分子诊断技术在结核病诊治中的应用ppt课件

分子诊断技术在结核病诊 治中的应用 武汉大学人民医院检验医学中心 李 艳 全球结核病流行状况 WHO report， 2013 全球结核病流行状况 全球结核感染人数 2004年后处于下降趋势 HIV患者并发结核病数量处于平稳阶段 中国结核感染人数全球排名第二 WHO report， 2013 全球结核病流行状况 WHO report， 2013 全球结核病流行状况 全球结核死亡人数处于下降趋势 斯威士兰结核病感染率最高 WHO report， 2013 全球结核病流行状况 Globally, an estimated 3.6% of new cases and 20.2% of previously treated cases have MDR-TB There were an estimated 450,000 new cases of MDR-TB worldwide in 2012 On average, an estimated 9.6% of MDR- TB cases have XDR-TB WHO report， 2013 全球结核病流行状况 2012年全球新发结核病例为 860万人 ， 中国占总数的 12% 在 860万新病例中约 110万人 （ 13%） 为 HIV阳性 ， 这些病例的 75%在非洲 每年约有 130万人死于结核病 ， 我国 为 25万 结核病每 24秒钟就杀死 1人 预计未来 20年还将有 3600万人死于结 核病 。 全球每年有 45万新发 MDR-TB， 大约 4.3万为 XDR-TB 流 行 现 状 感染人数多 死亡人数多 耐药患者多 潜伏感染多 “4多 ” WHO report， 2013 结核病诊治中存在的问题 预防 问题 诊断 问题 治疗 问题 医疗 问题 检验人员最关 心的问题 细菌载 体疫苗 DNA 疫苗 灵敏度 特异性 标本类型 目的用途 费用 实验平台 检测时间 方法选择 方法选择的影响因素 Sputum 涂片 MTB培养 孵育 4-8周 （阳性） 药敏试验 观察 孵 育 4周观察生长情 况 涂片 （阳性） 分子诊断技术 液体培养及药敏试验 平均时间 2-3个 月 平均时间 20天 只需 2小时 -2天 涂阳 =60-98%有结核分枝杆 菌 ， 因此涂阳后最好用分子 生物学方法进行快速鉴定 IGRAs、 TST等 RNA水平 DNA水平 蛋白质水平 恒温扩增 变温扩增 鉴定 鉴定 +耐药 结核病分子 诊断 扩增 杂交 LAMP、 SDA 芯片、 RT-PCR SAT、 TMA FISH、 Probe 分子诊断适宜技术的选择 T-SPOT.TB与 QFT-GI为 IGRAs实验 潜伏性结核 （ LTBI） 结核菌素试验（ TST） T-SPOT.TB QuantiFERON-TB Gold in-tube (QFT-GI) 蛋白质水平 全血 IFN-释放分析技术 (IGRA) 结核感染者体内存在特异的效应 T淋巴细胞 ， 效应 T淋巴细 胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子 （ IFN-） 。 因此 ， 检测效应 T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者 的诊断 。 由于效应 T细胞 存活时间很短 ， 而且 具有特异性 ， 因此可 以作为机体是否正处于被感染的指标 ， 无论是否有临床症状 。 基于 IGRA原理的产品目前已被 美国 、 加拿大 、 英国 、 德 国 、 意大利 、 瑞士 、 法国 、 荷兰 、 日本 等二十余个国家写入 本国的结核诊疗指南中 -干扰素释放实验 酶联免疫斑点技术 培养滤液蛋白 10（ CFP 10） 早期抗原靶 6（ ESAT-6） 一、 T-SPOT技术基础 T-SPOT 由结核杆菌基因组 RD1区相 同的操纵子编码的蛋白 所有的卡介苗（ BCG）均丢 失该基因序列 绝大多数的环境分枝杆菌也 不存在 RD1区 结核杆菌特异抗原 ESAT-6与 CFP 10抗原 Plama PBMCs Gel Barrier Erythrocytes 检测过程 分离 PBMCs 加入 PBMCs与结核特异抗原 37 孵育 16-20小时 PBMCs 特异抗原 -干扰素抗体 加入标记二抗，孵育 1小时 加入显色液，终止反应 观察结果： 1个斑点 =1个效应 T细胞 结果判断图 阴性结果 阳性结果 空白对照 抗原 A ESAT-6 抗原 B CFP10 阳性对照 （ PHA） 潜伏性结核（ LTBI）诊断技术比较 