消化毒剂的作用机理

第 五 节 消 化 毒 剂 的 作 用 机 理 1996年 ， 吴 文 君 等 首 次 提 出 了 消 化 毒 剂 的 概 念 ， 把 主 要 作用 于 昆 虫 消 化 系 统 ， 即 主 要 以 消 化 系 统 为 初 始 靶 标 的 杀 虫 剂 为消 化 毒 剂 。 破 坏 中 肠 中 肠 组 织 破 坏 剂 影 响 消 化 酶 系 消 化 抑 制 剂 。 主 要 种 类 ： Bt内 毒 素 植 物 源 次 生 代 谢 物 ， 如 二 氢 沉 香 呋 喃 类 化 合 物 等 。 两 类 靶 标 一 、 Bt内 毒 素 苏 云 金 杆 菌 （ Bacillus thuringiensis,Bt） ， 产 品 已 达 60余 种 ，是 世 界 上 产 量 最 大 、 应 用 最 广 泛 的 微 生 物 杀 虫 剂 。 基 本 作 用 原 理 Bt的 杀 虫 活 性 主 要 是 其 产 生 的 杀 虫 蛋 白 晶 体 在 起 作 用 。 杀 虫蛋 白 晶 体 ， 也 叫 原 毒 素 （ protoxin） ， 是 由 多 个 杀 虫 晶 体 蛋 白（ insecticidal crystal proteins,ICPs） 或 -内 毒 素 （ -endotoxin） 或 Cry（ 晶 体 ） 蛋 白 的 亚 单 位 组 成 。 昆 虫 摄 食 该 毒 蛋白 后 ， 在 中 肠 的 高 pH环 境 和 蛋 白 酶 的 作 用 下 ， 毒 蛋 白 晶 体 溶 解 并被 激 活 ， 引 起 试 虫 中 肠 膜 上 皮 细 胞 裂 解 。症 状 ： 试 虫 失 去 运 动 能 力 ， 不 停 地 颤 抖 ， 呕 吐 ， 停 止 取 食 ， 死 亡 。 1. Bt杀 虫 晶 体 蛋 白 （ Isecticidal Crystal Proteins， ICPs） 杀 虫 晶 体 蛋 白 是 由 苏 云 金 芽 胞 杆 菌 ( Bacillus thuringiensis ， Bt)所 产 生 的 毒 素 。 毒 蛋 白 主 要 有 7种 ： A2外 毒 素 、 B2外 毒 素 、 C2外 毒素 、 -内 毒 素 、 不 稳 定 外 毒 素 、 水 溶 性 毒 素 、 鼠 因 子外 毒 素 。 -内 毒 素 是 在 形 成 芽 孢 的 同 时 形 成 的 蛋 白 质 晶 体 ，位 于 芽 孢 之 旁 ， 所 以 又 称 伴 孢 晶 体 毒 素 ， 是 主 要 的 杀虫 晶 体 蛋 白 ， 这 种 晶 体 蛋 白 只 是 一 种 前 毒 素(Pretoxin)， 经 过 激 活 ， 即 消 化 成 分 子 量 为 100070000的 片 段 ， 才 起 毒 素 作 用 。 晶 体 蛋 白 有 130多 种 ， 按 照 杀 虫 范 围 和 寄 主 同 源 型又 可 分 为 两 大 类 群 ， 即 Cry 蛋 白 和 Cyt蛋 白 。 Cry在 活 体 和 离 体 条 件 下 只 对 鳞 翅 目 、 双 翅 目 或 鞘翅 目 有 效 ； Cyt活 体 条 件 下 只 对 双 翅 目 有 效 ， 而 离 体 条 件 下 具有 广 谱 性 。 