PI染色法测细胞周期课件.ppt

PI染 色 法 测 细 胞 周 期 一 ） 细 胞 DNA含 量 检 测（ Propidium iodide碘 化 丙 啶 ） ， 单 参 数 直 方 图 图 中 2N代 表 G0/G1期 细 胞 ， 4N代 表 G2/M期 细 胞 ， 两 者 中 间 代 表S期 细 胞 。 这 是 以 2倍 体 和 4倍 体 细 胞 为 主 的 流 式 DNA图 DNA细 胞 周 期 分 析细 胞 周 期 200 400 600 800 1000DNA含 量细胞数量 2倍 体 异 倍 体 4倍 体肿 瘤 组 织 中 的 各 种 DNA倍 体 含 量 与 凋 亡 关 系n DNA亚 G1峰 的 检 测 ： 利 用 PI染 色 ， 检 测 具 有亚 G1期 DNA含 量 的 细 胞 比 例 ， 代 表 凋 亡 细 胞数 。n 凋 亡 过 程 中 ， 细 胞 内 核 酸 酶 的 释 放 ， 将 DNA降解 ， 分 解 成 小 的 片 段 ， 在 标 本 制 备 中 的 固 定 处理 时 ， 细 胞 膜 的 完 整 性 被 破 坏 ， 使 细 胞 内 降 解的 DNA片 段 从 细 胞 内 流 出 ， 造 成 总 体 DNA含量 减 少 ， 成 为 亚 2倍 体 。 2. 凋亡研究n在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，即凋亡峰。n检测调亡，可进行抗肿瘤药物研究和某些因素对细胞的损伤机理的研究。 Annexin V Assay R1 File: 4 Acquisition Date: 06-Mar-03 Quad Events % Gated X Mean Y Mean UL 254 2.40 37.47 461.36 UR 1067 10.08 816.86 468.89 LL 5291 49.98 19.57 4.41 LR 3975 37.55 418.80 9.87图 Annexin V/PI双 标 记 分 析 细 胞 凋 亡 和 坏 死 Date acquired: 14-Jan-03File: 7Gy 4hr.001Source: dongboDIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48 R1 图 FCM测 试 细 胞 周 期 分 布 和 凋 亡 根 据 凋 亡 细 胞 的 特 点 来 检 测n 在 形 态 上 ， 早 期 细 胞 核 固 缩 ， 染 色 体 边 集 在 核膜 内 侧 显 新 月 体 形 、 核 碎 裂 ； 细 胞 浆 和 细 胞 器密 度 增 高 、 细 胞 体 积 变 小 ； 细 胞 膜 皱 折 卷 曲 ，但 早 期 细 胞 膜 的 完 整 性 未 受 到 破 坏n凋亡细胞的FSC ？SSC ？n细胞坏死时，细胞肿胀，FSC ？，SSC ？ n 正 常 人 静 止 体 细 胞 有 46条 染 色 体 ， 相 当于 7.10-12 pg DNA/细 胞 核 ， 我 们 称 之 为二 倍 体 细 胞 ， 而 正 常 增 殖 细 胞 则 存 在 不同 的 DNA含 量 。 在 细 胞 周 期 (G0， G1， S，G2 ， M)的 各 个 时 期 ， DNA含 量 随 各 时 相呈 现 出 周 期 性 的 变 化 ： 在 G1期 ， 细 胞 开始 RNA和 蛋 白 质 的 合 成 ， 但 DNA含 量 仍 保持 二 倍 体 ； n 进 入 S期 后 ， DNA开 始 合 成 ， 这 时 细 胞 核 内 DNA的含 量 介 于 G1和 G2期 之 间 ； 当 DNA复 制 结 束 成 为 4倍体 时 ， 细 胞 进 入 G2期 ， G2期 细 胞 继 续 合 成 RNA及蛋 白 质 ， 直 到 进 入 M期 ， 因 此 ， 单 纯 从 DNA含 量 无法 区 分 G2期 和 M期 ； 一 旦 有 丝 分 裂 发 生 ， 细 胞 分裂 成 两 个 子 细 胞 ， 这 两 个 子 细 胞 或 者 进 入 下 一 个细 胞 周 期 ， 或 者 进 入 静 止 期 (G0期 )， 而 G0期 从DNA含 量 上 同 样 无 法 与 G1期 区 分 。 