生物细胞：4第四章微生物细胞的破碎

第 四 章 微 生 物 细 胞 的 破 碎 知 识 点 ： 细 胞 壁 的 组 成 和 结 构 ， 微 生 物 细 胞的 破 碎 技 术 ， 破 碎 率 的 测 定 。 重 点 ： 工 业 生 产 中 常 用 的 几 种 细 胞 破 碎 方 法的 原 理 ， 操 作 过 程 及 常 用 设 备 ， 并 能 就 实 际生 产 情 况 予 以 合 理 的 选 择 。 难 点 ： 常 用 破 碎 方 法 的 合 理 选 用 。 为 了 研 究 细 胞 的 破 碎 ， 提 高 其 破 碎 率 ， 有 必 要 了 解各 种 微 生 物 细 胞 壁 的 组 成 和 结 构 （ 表 1） ： 微 生 物 革 兰 氏 阳 性 细 菌 革 兰 氏 阴 性 细 菌 酵 母 菌 霉 菌壁 厚 /nm 20-80 10-13 100-300 100-250层 次 单 层 多 层 多 层 多 层主 要 组成 肽 聚 糖（ 40-90%）多 糖胞 壁 酸蛋 白 质脂 多 糖（ 1-4%） 肽 聚 糖（ 5-10%）脂 蛋 白脂 多 糖（ 11-22%）磷 脂蛋 白 质 葡 聚 糖（ 30-40%）甘 露 聚 糖（ 30%）蛋 白 质（ 6-8%）脂 类（ 8.5- 13.5%） 多 聚 糖（ 80-90%）脂 类蛋 白 质 一 、 细 胞 壁 的 组 成 和 结 构 u细 菌 破 碎 的 主 要 阻 力 来 自 于 肽 聚 糖 的 网 状 结 构 ， 网 状 结构 越 致 密 ， 破 碎 的 难 度 越 大 ， 革 兰 氏 阴 性 细 菌 网 状 结 构 不及 革 兰 氏 阳 性 细 菌 的 坚 固 ；u酵 母 细 胞 壁 破 碎 的 阻 力 也 主 要 决 定 于 壁 结 构 交 联 的 紧 密程 度 和 它 的 厚 度 ；u由 于 霉 菌 细 胞 壁 中 含 有 几 丁 质 或 纤 维 素 的 纤 维 状 结 构 ，其 强 度 比 细 菌 和 酵 母 菌 的 细 胞 壁 有 所 提 高 。 u不 同 种 类 的 细 胞 结 构 差 别 很 大 ， 破 碎 的 难 易 程 度 也 不 同 ，由 难 到 易 的 大 致 排 列 顺 序 为 ： 植 物 细 胞 真 菌 （ 如 酵 母 菌 ） 革 兰 氏 阳 性 细 菌 革 兰 氏 阴 性 细 菌 动 物 细 胞 。 二 、 常 用 破 碎 方 法分 类 作 用 机 理 适 应 性机械法 珠 磨 法 固 体 剪 切 作 用 可 达 较 高 破 碎 率 ， 可 较 大 规 模 操 作 ， 大 分子 目 的 产 物 易 失 活 ， 浆 液 分 离 困 难高 压 匀 浆 法 液 体 剪 切 作 用 可 达 较 高 破 碎 率 ， 可 大 规 模 操 作 ， 不 适 合丝 状 菌 和 革 兰 氏 阳 性 菌超 声 破 碎 法 液 体 剪 切 作 用 对 酵 母 菌 效 果 较 差 ， 破 碎 过 程 升 温 剧 烈 ，不 适 合 大 规 模 操 作X-press法 固 体 剪 切 作 用 破 碎 率 高 ， 活 性 保 留 率 高 ， 对 冷 冻 敏 感 目的 产 物 不 适 合非机械法 酶 溶 法 酶 分 解 作 用 具 有 高 度 专 一 性 ， 条 件 温 和 ， 浆 液 易 分 离 ，溶 酶 价 格 高 ， 通 用 性 差化 学 渗 透 法 改 变 细 胞 膜 的 渗 透 性 具 一 定 选 择 性 ， 浆 液 易 分 离 ， 但 释 放 率 较 低 ， 通 用 性 差渗 透 压 法 渗 透 压 剧 烈 改 变 破 碎 率 较 低 ， 常 与 其 他 方 法 结 合 使 用冻 结 融 化 法 反 复 冻 结 -融 化 破 碎 率 较 低 ， 不 适 合 对 冷 冻 敏 感 目 的 产 物干 燥 法 改 变 细 胞 膜 渗 透 性 条 件 变 化 剧 烈 ， 易 引 起 大 分 子 物 质 失 活 细 胞 破 碎 机 理 图 进 入 珠 磨 机 的 细 胞 悬 浮 液 与 极 细 的 玻 璃 小 珠 、 石 英 砂 、 氧 化铝 等 研 磨 剂 （ 直 径 小 于 1mm） 一 起 快 速 搅 拌 或 研 磨 ， 研 磨剂 、 珠 子 与 细 胞 之 间 的 互 相 剪 切 、 碰 撞 ， 使 细 胞 破 碎 ， 释 放出 内 含 物 。 