Cry分 为 四 大 类 （ 根 据 杀 虫 谱 ） ： CryI（ 鳞 翅 目 ） 、CryII(鳞 翅 目 和 双 翅 目 )、 CryIII（ 鞘 翅 目 ） 和CryIV(双 翅 目 )。 通 常 一 种 毒 素 只 能 杀 死 某 一 目 的 部 分 易 感 昆 虫 ，对 有 益 生 物 和 脊 椎 动 物 安 全 。1. Bt杀 虫 晶 体 蛋 白 （ ICPs） 完 整 的 毒 蛋 白 一 般 由 三 个 结 构 域 组 成 。 结 构 域 由 一 个 -螺 旋 束 组 成 ， 可 能 与 细 胞 膜穿 孔 有 关 ； 结 构 域 由 三 组 -折 叠 片 层 组 成 ， 可 能 参 与 了毒 素 与 膜 受 体 蛋 白 的 识 别 和 结 合 ； 结 构 域 位 于 毒 素 分 子 C-端 ， 则 可 能 能 够 防 止 昆虫 肠 道 蛋 白 酶 对 毒 性 肽 分 子 的 进 一 步 降 解 。 1. Bt杀 虫 晶 体 蛋 白 （ Isecticidal Crystal Proteins， ICPs） 2. Bt毒 素 受 体 蛋 白 晶 体 蛋 白 的 毒 性 与 受 体 蛋 白 和 晶 体 蛋 白 结 合 的 能 力呈 正 相 关 ， 膜 受 体 蛋 白 是 毒 蛋 白 专 一 性 的 决 定 因 子 。 昆 虫 中 肠 Bt毒 素 受 体 蛋 白 主 要 为 存 在 中 肠 的 刷 状缘 膜 囊 泡 (BBMV)的 氨 肽 酶 N (aminopeptidase N， APN)（ 肽 链 端 解 酶 ， 催 化 蛋 白 氨 基 末 端 残 基 的 分 裂 ） 。 鳞翅 目 。 烟 草 天 蛾 中 肠 BBMV上 Cry1Ab毒 素 的 受 体 BT-R1，证 明 它 是 一 种 类 钙 粘 蛋 白 (cadherin-like)。 尖 音 库 蚊 幼 虫 中 肠 中 球 形 芽 孢 杆 菌 晶 体 的 Bin毒素 受 体 可 能 是 一 种 -葡 糖 苷 酶 。 -内 毒 素 的 作 用 过 程 要 经 溶 解 、 酶 解 活 化 、 与 受体 结 合 、 插 入 、 孔 洞 或 离 子 通 道 形 成 等 五 个 环 节 。昆 虫 取 食 孢 子 和 毒 素 毒 素 被 蛋 白 酶 活 化毒 素 与 膜 受 体 结 合 毒 素 造 成 膜 穿 孔 使 细 胞 裂 解3. 杀 虫 晶 体 蛋 白 的 作 用 机 理 毒 素 的 溶 解 晶 体 蛋 白 可 以 溶 解 于 pH 12或 pH 9.5并 加 有 巯基 试 剂 的 碱 性 溶 液 中 。 中 肠 内 环 境 诸 如 pH值 、 还 原电 势 、 去 垢 性 、 体 积 等 都 可 能 影 响 -内 毒 素 在 昆 虫体 内 的 溶 解 性 。 鳞 翅 目 幼 虫 的 中 肠 pH值 一 般 都 较 高 ，呈 碱 性 , 对 -内 毒 素 的 溶 解 很 有 利 。3 杀 虫 晶 体 蛋 白 的 作 用 机 理 毒 素 的 活 化 溶 解 的 晶 体 蛋 白 被 中 肠 蛋 白 酶 水 解 ，由 130kD左 右 的 前 毒 素 ， 打 开 二 硫 键 ， 释 放 出 N 端 的70kD左 右 的 抗 酶 多 肽 活 力 片 段 。 活 力 片 段 至 少 由 两 部 分 组 成 , 即 毒 力 片 段 和 细 胞 结合 片 段 。 