因 此 ， 整 个 复制 周 期 可 以 描 述 为 G0/G1， S， G2/M期 。 n 通 过 核 酸 染 料 标 记 DNA， 并 由 流 式 细 胞 仪进 行 分 析 ， 可 以 得 到 细 胞 各 个 时 期 的 分布 状 态 ， 计 算 出 G0/G1， S及 G2/M的 百 分含 量 ， 了 解 细 胞 的 增 殖 能 力 ； 结 合 DNA指数 分 析 ， 还 可 进 行 凋 亡 、 异 倍 体 等 检 测 。 0 200 400 600 800 1000DNA contentCount Normal Cell Cycle 细 胞 浓 度 及 质 量 要 求n 单 细 胞 和 核 的 上 机 浓 度 应 约 106/ml。 浓 度太 低 ， 上 机 时 样 本 的 流 速 不 得 不 提 高 ，这 样 就 会 影 响 检 测 的 CV。 浓 度 太 高 ， 则可 能 导 致 染 料 的 相 对 不 足 ， 最 终 使 染 色不 饱 和 ， 同 样 影 响 CV和 检 测 结 果 。n 制 备 完 成 后 的 标 本 应 用 光 学 显 微 镜 检 查其 质 量 ： 细 胞 是 否 聚 集 或 过 多 的 碎 片 。 n 染 料 的 选 择 取 决 于 流 式 激 光 的 配 置 。488nm的 激 光 下 应 用 PI(碘 化 丙 啶 )， 由 于PI也 与 RNA结 合 ， 所 以 分 析 前 样 本 应 用Rnase处 理 .。 重 要 的 是 染 料 要 足 够 ， 以保 证 饱 和 结 合 。 PI的 推 荐 浓 度 是 至 少20ug/106 个 细 胞 。 其 最 佳 浓 度 为50ug/106 个 细 胞 。 操 作 步 骤 n 取 一 瓶 生 长 期 的 A549细 胞 ， 倒 掉 瓶 中 旧 的 培养 液 ， 加 入 3mlPBS， 细 胞 生 长 面 在 下 轻 轻 晃动 细 胞 瓶 ， 然 后 去 掉 液 体 ， 加 入 1ml胰 蛋 白 酶消 化 15分 钟 （ 以 镜 下 观 察 决 定 ）n 加 入 5mlPBS轻 轻 吹 打 细 胞 生 长 面 ， 制 成 细 胞悬 液 ， 将 细 胞 悬 液 移 至 15ml离 心 管 中1500rpm离 心 5min， 去 上 清 。n 加 入 500ulPBS轻 轻 吹 打 细 胞 团 成 细 胞 悬 液 ，在 旋 涡 状 态 下 逐 滴 加 入 2ml-20 95%冷 乙 醇 ，混 匀 后 固 定 30min。 n 加 入 5mlPBS， 1500rpm离 心 5min， 去上 清 液 。n 加 入 5mlPBS重 悬 细 胞 ， 1500rpm离 心5min， 去 上 清 液 。n 加 入 800ulPI染 液 ， 用 枪 轻 轻 吹 打 细 胞团 ， 混 匀 ， 室 温 避 光 染 色 30minn 上 机 检 测 。 影 响 荧 光 染 色 的 因 素 n 温 度 ： 温 度 高 于 20 时 ， 即 出 现 温 度 淬 灭 。n 2、 PH： PI在 7.27.6， 保 持 荧 光 染 料 分 子与 溶 剂 间 的 电 离 平 衡 。n 3、 荧 光 染 料 浓 度 ： 染 料 太 少 ， 结 合 不 完全 。 染 料 过 多 ， 又 会 出 现 浓 度 淬 灭 现 象 。n 4、 固 定 剂 ： 醛 类 固 定 剂 会 干 扰 插 入 性 染料 与 核 酸 分 子 的 结 合 ， 造 成 荧 光 发 射 强 度减 弱 。