PCR技术的原理与方法课件.ppt

PCR技 术 的 原 理 与 方 法 钟 召 迪 PCR定 义l 聚 合 酶 链 反 应 (Polymerase Chain Reaction)简 称 ， 是 一 项 在 短 时 间内 大 量 扩 增 特 定 的 片 段 的 分 子 生 物学 技 术 。l 是 指 在 DNA 聚 合 酶 的 催 化 下 ， 以 母 链 DNA 为 模 板 ， 一 特 定 引 物 为 延 伸 起 点 ， 经 过 变性 、 退 火 、 延 伸 等 步 骤 ， 体 外 复 制 出 于 母链 模 板 DNA互 补 的 子 链 DNA的 过 程 。l 可 用 于 基 因 分 离 克 隆 ， 序 列 分 析 ， 基 因表 达 调 控 ， 基 因 多 态 性 研 究 等 。 PCR反 应 特 点l特 异 性 强l灵 敏 度 高l简 便 、 快 速l对 标 本 的 纯 度 要 求 低 PCR技 术 的 基 本 原 理lPCR的 反 应 成 分lPCR的 反 应 基 本 步 骤lPCR的 反 应 体 系 PCR的 反 应 成 分l模 板 DNA l引 物l四 种 脱 氧 核 糖 核 苷 酸lDNA聚 合 酶l反 应 缓 冲 液 ， Mg2 PCR的 反 应 基 本 步 骤lPCR的 反 应 基 本 步 骤l变 性 ： 高 温 使 双 链 DNA解 离 成 单 链 （ 94 ， 30s）l退 火 ： 低 温 下 ， 引 物 与 DNA模 板 互 补 区 结合 （ 55 ， 30s ）l延 伸 ： 中 温 延 伸 ， DNA聚 合 酶 催 化 以 引 物为 起 点 的 DNA链 延 伸 反 应 （ 7072 ，3060s） PCR的 反 应 体 系 10 扩 增 缓 冲 液 1/10体 积 4种 dNTP混 合 物 各 200umol/L 引 物 (2个 ) 0.2umol/L 模 板 DNA 102 105 Taq DNA聚 合 酶 1 2.5单 位 /反 应 体 系 Mg2+ 1.5 2.5mmol/L 加 双 或 三 蒸 水 至 25 50ul PCR反 应 五 要 素l引 物 （ primer）l 酶 （ Taq DNA polymerase） l dNTP （ dATP,dGTP,dCTP,dTTP） l模 板 （ template） lMg2+ （ magnesium） 引 物l引 物 是 PCR特 异 性 反 应 的 关 键lPCR 产 物 的 特 异 性 取 决 于 引 物 与 模 板 DNA互 补 的 程 度l理 论 上 ， 只 要 知 道 任 何 一 段 模 板 DNA序 列 ，就 能 按 其 设 计 互 补 的 寡 核 苷 酸 链 做 引 物 ，用 PCR就 可 将 模 板 DNA在 体 外 大 量 扩 增 引 物 设 计 的 原 则l引 物 最 好 在 模 板 cDNA的 保 守 区 内 设 计l引 物 长 度 一 般 在 1530碱 基 之 间l引 物 GC含 量 在 40%60%之 间 ， Tm值 最 好 接近 72l引 物 3 端 要 避 开 密 码 子 的 第 3位l引 物 3 端 不 能 选 择 A， 最 好 选 择 Tl碱 基 要 随 机 分 布l引 物 自 身 及 引 物 之 间 不 应 存 在 互 补 序 列 引 物 设 计 的 原 则l引 物 5 端 和 中 间 G值 应 该 相 对 较 高 ，而 3 端 G值 较 低l引 物 的 5 端 可 以 修 饰 ， 而 3 端 不 可 修 饰l扩 增 产 物 的 单 链 不 能 形 成 二 级 结 构l引 物 应 具 有 特 异 性 酶 及 其 浓 度l目 前 有 两 种 Taq DNA 聚 合 酶 供 应 天 然 酶 ： 从 栖 热 水 生 杆 菌 中 提 纯 基 因 工 程 酶 ： 大 肠 菌 合 成l一 个 典 型 的 PCR反 应 约 需 酶 量 2.5U（ 指总 反 应 体 积 为 100 ul时 ）l浓 度 过 高 可 引 起 非 特 异 性 扩 增 ， 浓 度 过 低则 合 成 产 物 量 减 少 DNTP 的 质 量 与 浓 度dNTP的 质 量 与 浓 度 和 PCR扩 增 效 率 有 密 切 关 系dNTP呈 颗 粒 状 ， 保 存 不 当 易 变 性 失 活dNTP溶 液 呈 酸 性 ， 使 用 时 应 配 成 高 浓 度 后 ，以 1M NaOH或 1M Tris-HCl的 缓 冲 液 将 其 pH调 节 到 7.0 7.5， 小 量 分 装 ， -20 冰 冻 保存 。 多 次 冻 融 会 使 dNTP降 解在 PCR反 应 中 ， dNTP应 为 50 200umol/L， 尤其 是 注 意 4种 dNTP的 浓 度 要 相 等 （ 等 摩 尔 配制 ） ， 如 其 中 任 何 一 种 浓 度 不 同 于 其 它几 种 时 （ 偏 高 或 偏 低 ） ， 就 会 引 起 错 配 。