端粒、端粒酶与肿瘤

端 粒 为 真 核 细 胞 染 色 体 末 端 的 特 殊 结 构 -DNA多 个 重 复 序 列 。 生 物 体 内 染 色 体 末 端 的 端 粒 处 于不 断 地 缩 短 或 缩 短 和 延 长 的 变 化 之 中 。 端 粒 酶 能不 断 地 延 长 染 色 体 末 端 已 缩 短 的 端 粒 ， 是 恶 性 肿瘤 生 长 必 需 酶 。 在 不 表 达 端 粒 酶 的 正 常 细 胞 中 ， 位 于 染 色 体 末端 的 端 粒 DNA在 连 续 的 细 胞 分 裂 中 逐 渐 丧 失 ， 当端 粒 缩 短 到 临 界 长 度 时 ， 细 胞 增 殖 停 止 。 在 癌 细胞 中 ， 端 粒 酶 刺 激 端 粒 DNA的 重 新 合 成 。 因 此 ，端 粒 不 会 缩 短 ， 细 胞 增 殖 以 不 受 抑 制 的 状 态 继 续进 行 。 第十章 端粒、端粒酶与肿瘤 端 粒 (telomere)n 端 粒 是 真 核 细 胞 内 染 色 体 末 端 的 蛋白 质 -DNA结 构 ， 其 功 能 是 完 成 染 色 体末 端 的 复 制 ， 防 止 染 色 体 免 遭 融 合 、重 组 和 降 解 .从 单 细 胞 的 有 机 体 到 高 等的 动 植 物 ， 端 粒 的 结 构 和 功 能 都 很 保守 . n端 粒 DNA 大 多 数 有 机 体 的 端 粒 DNA由 非 常 短 而 且数 目 精 确 的 串 联 重 复 DNA排 列 而 成 ， 富 含鸟 嘌 呤 .个 别 种 类 的 端 粒 DNA重 复 单 元 很 长 .端 粒 的 DNA序 列 多 种 多 样 ， 其 功 能 不 需 要独 特 的 序 列 来 维 持 .尽 管 在 许 多 物 种 中 端 粒DNA有 相 当 大 的 变 化 ， 但 仍 可 在 进 化 关 系非 常 远 的 生 物 中 发 现 相 同 的 端 粒 序 列 ， 端 粒 DNA的 平 均 长 度 因 物 种 而 异 .在 人 大约 15 kb， 在 人 体 中 ， 随 着 细 胞 的 持 续 分 裂 ，端 粒 会 缓 慢 缩 短 . n端 粒 结 合 蛋 白 目 前 对 端 粒 结 合 蛋 白 还 了 解 甚 少 .在 酵母 中 ， 端 粒 的 主 要 结 合 蛋 白 是 Rap1p， 在 体外 以 很 高 的 亲 和 性 与 端 粒 上 的 许 多 识 别 位点 相 结 合 ， Rap1p与 端 粒 长 度 的 调 节 有 关 ，Rap1p能 够 阻 止 端 粒 酶 接 近 端 粒 从 而 负 调 节端 粒 的 长 度 .相 反 ， 有 人 说 ， Rap1p可 以 在端 粒 周 围 通 过 聚 集 端 粒 酶 或 提 高 端 粒 酶 活性 而 延 长 端 粒 . 因 此 末 端 限 制 性 结 合 蛋 白 可能 是 端 粒 染 色 质 的 一 个 普 通 特 性 . n端 粒 酶 (telomerase) 端 粒 酶 是 一 种 核 糖 核 蛋 白 ,自 身 携 带模 板 的 反 转 录 酶 ， 催 化 端 粒 DNA的 合成 ， 能 够 在 缺 少 DNA模 板 的 情 况 下 ,能够 以 自 身 携 带 的 RNA为 模 板 ， 逆 转 录合 成 端 粒 DNA并 添 加 于 染 色 体 末 端 ，从 而 维 持 了 端 粒 长 度 的 稳 定 。 端 粒 酶 活 性 取 决 于 它 的 RNA和 蛋 白 质 亚基 .端 粒 酶 至 少 包 含 两 个 活 性 位 点 .端 粒 酶 除了 具 有 反 转 录 活 性 外 ， 还 具 有 核 酸 内 切 酶的 活 性 。 另 外 一 个 重 要 的 功 能 就 是 合 成 串联 重 复 的 TTAGGG序 列 ， 为 TRF2提 供 结 合位 点 ， 防 止 染 色 体 的 末 端 融 合 . 