IGRAs与 TST相比 ， 具有更 高的灵敏度和特异性 IGRAs与 BCG, NTM无交叉 反应 ， TST有交叉反应 难以从感染者中鉴别出活 动性肺结核患者 小于 5岁儿童 、 免疫力低下 患者不适合采用 IGRAs检测 试剂成本非常高 costs（费用） availability for clinicians and other health workers（医疗水平） patient acceptability（患者是否接受） ease of distribution and storage（实验平台） 核酸扩增技术 核酸扩增技术 反应条件 扩增产物 检测方法 代表公司 RT-PCR 热循环 DNA 实时 Roche RT-LAMP 恒温 DNA Eiken GenoType MTBDRplus 热循环 DNA Hain Lifescience CPA 恒温 DNA 优思达 NASBA 恒温 RNA bioMerieux TMA 恒温 RNA 终点 Gen-Probe SAT 恒温 RNA 实时 仁度 SAT： Simultaneous Amplification and Testing (RNA仁度 ) CPA: Cross Priming Amplification (DNA/RNA,优思达 ) LAMP:Loop-Mediated Isothermal Amplification (DNA, Japan) TMA: Transcription Mediated Amplification (RNA, Gen- Probe) GenoType MTBDRplus： (Hain Lifescience) NASBA: Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (RNA,OT) RCA: Rolling Circle Amplification (DNA, Molecular Staging) HDA： Helicase-Dependant Amplification (DNA, Biohelix, NEB) RNA 拷贝数 DNA拷贝数 生命力旺盛的病原体 RNA转录活跃 较好的愈后指标 交叉污染少 TMA、 SAT 优点 RNA作为临床分子诊断靶标 二、 SAT技术 同一温度下 （ 42 ） ， 以 RNA为起始模板 ， 通过 M-MLV反转录酶产生一 个双链 DNA拷贝 ， 然后利用 T7 RNA多聚酶 从 DNA拷贝上产生多个 （ 100 1000个 ） RNA拷贝；每一个 RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环； 同时 ， 带有荧光标记的 探针 和这些 RNA拷贝特异结合 ， 产生荧光 。 该荧光信 号可由荧光检测仪器实时捕获 ， 直观反映扩增循环情况 RNA(+) Forward Primer RT RNase H activity Reverse Primer RT T7 100-1000 copies Molecular Beacon Reverse Primer Forward Primer RT/RNase H activity RNA(+) DNA(-) DNA(-) DNA(-) DNA(-) DNA(+) RNA(-) RNA(-) RNA(-) DNA(+) DNA(+) TB-SAT操作步骤 阳性结果 阴性结果 恒温扩增 -42 C RNA 检测 -起始靶标与扩增产物都是 RNA 扩增产物的污染更少 -RNA环境中易降解 更高的扩增效率 -30分钟内扩增 10亿倍 反应稳定 - 抑制物少 高灵敏度、特异性 活菌检测 操作简单、快速 MTBDRsl-鉴定 XDR MTBDRplus-鉴定 MDR MTBC-鉴定 MTB复合群 MTBCM-鉴定 MTB和 NTM 分类 Gene-Probe(TMA/Hain)技术 三、 MTBC-鉴定 MTB复合群 (TMA技术 ) 方法名称： HPV（ Hybridization Protection Assay） -杂交保护分析法为 Gen-probe 公司专利 原理： 以 rRNA为靶标 ， 采用线性探针技术检测结核分枝杆菌复合群 检测设备： LEADER 50i HPA-MTD(Mycobacterium Tuberculosis Direct): 2.5h 报告，直接从标本中检测结核菌 HPA-Accuprobe: 1h 报告，用菌落或自动培养系统的菌 样本 细胞溶解 目标 r-RNA释放 MTD技术路线 杂交体 rRNA AE AE AE