在 珠 液 分 离 器 的 协 助 下 ， 珠 子 被 滞 留 在 破 碎 室 内 ，浆 液 流 出 从 而 实 现 连 续 操 作 。 破 碎 中 产 生 的 热 量 一 般 采 用 夹套 冷 却 的 方 式 带 走 。1.珠 磨 法 （ Bead mill）原 理 ： n实 验 室 规 模 的 细 胞 破 碎 设 备 有 Mickle高 速 组 织 捣 碎 机 、 Braun匀 浆 器 ；n中 试 规 模 的 细 胞 破 碎 可 采 用 胶 质 磨 处 理 ；n在 工 业 规 模 中 ， 可 采 用 高 速 珠 磨 机 （ 瑞 士 WAB公 司 和 德国 西 门 子 机 械 公 司 制 造 ） 。珠 磨 法 的 破 碎 率 一 般 控 制 在 80%以 下 ： 降 低 能 耗 、 减 少 大分 子 目 的 产 物 的 失 活 、 减 少 由 于 高 破 碎 率 产 生 的 细 胞 小 碎 片不 易 分 离 而 给 后 续 操 作 带 来 的 困 难 。 高 速 珠 磨 机 采 用 高 压 匀 浆 器 （ 由 高 压 泵 和 匀 浆 阀 组 成 ， 英 国 APV公 司 和 美 国 Microfluidics公 司 均 有 产 品 出 售 ） 。2.高 压 匀 浆 法 （ High-pressure homogenization）大 规 模 细 胞 破 碎 的 常 用 方 法利 用 高 压 使 细 胞 悬 浮 液 通 过 针 形 阀 ， 由 于 突 然 减 压 和 高 速 冲击 撞 击 环 使 细 胞 破 碎 ， 细 胞 悬 浮 液 自 高 压 室 针 形 阀 喷 出 时 ，每 秒 速 度 高 达 几 百 米 ， 高 速 喷 出 的 浆 液 又 射 到 静 止 的 撞 击 环上 ， 被 迫 改 变 方 向 从 出 口 管 流 出 。 细 胞 在 这 一 系 列 高 速 运 动过 程 中 经 历 了 剪 切 、 碰 撞 及 由 高 压 到 常 压 的 变 化 ， 从 而 造 成细 胞 破 碎 。原 理 ： 高 压 匀 浆 器 p易 造 成 堵 塞 的 团 状 或 丝 状 真 菌 ，p较 小 的 革 兰 氏 阳 性 菌 ，p含 有 包 含 体 的 基 因 工 程 菌 （ 因 包 含 体 坚 硬 ， 易 损 伤 匀 浆 阀 ）不 宜 采 用 高 压 匀 浆 法 。 破 碎 的 动 力 学 方 程 为 ： ln1 （ l R） KNP 其 中 R破 碎 率 ； K与 温 度 有 关 的 速 度 常 数 ； P一 操 作 压 力 ； N一 悬 浮 液 通 过 匀 浆 器 阀 的 次 数 。 与 微 生 物 种 类 有 关 的 常 数 ； 破 碎 酵 母 菌 ,值 可 取 2. 2。 可 见 ， 影 响 破 碎 的 主 要因 素 是 压 力 、 温 度 和 通 过 匀 浆 器 阀 的 次 数 。 在 15-25 kHz的 频 率 下 操 作 。 其 原 理 可 能 与 空 化 现 象（ cavitation phenomena） 引 起 的 冲 击 波 和 剪 切 作 用 有 关 。空 穴 泡 由 于 受 到 超 声 波 的 迅 速 冲 击 而 闭 合 ， 从 而 产 生 一 个 极 为 强 烈 的冲 击 波 压 力 ， 由 它 引 起 的 粘 滞 性 旋 涡 在 介 质 中 的 悬 浮 细 胞 上 造 成 了 剪切 应 力 ， 促 使 细 胞 液 体 发 生 流 动 ， 从 而 使 细 胞 破 碎 。