端 粒 酶 的 RNA亚 基 是 合 成 端 粒 DNA的模 板 ， 对 于 端 粒 酶 的 结 构 和 催 化 活 性 都 十分 重 要 .人 端 粒 酶 RNA有 455个 核 苷 酸 .端 粒酶 RNA重 要 序 列 缺 乏 保 守 性 ， 但 都 有 保 守的 二 级 结 构 .， 端 粒 酶 的 RNA决 定 了 端 粒DNA的 序 列 . 端 粒 酶 能 不 断 地 延 长 染 色 体 末 端 已 缩 短的 端 粒 ， 是 恶 性 肿 瘤 生 长 必 需 酶 。 在 不 表 达 端 粒 酶 的 正 常 细 胞 中 ， 位 于 染色 体 末 端 的 端 粒 DNA在 连 续 的 细 胞 分 裂 中逐 渐 丧 失 ， 当 端 粒 缩 短 到 临 界 长 度 时 ， 细胞 增 殖 停 止 。 在 癌 细 胞 中 ， 端 粒 酶 刺 激 端粒 DNA的 重 新 合 成 。 因 此 ， 端 粒 不 会 缩 短 ，细 胞 增 殖 以 不 受 抑 制 的 状 态 继 续 进 行 。 一 、 端 粒 的 发 现 Muller和 Mcdintock发 现 染 色 体 末 端 结 构 对 保持 染 色 体 的 稳 定 是 十 分 重 要 的 。 Muller将 这 一 结构 命 名 为 端 粒 （ telomere） , 如 果 末 端 没 有 这 个 结构 ， 染 色 体 将 相 互 粘 着 而 发 生 结 构 和 功 能 异 常 ，直 到 70年 代 人 们 才 在 四 膜 虫 （ 一 种 单 核 细 胞 生 物 ）中 证 实 了 这 种 端 粒 结 构 ， 为 极 简 单 的 个 核 苷 酸TTGGGG序 列 多 次 重 复 。 以 后 ， 人 们 在 多 种 生 物体 包 括 动 物 、 植 物 和 微 生 物 中 均 证 实 有 端 粒 的 存在 。 所 有 的 端 粒 包 括 人 、 鼠 和 其 他 脊 椎 动 物 均 表现 为 富 含 T和 G核 苷 酸 的 DNA重 复 序 列 。 人 类 端粒 的 结 构 为 染 色 体 末 端 TTGGGG序 列 上 千 次 的 重复 。 1972年 James Watson提 出 复 制 末 端 问 题 ，复 制 DNA的 DNA多 聚 酶 不 能 将 线 性 染 色 体的 DNA完 全 复 制 。 也 就 是 说 在 线 性 染 色 体的 DNA复 制 时 ， DNA多 聚 酶 留 下 染 色 体 末端 一 段 DNA（ 一 段 端 粒 ） 不 被 复 制 。 这 样真 核 细 胞 染 色 体 末 端 的 端 粒 就 会 随 着 细 胞分 裂 而 缩 短 ， 这 个 缩 短 的 端 粒 再 传 给 子 细胞 后 ， 随 着 细 胞 的 再 一 次 分 裂 进 一 步 缩 短 。细 胞 每 次 分 裂 ， 染 色 体 末 端 端 粒 逐 渐 缩 短 ，直 至 细 胞 衰 老 。 人 类 体 细 胞 遵 循 这 个 规 律从 细 胞 出 生 到 细 胞 衰 老 。 端 粒 确 实 随 着 每 次 细 胞 分 裂 而 缩 短 ，但 能 被 新 合 成 的 端 粒 片 段 再 延 长 ，1984年 首 先 在 四 膜 虫 中 证 实 了 有 这 种能 使 端 粒 延 长 的 酶 的 存 在 端 粒 酶 。 端 粒 酶 为 一 种 核 糖 核 蛋 白 酶 ， 端 粒的 合 成 是 以 一 段 RNA为 模 板 ， 端 粒 酶通 过 反 转 录 过 程 合 成 端 粒 片 段 并 使 其连 接 于 染 色 体 的 端 粒 末 端 。 端 粒 酶 的发 现 解 释 了 自 然 界 如 单 细 胞 生 物 是 如何 处 理 “ 复 制 末 端 问 题 ” 二 、 人 各 种 组 织 端 粒 酶 活 性 分 析 端 粒 的 长 度 可 以 作 为 反 映 细 胞 分 裂 能力 的 “ 分 子 钟 ” 。 