AE AE AE AE AE 60 C 15分钟 加入探针 探针 杂交 AE AE AE 选择性试剂 60 C 化学发光读数仪 荧光检测 MTD技术特点 MTD结核分枝杆菌检测技术特点 采用分子技术快速鉴定（ 2.5小时 ）结核分枝杆菌复合群 标本可以是 涂片阴性或者阳性 的痰标本；也可以是培养物 唯一获得 FDA推荐 的凃阴样本快速检测技术 检测 RNA， RNA只能来源于活的细菌，可鉴定活动性结核 病人） 采用 TMA恒温扩增 ，不使用 PCR仪器，无需专业的 PCR实 验室认证 HPA杂交保护分析技术： 灵敏、特异 严格的 实验室防污染技术 ：整个实验过程所有试剂和样本 全部在同一个反应管内进行，杜绝交叉污染 MTD结核分枝杆菌的直接检测意义 TB与其他分枝杆菌区分 AIDS患者鸟分枝杆菌小肠黏膜感染 龟分枝杆菌引起严重院内感染（南方某医院） 提高 TB检出率 CSF、胸腹水等 疑似患者 长期低热、 ESR持续增快，排除肿瘤和免疫性疾病患者， 做血、痰 TB菌 MTD检测 DNA作为临床分子诊断 靶标 四、 MTBDRplus-鉴定 MDR 方法名称： 耐多药结核病 (MDR-TB)快速诊断为 Hain Lifescience公司 专利 原理： 采用 线性探针技术 （ Line-Probe或称 DNA-Strip） 检测结核分枝杆菌复 合群 利福平 (rpoB)和异烟肼 (katG和 inhA)等结核治疗药物的 耐药基因 来 判断 TB体内耐药性 MTBDRplus: 6h报告结核分枝杆菌复合群鉴定与耐药结果 抗结核 药物 靶基因 编码的产物 靶区域和突变率 最常见突变位点 耐药 水平 RFP rpoB RNA聚合酶 亚单位 RRDR 81 bp， 95 Codon531， 30-75 高 INH katG 过氧化氢酶 -过氧化物酶 整个基因 ， 60-95 S315T， 60-95 高 INH inhA 烯酰基还原酶 调节区 ， 25 inhA-15 低 INH ahpC- Promote r 过氧化物酶 启动区 ， 12% 低 PZA pncA 吡嗪酰胺酶 整个基因 ， 68-97 无特定位点 高 EMB embB 阿拉伯糖基转移酶 ERDR少数密码子 ， 47-94 Codon306， 47-89 高 SM rpsL 核糖体蛋白 S12 Codons 43 和 88， 40-95 K43R， 40-90 高 SM rrs 16S rRNA 多个碱基 ， 29% 513位、 905位碱 基， 各占 10.3% 低 喹诺酮 类 gyrA gyrB DNA旋转酶 67106位 ,75-94% Codon90,94 高 结核耐药 的分子 机制 MTBDRplus技术路线 DNA提取 PCR扩增 探针杂交 结果判读 结果解释 野生型：有杂交带显色为 “ +”， 表示未发生突变 耐药突变位点：有杂交带显 色为 “ +”， 表示发生突变 敏感：所有野生型探针 “ +” 和所有耐药位点探针 “ -” 耐药：对应药物有 1条野生 型探针 “ -”或有 1条耐药位点 “ +” 优势 快速检测 RFP和 INH的耐药 时间短 、 操作简单 、 安全高 特异性和灵敏度较高 、 重复性好 主观因素影响小 、 更为可靠 不足 不能检测所有药物的耐药基因型 缺少 ahpC-oxyR间隔序列范围 不能取代传统细菌学检测 、 只能 作为参考 技术特点 MTBDRplus技术 方法 结果 比例法药敏结果 耐药 敏感 灵敏度（ %） 特异度（ %） 符合率（ %） MTBDRplus RFP 耐药 48 0 98.0 100.0 98.5 敏感 1 16 RFP（涂阳） 耐药 39 12 95.1 92.1 92.7 敏感 2 140 INH 耐药 45 0 86.5 100.0 89.7 敏感 7 16 INH（涂阳） 耐药 63 0 98.4 100.0 99.5 敏感 1 129 MTBDRplus技术性能参数 J Clin Microbiol. 