3.超 声 破 碎 法 （ Ultrasonication）一 般 杆 菌 比 球 菌 易 破 碎 ， G-细 菌 比 G+细 菌 易 破 碎 ， 对 酵 母 菌的 效 果 较 差 ， 该 法 。但 超 声 波 产 生 的 化 学 自 由 基 团 能 使 某 些 敏 感 性 活 性 物 质 失 活 。 4.酶 溶 法 （ Enzymatic Lysis）（ 1） 外 加 酶 法 常 用 的 溶 酶 溶 菌 酶-1， 3-葡 聚 糖 酶-1， 6-葡 聚 糖 酶蛋 白 酶甘 露 糖 酶糖 苷 酶肽 键 内 切 酶壳 多 糖 酶 等溶 菌 酶 主 要 用 于 细 菌 类细 胞 壁 溶 解 酶 是 几 种 酶 的 复 合 物 对 酵 母 细 胞 采 用 酶 法 破 碎 时 ， 先 加 入 蛋 白 酶 作 用 蛋 白 质 -甘 露 聚 糖结 构 ， 使 二 者 溶 解 ， 再 加 入 葡 聚 糖 酶 作 用 裸 露 的 葡 聚 糖 层 ， 最 后只 剩 下 原 生 质 体 ， 这 时 若 缓 冲 液 的 渗 透 压 变 化 ， 则 细 胞 膜 破 裂 ，释 出 胞 内 产 物 。酶 溶 法 的 优 点 ：选 择 性 释 放 产 物 ， 条 件 温 和 ， 核 酸 泄 出 量 少 ， 细 胞 外 形 完 整 。缺 点 ： 溶 酶 价 格 高 ， 溶 酶 法 通 用 性 差 （ 不 同 菌 种 需 选 择 不 同的 酶 ） ， 产 物 抑 制 的 存 在 。 如 在 溶 酶 系 统 中 ， 甘 露 糖 对 蛋 白 酶 有 抑 制 作 用 ， 葡 聚 糖 抑制 葡 聚 糖 酶 。 u诱 发 微 生 物 产 生 过 剩 的 溶 胞 酶 或 激 发 自 身 溶 胞 酶 的活 力 ， 以 达 到 细 胞 自 溶 的 目 的 。u影 响 自 溶 过 程 的 主 要 因 素 有 温 度 、 时 间 、 pH值 、激 活 剂 和 细 胞 代 谢 途 径 等 。u缺 点 是 ： 对 不 稳 定 的 微 生 物 ， 易 引 起 所 需 蛋 白 质 的变 性 ， 自 溶 后 细 胞 悬 浮 液 粘 度 增 大 ， 过 滤 速 度 下 降 。 （ 2） 自 溶 法 （ Autolysis） 某 些 化 学 试 剂 ， 如 有 机 溶 剂 、 变 性 剂 、 表 面 活 性 剂 、抗 生 素 、 金 属 螯 合 剂 等 ， 可 以 改 变 细 胞 壁 或 膜 的 通 透性 （ 渗 透 性 ） ， 从 而 使 胞 内 物 质 有 选 择 地 渗 透 出 来 。4.化 学 渗 透 法 （ Chemical permeation）该 法 取 决 于 化 学 试 剂 的 类 型 以 及 细 胞 壁 膜 的 结 构 与 组 成 。 如 Triton X-100是 一 种 非 离 子 型 清 洁 剂 ， 对 疏 水 性 物 质具 有 很 强 的 亲 和 力 ， 能 结 合 并 溶 解 磷 脂 ， 破 坏 内 膜 的 磷 脂 双分 子 层 ， 使 某 些 胞 内 物 质 释 放 出 来 。其 他 的 表 面 活 性 剂 ， 如 牛 黄 胆 酸 钠 、 十 二 烷 基 磺 酸 钠 等 也 可使 细 胞 破 碎 。（ 1） 表 面 活 性 剂可 促 使 细 胞 某 些 组 分 溶 解 ， 其 增 溶 作 用 有 助 于 细 胞 的 破 碎 。 处 理 G-细 菌 ， 对 细 胞 外 层 膜 有 破 坏 作 用 。 G-细 菌 的 外 层 膜结 构 通 常 靠 二 价 阳 离 子 Ca2+或 Mg2+结 合 脂 多 糖 和 蛋 白 质 来维 持 ， 一 旦 EDTA将 Ca2+或 Mg2+螯 合 ， 大 量 的 脂 多 糖 分 子将 脱 落 ， 使 细 胞 壁 外 层 膜 出 现 洞 穴 。 