浓 度 过 低 又 会 降 低 PCR产 物 的 产 量dNTP 能 与 Mg 2+结 合 ， 使 游 离 的 Mg2+浓 度 降 低 模 板 （ 靶 基 因 ， TARGET GENE）l模 板 核 酸 的 量 与 纯 化 程 度 ， 是 PCR成 败 与否 的 关 键 环 节 之 一l传 统 的 DNA纯 化 方 法 通 常 采 用 SDS和 蛋 白 酶K 来 消 化 处 理 标 本SDS 的 主 要 功 能 是 ： 溶 解 细 胞 膜 上 的 脂 类 与 蛋 白 质 ，因 而 溶 解 膜 蛋 白 而 破 坏 细 胞 膜 ， 并 解 离 细 胞 中 的核 蛋 白 ， SDS 还 能 与 蛋 白 质 结 合 而 沉 淀蛋 白 酶 K 能 水 解 消 化 蛋 白 质 ， 特 别 是 与 DNA结 合 的 组蛋 白 , 再 用 有 机 溶 剂 酚 与 氯 仿 抽 提 掉 蛋 白 质 和 其它 细 胞 组 份 ， 用 乙 醇 或 异 丙 醇 沉 淀 核 酸 MG2+浓 度lMg2+对 PCR扩 增 的 特 异 性 和 产 量 有 显 著 的 影响l在 一 般 的 PCR反 应 中 ， 各 种 NTP浓 度 为200umol/L时 ， Mg2+浓 度 为 1.5 2.0 mmol/L为 宜lMg2+浓 度 过 高 ， 反 应 特 异 性 降 低 ， 出 现 非特 异 扩 增 ， 浓 度 过 低 会 降 低 Taq DNA聚合 酶 的 活 性 ， 使 反 应 产 物 减 少 PCR反 应 条 件 的 选 择 PCR反 应 条 件 : 温 度 时 间 循 环 次 数 温 度 与 时 间 的 设 置l设 置 变 性 -退 火 -延 伸 三 个 温 度 点l标 准 反 应 中 采 用 三 温 度 点 法 ， 双 链 DNA在90 95 变 性 ， 再 迅 速 冷 却 至 40 60 ，引 物 退 火 并 结 合 到 靶 序 列 上 ， 然 后 快 速 升温 至 70 75 ， 在 Taq DNA 聚 合 酶 的 作 用下 ， 使 引 物 链 沿 模 板 延 伸l对 于 较 短 靶 基 因 （ 长 度 为 100 300bp时 ）可 采 用 二 温 度 点 法 ， 将 退 火 与 延 伸 温 度合 二 为 一 ， 一 般 采 用 94 变 性 ， 65 左 右退 火 与 延 伸 变 性 温 度 与 时 间l变 性 温 度 低 ， 解 链 不 完 全 是 导 致 PCR失 败的 最 主 要 原 因l一 般 93 94 lmin足 以 使 模 板 DNA变 性 若 低 于 93 则 需 延 长 时 间 但 温 度 不 能 过 高 ， 因 为 高 温 环 境 对 酶 的活 性 有 影 响 。l此 步 若 不 能 使 靶 基 因 模 板 或 PCR产 物 完 全变 性 ， 就 会 导 致 PCR失 败 退 火 (复 性 )温 度 与 时 间l退 火 温 度 是 影 响 PCR特 异 性 的 较 重 要 因 素l变 性 后 温 度 快 速 冷 却 至 40 60 ， 可 使引 物 和 模 板 发 生 结 合 。 由 于 模 板 DNA 比 引物 复 杂 得 多 ， 引 物 和 模 板 之 间 的 碰 撞 结 合机 会 远 远 高 于 模 板 互 补 链 之 间 的 碰 撞l退 火 温 度 与 时 间 ， 取 决 于 引 物 的 长 度 、 碱基 组 成 及 其 浓 度 ， 还 有 靶 基 序 列 的 长 度l对 于 20个 核 苷 酸 ， G+C含 量 约 50%的 引 物 ，55 为 选 择 最 适 退 火 温 度 的 起 点 较 为 理 想 延 伸 温 度 与 时 间l 延 伸 温 度 ： 一 般 选 择 在 70 75 之 间 常 用 温 度 为 72 过 高 的 延 伸 温 度 不 利 于 引 物 和 模 板 的 结 合 。l 延 伸 反 应 时 间 ： 根 据 待 扩 增 片 段 长 度 而 定 1Kb以 内 的 DNA片 段 ， 延 伸 时 间 1min（ 足 够 ） 3 4kb的 靶 序 列 需 3 4min 扩 增 10Kb需 延 伸 至 15minl 延 伸 进 间 过 长 会 导 致 非 特 异 性 扩 增 l 对 低 浓 度 模 板 的 扩 增 ， 延 伸 时 间 要 稍 长 些 循 环 次 数l循 环 次 数 决 定 PCR扩 增 程 度l循 环 次 数 主 要 取 决 于 模 板 DNA的 浓 度l循 环 次 数 ： 选 在 30 40次 之 间l循 环 次 数 越 多 ， 非 特 异 性 产 物 的 量 亦 随 之增 多 谢 谢 ！