恶 性 肿 瘤 主 要 表 现 为 细胞 失 去 控 制 的 无 限 增 殖 ， 造 成 对 机 体 的 损害 。 如 果 恶 性 肿 瘤 细 胞 缺 乏 端 粒 酶 ， 随 着细 胞 分 裂 染 色 体 末 端 的 端 粒 逐 渐 缩 短 ， 当端 粒 长 度 缩 短 到 一 定 程 度 时 ， 细 胞 进 入 衰老 阶 段 ， 停 止 分 裂 将 不 造 成 机 体 损 害 ； 但恶 性 肿 瘤 内 端 粒 酶 的 存 在 ， 将 不 断 地 延 长已 缩 短 的 端 粒 ， 使 恶 性 肿 瘤 显 示 无 限 制 的增 殖 能 力 。 n 检 测 方 法 ：1.引 物 延 伸 分 析 法 ： （ primer-extention assay） 检 测 细 胞 或 组 织 的 端 粒 酶 活 性 需 大 量 的 细 胞 及长 时 间 放 射 自 显 影 ， 所 得 的 信 号 弱 。 1994年 有 人在 恶 性 肿 瘤 组 织 中 检 测 到 端 粒 酶 活 性 。2.端 粒 重 复 扩 增 分 析 法 （ telomerie repeat amplification protocol assay,TRAP） 技 术 ： PCR技术 以 检 测 端 粒 酶 活 性 ， 检 测 组 织 的 端 粒 酶 活 性3.在 引 物 方 面 作 了 改 进 ,相 继 建 立 了 荧 光 法 、 原 位 端粒 重 复 片 段 扩 增 法 及 TRAP与 闪 烁 技 术 联 用 的SPA法 等 敏 感 的 检 测 手 段 ， 在 医 疗 检 测 中 得 到 了迅 速 的 应 用 . 分 析 对 正 常 组 织 、 良 性 病 变 及 恶 性 肿瘤 组 织 端 粒 酶 活 性 结 果 ：1.正 常 组 织 中 ， 除 生 殖 细 胞 和 部 分 造 血 干 细胞 显 示 微 弱 的 端 粒 酶 活 性 外 ， 均 无 端 粒 酶活 性 。2.良 性 病 变 组 织 中 除 个 别 病 例 有 很 微 弱 的 端粒 酶 活 性 外 ， 如 肝 炎 、 肝 硬 化 、 良 性 脑 膜瘤 ， 绝 大 多 数 病 例 均 显 示 端 粒 酶 活 性 阴 性 。3.恶 性 肿 瘤 组 织 恰 恰 相 反 ， 绝 大 多 数 恶 性 肿瘤 组 织 均 显 示 明 显 的 端 粒 酶 活 性 。 神 经 细胞 瘤 和 胃 癌 组 织 中 端 粒 酶 高 表 达 病 例 生 存期 明 显 低 于 端 粒 酶 的 低 表 达 病 例 。 4.人 组 织 胚 胎 和 发 育 过 程 中 端 粒 酶 活 性 ： 在 胚 胎 、 新 生 儿 和 成 人 的 睾 丸 和 卵 巢组 织 中 始 终 具 有 端 粒 酶 活 性 ， 但 成 熟 的 精子 和 卵 子 无 酶 活 性 。 除 脑 组 织 外 ， 胚 胎 发育 的 第 16-20周 ， 所 有 母 细 胞 组 织 中 均 有 明显 的 端 粒 酶 活 性 。 端 粒 酶 在 新 生 儿 外 周 血细 胞 和 未 满 月 婴 儿 包 皮 组 织 中 显 示 活 性 。除 生 殖 细 胞 外 ， 出 生 后 个 月 的 婴 儿 任 何体 细 胞 未 见 端 粒 酶 活 性 。 正 常 体 细 胞 、 肿 瘤 细 胞 和 人 组 织 胚 胎及 发 育 过 程 中 ， 端 粒 酶 活 性 不 同 。 机 体 发育 成 熟 后 ， 体 细 胞 端 粒 酶 均 被 抑 制 ， 其 端粒 随 着 每 次 的 细 胞 分 裂 逐 渐 缩 短 ， 当 端 粒完 全 或 几 乎 完 全 丢 失 后 ， 细 胞 将 灭 亡 或 死亡 。 