这 些 区 域 由 内 层 膜 的 磷脂 来 填 补 ， 从 而 导 致 内 层 膜 通 透 性 的 增 强 。（ 2） EDTA螯 合 剂 能 分 解 细 胞 壁 中 的 类 脂 ， 使 胞 壁 膜 溶 胀 ， 细 胞 破 裂 ，胞 内 物 质 被 释 放 出 来 。甲 苯 、 苯 、 氯 仿 、 二 甲 苯 及 高 级 醇 等 。（ 3） 有 机 溶 剂（ 4） 变 性 剂盐 酸 胍 （ Guanidine hydrochloride） 和 脲 （ Urea）是 常 用 的 变 性 剂 。变 性 剂 与 水 中 氢 键 作 用 ， 削 弱 溶 质 分 子 间 的 疏 水 作 用 ， 从 而使 疏 水 性 化 合 物 溶 于 水 溶 液 。 不 同 细 胞 可 采 用 的 化 学 渗 透 处 理 方 式细 胞 类 型 变 性 剂 清 洁 剂 有 机 溶 剂 酶 抗 生 素 生 物 试 剂 螯 合 剂革 兰 氏 阴性 细 菌 * * * * * *革 兰 氏 阳性 细 菌 * * *酵 母 菌 * * * * * *植 物 细 胞 * * * *巨 噬 细 胞 * * * 表 示 适 用 u通 用 性 差 ；u时 间 长 ， 效 率 低 ， 一 般 胞 内 物 质 释 放 率 不 超 过 50%；u有 些 化 学 试 剂 有 毒 。化 学 渗 透 法 优 点 ：缺 点 ：l对 产 物 释 放 有 一 定 的 选 择 性 ， 可 使 一 些 较 小 分 子 量 的 溶 质如 多 肽 和 小 分 子 的 酶 蛋 白 透 过 ， 而 核 酸 等 大 分 子 量 的 物 质 仍滞 留 在 胞 内 ；l细 胞 外 形 完 整 ， 碎 片 少 ， 浆 液 粘 度 低 ， 易 于 固 液 分 离 和 进一 步 提 取 。 将 浓 缩 的 菌 体 悬 浮 液 冷 却 至 -25 形 成 冰 晶 体 ， 利 用500MPa以 上 的 高 压 冲 击 ， 使 冷 冻 细 胞 从 高 压 阀 小 孔 中 挤出 。 细 胞 破 碎 是 由 于 冰 晶 体 的 磨 损 ， 使 包 埋 在 冰 中 的 微 生 物变 形 而 引 起 的 。此 法 主 要 用 于 实 验 室 ， 适 应 范 围 广 、 破 碎 率 高 、 细 胞 碎 片 粉 碎 程 度 低 及活 性 保 留 率 高 等 优 点 ， 但 不 适 应 于 对 冷 冻 敏 感 的 生 化 物 质 。 5.其 他 方 法1. X-press法 将 细 胞 放 在 高 渗 透 压 的 介 质 中 （ 如 一 定 浓 度 的 甘 油 或 蔗 糖 溶液 ） ， 达 平 衡 后 ， 转 入 到 渗 透 压 低 的 缓 冲 液 或 纯 水 中 ， 由 于渗 透 压 的 突 然 变 化 ， 水 迅 速 进 入 细 胞 内 ， 引 起 细 胞 溶 胀 ， 甚至 破 裂 。仅 适 用 于 细 胞 壁 较 脆 弱 的 细 胞 或 细 胞 壁 预 先 用 酶 处 理 或 在 培 养 过 程 中 加入 某 些 抑 制 剂 （ 如 抗 生 素 等 ） ， 使 细 胞 壁 有 缺 陷 ， 强 度 减 弱 。 2. 渗 透 压 法 （ Osmotic pressure） 将 细 胞 放 在 低 温 下 突 然 冷 冻 而 在 室 温 下 缓 慢 融 化 ， 反 复 多次 而 达 到 破 壁 作 用 。 由 于 冷 冻 ， 一 方 面 使 细 胞 膜 的 疏 水 键结 构 破 裂 ， 另 一 方 面 胞 内 水 结 晶 ， 使 细 胞 内 外 溶 液 浓 度 变化 ， 引 起 细 胞 膨 胀 而 破 裂 。适 用 于 细 胞 壁 较 脆 弱 的 菌 体 ， 破 碎 率 较 低 ， 需 反 复 多 次 ， 此 外 ， 在 冻融 过 程 中 可 能 引 起 某 些 蛋 白 质 变 性 。 3. 