2010 Aug;45(8):2635-40. Epub 2007 May 30 MTBDRplus技术性能参数 中国人群存在一定 数量的 KatG S315N 突变 WHO、 盖茨基金会推荐使用的快速线性探针技术 ， 可以在 6小时 内给出药敏鉴定结果 可以做 一线结核药物 （ 异烟肼 利福平 ） 、 二线结核药物 的耐药检测 （ 乙胺丁醇 、 氟喹诺酮类药物 、 可注射结核药 物 ） 标本可是涂片阳性的 痰标本 ， 或是 培养物 技术步骤简单 ：核酸提取 、 PCR扩增 、 核酸杂交仪检测 每个试剂条上自带质控： CC杂交质控 、 AC扩增质控 、 TUB结核分枝杆菌质控 ， 确保整个实验流程的 可信度 HAIN-结核分枝杆菌耐药快速检测系统特点 五、交叉引物恒温扩增技术 (Cross Priming Amplification, CPA) 本试剂盒将病原体 DNA扩增 、 核酸杂交和核酸试 纸条检测三种技术有机地融为一体 ， 在恒温扩增反 应中加入 两对 TB特异性引物 、 一对特异性探针 ， 同 时一次性完成 TB DNA的扩增及杂交过程 ， 然后用 3 号一次性 核酸检测装置 对 TB感染进行定性诊断 ， 其 检测 灵敏度为 10个病原体 ， 高特异引物 设计确保了 结果的可靠性 。 由于待测样本的扩增 （ PCR管盖和 石蜡油双重保护 ） 和检测过程均在 物理封闭条件 下 完成 ， 所以本试剂盒具有防止实验室扩增物 交叉污 染 ， 防止假阳性的效果 杭州优思达公司 CPA技术原理图 A:引入交叉 引物位点 B:交叉引 物扩增 C:检测产物 CPA技术路线图 核酸提取 痰液 石蜡油 反应液 试剂配制 63 2 恒温扩增 金属浴 防污染检测装置 取出反应管 15-30分钟 读取结果 有色颗粒 抗 A抗体 双重标记的 特异性扩增物 阳性 抗抗体 有色颗粒 抗 A抗体 停留，显色 试纸条检测结果判读原理图 抗体包被的颗粒 有色颗粒 抗 A抗体 阴性 无特异性扩增物 抗抗体 有色颗粒 抗 A抗体 无抗抗原 有色颗粒流出 停留，但无色 结果的判读 阳性： 试纸条出现 两条红色条带 ，一条位于质控区（ C线），一条位于 检测 区（ T线）且其强度 L4（与附带的色卡比较）。表明样本中含有 结核分枝杆菌，且其水平达到或超过本试剂盒的最低检出限 阴性 ： 试纸条质控区（ C线）出现一 条红色条带 ，检测区（ T线）没有条 带或者其强度 L4（与附带的色卡比较）。表明样本中不含结核分枝杆菌， 或其水平低于本试剂盒的最低检出限 无效 ： 试纸条质控区（ C线） 未出现条带 。表明试剂盒已损坏、失效或 者操作有误 恒温扩增 -CPA CAP技术 CPA的优势：快速，简单，灵活，稳定 Affordable 低价 : 不需昂贵的设备和分子实验室 Sensitive 灵敏： 10个菌 /ml；与快培比较： 87% Specific 特异：能鉴别人型和牛型 结核分枝杆菌 User-friendly 容易使用：不需 PCR仪 , 操作简单 Rapid/robust 快速 /稳定：样本到结果 2小时 Equipment -free 无仪器：仅需离心机、水浴锅或金属浴 Deliverable 易储运：不需冷链运输。装置 可储存于室温 ASSURED CPA技术性能参数 六、环介导恒温扩增技术 (Loop-Mediated Isothermal Amplification， LAMP ) 环介导恒温扩增法是日本荣研化学独立研发的一种 “ 简便 、 快速 、 准 确 、 廉价 ” 的基因扩增方法 。 它的特征是针对目标 DNA链上的 六个区段 设计 四个不同的引物 ， 然后再利用 链置换反应 在一定温度下进行反应 。 反应只需要把基因模板 、 引物 、 链置换型 DNA合成酶 、 基质等共同置于 一定温度下 （ 60-65） 、 经一个步骤即可完成 。 扩增效率极高 ， 可在 15min-1h内实现 109-1010倍的扩增 。 而且由于有着高度的特异性 ， 只需根 据扩增反应产物的有无可对靶基因序列的存在与否作出判断 不需要使双链 DNA先变性成单链 扩增反应在 等温 下可持续进行 扩增 效率极高 针对六个区段使用两种不同的引物 ， 可特异性扩增靶基因序列 仅使用一种链置换 DNA聚合酶 ， 成本低廉 扩增产物是在同一条 DNA链上互补序列周而复始形成大小不一 的结构 当模板是 RNA时 ， 仅需加入 逆转录酶 即可与 DNA一样进行扩增 LAMP技术原理动画图 LAMP方法建立阶段所需的试剂 DNA 扩增 RNA扩增 模板 DNA 引物 FIP F3 BIP B3 BstDNA 聚合酶 dNTPs 反应缓冲液 模板 RNA 引物 FIP F3 BIP B3 BstDNA 聚合酶 逆转录酶 dNTPs 反应缓冲液 LAMP技术结果判读原理图 LAMP法结果判断方式 -目视检查混浊 LAMP法结果判断方式 /-目视检查绿色荧光 /浊度检测仪 扩增反应在等温条件（ 60 65 ）下连续进行 可以使用简便、廉价的扩增装置 扩增效率高、可在短时间内完成扩增 可在短时间内得出结果 有非常高的特异性 可得出“扩增反应发生 =有目的菌存在”的结论 产生大量扩增产物，检测方法简便 无需用电泳、特殊探针等，可通过浊度仪、荧光目视 