毒 力 片 段 位 于 N端 , 由 几 个 保 守 的 亲 水 区 组 成 ，主 要 结 构 是 -螺 旋 ， 对 于 跨 膜 通 道 的 形 成 及 毒 效 可 能 起着 重 要 作 用 。 细 胞 结 合 片 段 由 C端 的 保 守 区 和 中 间 的 可变 区 组 成 ， 主 要 结 构 是 -片 层 ， 负 责 毒 素 与 靶 标 昆 虫受 体 的 结 合 ， 从 而 决 定 了 毒 素 的 选 择 性 。 中 肠 酶 液 的 组成 直 接 影 响 到 -内 毒 素 的 降 解 活 化 , 对 -内 毒 素 作 用的 专 一 性 起 着 重 要 作 用 。 3 杀 虫 晶 体 蛋 白 的 作 用 机 理 毒 蛋 白 的 活 化 过 程被 昆 虫 取 食 的 晶 体 蛋 白 在 中 肠 被 溶 解碱 性 环 境 成 熟 毒 素被 中 肠 蛋 白 酶 消 化 活 化毒 素 的 活 化 3 杀 虫 晶 体 蛋 白 的 作 用 机 理 3 杀 虫 晶 体 蛋 白 的 作 用 机 理 毒 素 与 受 体 蛋 白 的 结 合 毒 素 被 活 化 以 后 ， 毒 素 首先 是 通 过 结 构 域 与 上 皮 细 胞 膜 上 的 受 体 蛋 白 发 生 专一 性 结 合 。 结 合 分 为 两 步 ， 第 一 步 即 初 始 结 合( Initial Binding)， 结 合 上 的 毒 素 可 以 再 次 与 受 体发 生 解 离 ， 故 又 称 可 逆 性 结 合 (Reversible Binding)；初 始 结 合 之 后 ， 毒 素 进 一 步 与 膜 受 体 蛋 白 发 生 紧 密 结合 或 直 接 插 入 细 胞 膜 ,此 时 的 毒 素 与 受 体 难 以 发 生 解 离 ,故 为 不 可 逆 性 结 合 ( Irreversible Binding)。 插 入 及 孔 洞 或 离 子 通 道 的 形 成 活 化 的 毒 素 与 刷 状缘 膜 上 的 受 体 结 合 后 ， 结 构 域 插 入 膜 内 ， 形 成 孔 洞或 离 子 通 道 ， 导 致 膜 完 整 性 的 破 坏 ， 引 起 离 子 渗 漏 ，水 随 之 进 入 细 胞 ， 细 胞 因 膨 胀 而 解 体 、 死 亡 。 3 杀 虫 晶 体 蛋 白 的 作 用 机 理 (+) 结 构 域 I -螺 旋 束 3 杀 虫 晶 体 蛋 白 的 作 用 机 理 结 构 域 在 杀 虫 蛋 白 中 的 作 用 Cry蛋 白 的 结 构 域 是 由 6-7个 两 亲 的 -螺 旋 围 绕 着 一 个 疏 水 的 中 心 螺 旋形 成 的 。 定 点 突 变 结 果 表 明 , 结 构 域 可 能 是 通 过 自 身 的 带 正 电 荷 残 基 与 带 负 电 荷 的 膜 表 面 接 触 的 。 对于 结 构 域 在 膜 上 形 成 穿 孔 的 机 制 ， 认 为 是 结 构 域 II在 完 成 毒 素-受 体 识 别 后 ， 结 构 域 受 毒 素 -受 体 结 合 的 诱 导 要 发 生 重 大 构 象变 化 ， 周 围 的 两 亲 -螺 旋 向 外 翻 ， 由 -4螺 旋 与 -5螺 旋 构 成的 “ 轴 ” 突 出 ， 4个 毒 素 分 子 的 -5螺 旋 相 互 靠 近 形 成 孔 道 的 内壁 ， 而 4个 -4螺 旋 则 形 成 孔 道 的 外 壁 ， 孔 道 穿 透 整 个 磷 脂 双 层 ， 细 胞 外 的 水 大 量 内 流 ， 导 致 细 胞 胀 裂 。 -5螺 旋 -4螺 旋-5螺 旋 细 胞 膜-4螺 旋 细 胞 膜图 2 Bt杀 虫 毒 蛋 白 作 用 的 伞 型 模 型 与 形 成 孔 道 原 理 示 意 图H2O 3 杀 虫 晶 体 蛋 白 的 作 用 机 理 结 构 域 由 3个 -折 叠 片 层 组成 ， 主 要 进 行 毒 素 与 受 体 蛋 白 的 特异 性 识 别 。 在 每 个 片 层 的 顶 端 各 有一 个 突 环 。 毒 素 与 受 体 的 作 用 主 要是 通 过 这 些 突 环 与 受 体 蛋 白 识 别 、并 进 一 步 不 可 逆 结 合 的 。 突 环 上 氨基 酸 组 成 和 残 基 的 带 电 性 、 侧 链 大小 及 疏 水 性 等 对 毒 素 与 受 体 的 专 一性 结 合 都 有 影 响 ， 删 除 突 环 或 改 变突 环 上 残 基 的 性 质 都 会 导 致 毒 素 与 受 体 结 合 能 力 的 严 重 丧 失 。 结 构 域 II -片 层 上 的 突 环结 构 域 在 毒 素 -受 体 结 合 中 的 作 用 3 杀 虫 晶 体 蛋 白 的 作 用 机 理 结 构 域 在 毒 素 -受 体 结 合 中 的 作 用 结 构 域 是 由两 组 反 平 行 的 -折 叠 片 层 组 成 的 三 明 治 结 构 。 通 过 交 换 不 同 毒 素 的结 构 域 发 现 ,该 结 构 域 对 毒素 的 杀 虫 专 一 性 有 一 定 影 响 。 结 构 域 也 参 与 了 毒 素与 受 体 的 结 合 。 结 构 域 与 受 体 结 合 及 离 子 通 道 活 性 的 调 节 有 关 。 不 同 品 系 的 Bt由 于 产 生 的 Cry蛋 白 类 型 不 同 ， 不仅 杀 虫 谱 不 同 ， 而 且 很 可 能 拥 有 不 同 的 作 用 方 式 。 总之 ， Bt内 毒 素 在 进 入 昆 虫 中 肠 后 ， 先 是 在 碱 性 条 件 下溶 解 ， 然 后 被 活 化 为 小 分 子 多 肽 ,再 与 中 肠 内 膜 上 的刷 缘 状 膜 小 泡 （ BBMV） 中 特 异 受 体 结 合 ， 毒 素 分 子 插入 质 膜 形 成 一 个 微 孔 ， 阳 离 子 和 小 分 子 渗 入 ， 这 些 微孔 因 渗 透 肿 胀 而 变 大 ， 最 终 细 胞 破 裂 。 昆 虫 中 肠 上 皮细 胞 死 亡 ， 肠 壁 受 损 ， 肠 道 内 容 物 进 入 血 淋 巴 ， 直 接造 成 血 淋 巴 pH值 上 升 可 使 昆 虫 麻 痹 死 亡 ； 毒 性 肽 进 入血 淋 巴 可 使 昆 虫 患 毒 血 症 死 亡 ； 活 细 胞 或 孢 子 进 入 血腔 可 使 昆 虫 患 败 血 症 死 亡 。 