反 复 冻 结 -融 化 法 使 细 胞 结 合 水 分 丧 失 ， 从 而 改 变 细 胞 的 渗 透 性 。 当 采 用 丙 酮 、丁 醇 或 缓 冲 液 等 对 干 燥 细 胞 进 行 处 理 时 ， 胞 内 物 质 就 容 易 被抽 提 出 来 。气 流 干 燥 主 要 适 用 于 酵 母 菌 ， 一 般 在 25-30 的 气 流 中 吹 干 ；真 空 干 燥 多 用 于 细 菌 。 4.干 燥 法 气 流 干 燥真 空 干 燥喷 雾 干 燥冷 冻 干 燥 三 、 破 碎 率 的 测 定 与 破 碎 技 术 的 研 究 方 向 细 胞 破 碎 后 ， 大 量 带 电 荷 的 内 含 物 被 释 放 到 水 相 ， 使 导 电 率 上升 。 导 电 率 随 着 破 碎 率 的 增 加 而 呈 线 性 增 加 。1. 破 碎 率 的 测 定1)直 接 测 定 法2)目 的 产 物 测 定 法3)导 电 率 测 定 法采 用 染 色 的 方 法 把 破 碎 的 细 胞 与 未 破 碎 的 细 胞 区 别 开 来 。如 破 碎 的 革 兰 氏 阳 性 菌 可 染 成 革 兰 氏 阴 性 菌 的 颜 色 ；采 用 革 兰 氏 染 色 法 染 色 酵 母 破 碎 液 ， 完 整 的 细 胞 呈 紫 色 ，而 受 损 害 的 细 胞 呈 亮 红 色 。将 破 碎 后 的 细 胞 悬 浮 液 离 心 分 离 细 胞 碎 片 ， 测 定 上 清 液 中 目 的产 物 （ 如 蛋 白 质 或 酶 ） 的 含 量 或 活 性 ， 并 与 100%破 碎 率 所 获 得的 标 准 数 值 比 较 ， 计 算 其 破 碎 率 。 细 胞 破 碎 与 固 液 分 离 紧 密 相 关 。 2.破 碎 技 术 的 研 究 方 向1)多 种 破 碎 方 法 相 结 合2)与 上 游 过 程 相 结 合3)与 下 游 工 程 相 结 合化 学 法 、 酶 法 、 机 械 法 相 结 合 。如 用 溶 解 酶 预 处 理 面 包 酵 母 ， 然 后 高 压 匀 浆 ， 95MPa压 力下 匀 浆 4次 ， 总 破 碎 率 接 近 100%。 而 单 独 采 用 高 压 匀 浆 法 ，同 样 条 件 下 破 碎 率 只 有 32%。v在 发 酵 培 养 过 程 中 ， 培 养 基 、 生 长 期 、 操 作 参 数 （ 如 pH、 温 度 、 通 气 量 、 搅 拌转 速 、 稀 释 率 等 ） 等 因 素 都 对 细 胞 壁 膜 的 结 构 与 组 成 有 一 定 的 影 响 。 细 胞 的 破 碎与 上 游 培 养 过 程 有 关 。v用 基 因 工 程 的 方 法 对 菌 种 进 行 改 造 ， 以 提 高 胞 内 物 质 的 提 取 率 也 是 非 常 重 要 的。v在 生 长 后 期 ， 加 入 某 些 能 抑 制 或 阻 止 细 胞 壁 物 质 合 成 的 抑 制 剂 （ 如 青 霉 素 、 环丝 氨 酸 等 ） ， 继 续 培 养 一 段 时 间 后 ， 新 分 裂 的 细 胞 其 细 胞 壁 有 缺 陷 ， 利 于 破 碎 ；v选 择 较 易 破 碎 的 菌 种 作 为 寄 主 细 胞 ， 如 革 兰 氏 阴 性 细 菌 ；v在 细 胞 内 引 进 噬 菌 体 基 因 ， 培 养 结 束 后 ， 控 制 一 定 条 件 （ 如 温 度 等 ） ， 激 活 噬菌 体 基 因 ， 使 细 胞 自 内 向 外 溶 解 ， 释 放 出 内 含 物 。 作 业 :1. 常 用 细 胞 破 碎 方 法 (珠 磨 法 、 高 压 匀 浆 法 、超 声 破 碎 法 、 酶 溶 法 、 化 学 渗 透 法 )的 原 理 、特 点 及 适 用 性 。2. 举 例 说 明 采 用 多 种 破 碎 方 法 相 结 合 提 高 破 碎率 的 机 理 。