当 端 粒 短 至 一 定 阈 值 时 会 发 出 某 种 信号 使 细 胞 不 再 分 裂 。 某 种 促 癌 基 因 突 变 阻止 信 号 发 出 或 使 细 胞 不 理 会 信 号 时 ， 细 胞将 绕 过 正 常 的 衰 老 过 程 继 续 分 裂 ， 染 色 体末 端 的 端 粒 将 继 续 缩 短 并 使 染 色 体 异 常 ，最 后 可 能 引 起 癌 基 因 突 变 。 染 色 体 异 常 引 起 的 基 因 重 排 能 使 被抑 制 的 端 粒 酶 重 新 激 活 ， 激 活 的 端 粒酶 将 重 新 填 补 已 缩 短 的 端 粒 是 细 胞 获得 或 保 持 无 限 的 分 裂 能 力 变 成 恶 性 肿瘤 细 胞 。 三 、 端 粒 酶 与 肿 瘤 诊 断 和 治 疗 由 于 端 粒 酶 活 性 见 于 绝 大 多 数 恶性 肿 瘤 ， 而 人 正 常 细 胞 中 未 见 该 酶 活性 ， 端 粒 酶 活 性 为 恶 性 肿 瘤 的 诊 断 和治 疗 带 来 了 希 望 。 首 先 ， 端 粒 酶 活 性的 检 测 有 希 望 成 为 早 期 恶 性 肿 瘤 的 标志 物 ， 若 能 将 转 移 癌 细 胞 与 外 周 血 细胞 分 开 亦 可 作 为 载 体 转 移 癌 的 标 志 物 。 n 在 正 常 的 人 体 细 胞 中 ， 端 粒 程 序 性 地 缩 短 限制 了 转 化 细 胞 的 生 长 能 力 ， 这 可 能 是 肿 瘤 形 成 的一 个 抑 制 机 制 .n 端 粒 酶 的 重 新 表 达 在 细 胞 永 生 化 及 癌 变 过 程中 起 着 重 要 的 作 用 .有 人 认 为 表 达 端 粒 酶 的 正 常细 胞 更 易 癌 变 .在 不 同 肿 瘤 大 约 1 000多 个 活 检 样品 中 发 现 大 约 85 的 样 品 呈 端 粒 酶 阳 性 反 应 .相反 ， 90 以 上 的 邻 近 正 常 组 织 却 是 端 粒 酶 阴 性 . 这 个 酶 与 永 生 化 和 肿 瘤 的 形 成 联 系 密 切 .n 端 粒 酶 活 性 与 肿 瘤 的 这 种 特 殊 关 系 使 之 在 诊断 与 治 疗 方 面 具 有 重 要 的 应 用 价 值 .对 端 粒 酶 活性 的 抑 制 可 能 对 某 些 类 型 的 肿 瘤 来 说 是 一 个 很 有意 义 的 治 疗 方 法 n 端 粒 的 数 量 控 制 着 细 胞 的 增 殖 能 力 ， 是细 胞 内 的 分 裂 钟 . 当 正 常 人 体 细 胞 的 端 粒 缩短 至 一 定 程 度 时 ， 启 动 阻 止 细 胞 分 裂 的 信号 ， 细 胞 开 始 衰 老 死 亡 ， 此 即 所 谓 的Hayflick界 限 (M1期 ).n 一 些 细 胞 由 于 癌 基 因 、 抑 癌 基 因 等 的突 变 逃 逸 M1期 ， 获 得 一 定 的 额 外 增 殖 能 力 ，进 入 第 二 死 亡 期 (M2).此 时 端 粒 酶 仍 为 阴 性 ，端 粒 进 一 步 缩 短 .大 部 分 细 胞 达 到 极 限 而 死亡 ， 生 存 下 来 的 细 胞 具 有 无 限 增 殖 的 能 力 ，端 粒 酶 重 新 活 化 ， 成 为 永 生 细 胞 .在 肿 瘤 形成 过 程 中 ， 端 粒 的 延 长 是 一 个 重 要 的 一 个必 要 的 步 骤 ！ 四 、 端 粒 酶 基 因 研 究 初 步 概 况1.突 变 的 端 粒 酶 可 抑 制 癌 细 胞 生 长2.研 究 发 现 ， 端 粒 酶 催 化 亚 单 位 （ 人 端粒 酶 逆 转 录 酶 ， hTERT） 的 抑 制 在 抗 肿瘤 疗 法 的 研 究 中 起 着 重 要 作 用 。 3.仍 未 认 识 编 码 端 粒 酶 全 酶 的 整 个 基 因 。