(pH7.4)研 磨 ， 加 入 10ul苯 酚 和 10ul氯 仿 ，再 次 研 磨 ， 12000rpm离 心 2min,得 到 约 10ul上 清 液 。 2,cDNA合 成 。 取 1ul上 清 液 (含 GPV)依 次 加 入 1ulGPV CP序 列 引 物 (1)， 2ul 5X MMLV缓 冲 液 ， 6ul双 蒸 水 ， 混 匀 ，进 行 80 1min和 50 5min反 应 。 再 加 入 2ul 10mM dNTPs, 1ul RNase， 1ul 100mM DTT， 1.3ul 50mM MgCl2， 2.1ul MMLV.R.Tase， 加 双 蒸 水 至 反 应 体 系 为 20ul， 进 行37 30min和 100 1min反 应 ， 即 得 到 cDNA。 3,PCR。 10ul cDNA中 加 入 5ul 10X PCR缓 冲 液 ， 2ul 50mM MgCl2 ， 0.15ul引 物 (1)， 0.15ul引 物 (2)， 2ul 10mM dNTPs， 0.5ul Taq聚 合 酶 ， 加 水 至 20ul。 在 PCR仪 中 进 行35个 94 (45s)- 50 (30s) - 72 (2min)扩 增 循 环 ， 程 序 结束 后 ， 调 至 72 保 持 10min， 在 -20 保 存 扩 增 产 物 。 4,扩 增 产 物 的 电 泳 分 析 。 取 10ulPCR产 物 在 1 琼 脂 糖 凝胶 中 电 泳 ， 0.1 EB染 色 20min， 紫 外 线 下 检 测 ， 拍 照 。 原 理 ： 乙 型 肝 炎 病 毒 共 价 闭 合 环 状DNA(hepatitis B virus covalently closed circular DNA， HBVcccDNA)是 乙 型 肝 炎 病 毒(hepatitis B virus， HBV)复 制 的 中 间 体 ， 是HBV mRNA和 前 基 因 组 RNA合 成 的 模 板 。 细 胞 外 乙型 肝 炎 病 毒 DNA是 一 种 松 弛 环 状 的 双 链DNA(relaxed circular DNA， rcDNA)分 子 ， 其 两条 链 均 不 闭 合 ， 其 中 负 链 较 长 ， 约 3200个 碱 基 ，含 有 乙 肝 病 毒 基 因 组 的 全 长 基 因 ， 在 其 5 起 始端 与 3 末 端 之 间 有 一 个 包 含 数 个 碱 基 的 “ 缺刻 ” (nick)； 正 链 较 短 ， 有 较 大 的 “ 缺口 ” (gap)， 其 3 末 端 不 固 定 ， 故 长 度 是 可 变 的 。 Jun Bin S等 在 利 用 Taqman探 针 进 行 的 荧 光 定 量 PCR检测 中 设 计 了 一 条 特 殊 的 嵌 合 引 物 。 该 引 物 由 两 个 片 段连 接 而 成 ， 3 端 是 与 HBV DNA正 链 DR2区 前 的 序 列 互 补的 A片 段 ， 5 端 的 B片 段 是 与 HBV基 因 组 没 有 同 源 性 的HBV基 因 组 的 部 分 序 列 。 cccDNA因 为 正 链 完 整 ， 引 物 与正 链 的 特 定 区 域 杂 交 后 ， 在 DNA聚 合 酶 的 作 用 下 ， 引 物能 够 顺 利 延 伸 形 成 一 条 新 生 链 ， 而 HBV DNA的 其 他 形 式 ，如 rcDNA， 引 物 的 延 伸 停 止 于 DR2区 。 新 生 链 形 成 以 后 ，设 计 另 一 对 引 物 ， 一 个 与 嵌 合 性 引 物 的 片 段 B杂 交 ， 另一 个 与 正 链 DR2后 的 序 列 互 补 ， 进 行 PCR扩 增 。 实 时 PCR仪 通 过 探 针 释 放 的 荧 光 强 度 进 行 cccDNA定 量 。 16SrRNA 存 在 于 所 有 原 核 生 物 细 胞 中 ,它 们 相对 稳 定 且 有 较 高 的 拷 贝 数 (每 个 细 胞 几 千 个 拷贝 ) ,其 序 列 中 含 可 变 区 及 高 度 保 守 区 ,因 此 可 设计 群 、 属 、 种 特 异 性 的 探 针 。 现 阶 段 各 种 常 见细 菌 的 16S rRNA 基 因 几 乎 全 部 测 序 完 成 ,16S rRNA 编 码 基 因 的 这 些 特 点 使 之 成 为 较 理 想 的细 菌 基 因 分 类 的 靶 序 列 。 该 技 术 把 抗 原 抗 体 反 应 的 高 特 异 性 和 聚 合 酶 链反 应 的 高 敏 感 性 有 机 结 合 起 来 ,它 的 基 本 原 理是 用 一 段 已 知 DNA 分 子 标 记 抗 体 作 为 探 针 ,用此 探 针 与 待 测 抗 原 反 应 , PCR 扩 增 粘 附 在 抗 原抗 体 复 合 物 上 的 这 段 DNA 分 子 ,电 泳 定 性 ,根 据特 异 性 PCR 产 物 的 有 无 ,来 判 断 待 测 抗 原 是 否存 在 。 PCR-EL ISA 法 是 PCR 与 EL ISA 技 术 结 合 的 检测 方 法 。 其 综 合 了 PCR 、 分 子 杂 交 和 EL ISA 3种 技 术 的 优 点 。 主 要 用 于 检 测 样 品 中 的 特 定 基因 。 它 引 入 地 高 辛 (或 生 物 素 ) 标 记 的 dN TP 或 引 物 进 行 PCR 扩 增 ,利 用 酶 标 抗 地 高 辛 抗 体(或 酶 标 记 亲 和 素 ) 进 行 EL ISA 检 测 ,代 替 了用 于 常 规 PCR 产 物 检 测 的 电 泳 方 法 ,方 便 快 捷 ,易 于 处 理 大 量 样 品 ,且 其 灵 敏 度 比 使 用 琼 脂 糖凝 胶 电 泳 检 测 方 法 高 100倍 ,当 有 适 当 的 标 准 品时 ,还 可 进 行 定 量 测 定 。