方法确认扩增结果 从扩增到检测可在 1个反应试管内（封闭系统）完成 可防止由于扩增产物产生的污染 从 RNA经一步反应可完成扩增 无需另外进行逆转录反应 小结 LAMP技术特点 LAMP技术的应用领域 食品领域 食物中毒致病菌的检测 食品的卫生管理 食物中毒的防止 临床领域 病原菌 、 病毒的检测及鉴定 通过 SNP多态性分型决定用 药量 农业领域 植物病害的早期发现 及蔓延防止 转基因作物的检测 环境领域 环境、水中病原微生物的 检测 工业领域 工业产品用大量 DNA的 生产成为可能 畜牧业领域 雌雄性别判断 病原微生物的检测 遗传病的发现 LAMP技术性能参数 七、 DNA微阵列（基因芯片）技术 DNA微阵列或芯片技术是利用光导化学合成 、 照相平板印刷以及固相 表面化学合成等技术 ， 在固相表面合成成千上万个 寡核苷酸探针 ， 或将 液相合成的探针 由微阵列器或机器人点样于 尼龙膜或硅片 上 ， 再与 放射 性同位素或荧光物标记的 DNA或 cDNA杂交 ， 用于分析 DNA突变及多态 性 、 DNA测序 、 监测同一组织细胞在不同状态下多种组织细胞基因表达 水平的差异 、 发现新的致病基因或疾病相关基因等多个研究领域 博奥生物 基因芯片技术操作流程 样品制备 试剂配制 杂交 激光共焦扫描 软件判读 分枝杆菌菌种鉴定试剂盒 （ DNA微阵列芯片法 ） 同时快速检测 17 种分枝杆菌：结核 、 胞内 、 鸟 、 戈登 、 堪萨斯 、 偶然 、 瘰疬 、 浅黄 、 土 、 龟 -脓肿 、 草 、 不色 、 海 -溃疡 、 金色 、 苏尔加 、 蟾蜍及耻垢 。 分离株或者痰样本均可检测 。 通 量： 同时检测 17 种分枝杆菌 速 度： 6小时 versus 传统 4 周 灵敏度： 103 CFU/反应 特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读 结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒 （ DNA微阵列芯片法 ） 基于 rpoB/katG/inhA的基因突变 ， 快速检测分离株或者痰样本中结核分枝杆菌多药耐药 （ 利福平 、 异烟肼 ） 通 量： 两 种一线抗结核药物 、 8个突变位点 速 度： 6小时 versus 传统 48 周 灵敏度： 103 CFU/反应 特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读 基因芯片技术特点 基因芯片技术性能参数 分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（ DNA微阵列芯片法） 结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（ DNA微阵列芯片法） （基因芯片诊断耐多药结核病的临床多中心研究） 基因芯片检测和 DNA测序结果的符合率为 100% 绝对浓度法药敏结果作为标准，基因芯片法检测利福平、异烟肼耐药和耐多药的符合率分别 是 93.7、 83.8 、 82.4 -中华检验医学杂志 2011年第 9月第 34卷第 9期 MTC和 NTM的测序符合率 分别为 100%和 98.4% TB分离株鉴定灵敏度和特 异性分别为 99.6%和 100% 各项技术比较 检测方法 性能 检测时间 耗费 扩增效率 靶分子 储运要求 温度 实验平台要 求 传统培养 特异性好， 灵敏度低 鉴定 +药敏：2-3月 较大 - 抗原 一般 普通孵育 较高 T-SPOT 特异性与灵 敏度较 TST 好 24 h 高 - ESAT-6与CFP 10抗原 高 二氧化碳孵 育 较高 PCR 特异性与灵 敏度较好 2.5h 较高 较高 DNA 高 热循环 高 SAT 特异性极好， 灵敏度好 2 h 较低 极高 RNA 一般 恒温 较低 TMA 特异性极好， 灵敏度好 2.5 h 较低 - RNA 一般 恒温 较低 各项技术比较 检测方法 性能 检测时间 耗费 扩增效率 靶分子 储运要求 温度 实验平台要 求 Hain 特异性与灵 敏度较好 鉴定 +耐药： 6 h 高 较高 DNA 高 热循环 较高 CPA 特异性与灵 敏度极好 2 h 极低 高 DNA 低 恒温 低 LAMP 特异性极好， 灵敏度好 2 h 极低 高 DNA 低 恒温 低 基因芯片 特异性极好， 灵敏度好 鉴定 +耐药： 6 h 高 高 DNA 高 热循环 高 Hain 特异性与灵 敏度较好 鉴定 +耐药：6 h 高 较高 DNA 高 热循环 较高 Thank You!