3 杀 虫 晶 体 蛋 白 的 作 用 机 理 二 氢 沉 香 呋 喃 类 化 合 物 ： 苦 皮 藤 素 、 、 等 可 致粘 虫 ： 中 肠 柱 状 细 胞 的 微 绒 毛 排 列 不 整 齐 ， 大 量 脱 落 ；基 膜 内 褶 空 间 变 大 ， 排 列 紊 乱 ； 细 胞 质 密 度 降 低 ； 内质 网 极 度 扩 张 ， 囊 泡 化 ， 核 糖 体 脱 落 ； 线 粒 体 嵴 模 糊不 清 楚 ， 双 层 膜 不 完 整 。 推 测 其 机 理 为 ： 此 类 化 合 物与 昆 虫 中 肠 细 胞 膜 及 内 膜 结 合 ， 膜 系 统 结 构 发 生 改 变 ，水 分 和 各 种 离 子 的 通 透 性 随 之 改 变 ， 引 起 细 胞 肿 胀 、失 水 、 瓦 解 ， 最 终 死 亡 。 推 测 其 机 理 为 ： 此 类 化 合 物与 昆 虫 中 肠 细 胞 膜 及 内 膜 结 合 ， 膜 系 统 结 构 发 生 改 变 ，水 分 和 各 种 离 子 的 通 透 性 随 之 改 变 ， 引 起 细 胞 肿 胀 、失 水 、 瓦 解 ， 最 终 死 亡 。 二 、 其 他 消 化 毒 剂 饥 饿 对 照 处 理正 常 对 照 脱 氧 鬼 臼 毒 素 对 菜 青 虫 组 织 结 构 的 影 响浑 浊 溃 烂 状 肠 道 内 无 食 物 残渣 ， 呈 黄 色 透 明鬼 臼 毒 素 类 化 合 物 CK 12h 24h72h48h36h 组织学观察结果：中 肠 围 食 膜 逐 渐 消 融 ， 几 乎 完 全 消 失 。 对 照 试 虫 中 肠饥 饿 试 虫 中 肠 处 理 试 虫 中 肠CK 中 肠 完 好 ,厚 度 较 均 匀 ， 细 胞间 隙 小 ， 而 处 理 中 肠 肠 壁 细 胞 逐渐 变 得 浑 浊 不 连 续 ， 且 中 肠 细 胞松 散 ， 细 胞 间 隙 拉 大 ， 中 肠 肠 壁细 胞 间 的 气 泡 明 显 增 多 。 这 可 能是 由 于 脱 氧 鬼 臼 毒 素 作 用 于 试 虫的 肠 壁 细 胞 ， 肠 壁 细 胞 被 破 坏 ，肠 壁 细 胞 外 液 得 以 内 渗 ， 导 致 肠壁 细 胞 肿 胀 。组 织 学 观 察 结 果 处 理 中 肠 微 绒 毛对 照 中 肠 微 绒 毛 组织学观察结果： 丁 布 ： 可 阻 碍 欧 洲 玉 米 螟 幼 虫 和 亚 洲 玉 米 螟 幼 虫 的 发 育 ，使 得 幼 虫 体 重 降 低 ， 发 育 迟 缓 ， 蛹 重 降 低 ， 并 出 现 畸 形蛹 等 ， 并 对 亚 洲 玉 米 螟 幼 虫 具 有 较 强 的 拒 食 作 用 。 丁 布是 一 种 消 化 抑 制 剂 ， 可 抑 制 胰 蛋 白 酶 和 胰 凝 乳 蛋 白 酶 的活 性 而 影 响 食 物 的 消 化 ， 进 而 影 响 昆 虫 的 生 长 发 育 。 丁布 作 用 于 玉 米 螟 的 中 肠 细 胞 ， 使 肠 壁 细 胞 再 生 细 胞 大 量分 裂 ， 打 破 了 固 有 的 分 裂 周 期 ， 造 成 局 部 肿 瘤 ， 进 而 细胞 消 融 。 急 剧 增 长 的 肿 瘤 细 胞 消 耗 大 量 的 能 量 ， 而 且 受损 的 肠 壁 细 胞 不 再 具 备 分 泌 消 化 酶 进 行 消 化 和 吸 收 营 养物 质 的 功 能 ， 因 而 造 成 幼 虫 缺 乏 营 养 而 死 亡 。