细胞的原代与传代培养

第五章细胞的原代与传代培养 n 一 、 原 代 培 养 概 念 ： 取 自 体 内 新 鲜 组 织 并 置 于 体 外 条 件 下 生 长 的 细 胞 在 传 代 之 前 称 为 原 代 培 养 。 原 代 培 养 技 术 的 重 要 意 义 :n 原 代 培 养 的 最 大 优 点 是 细 胞 刚 刚 离 体 ， 生 物 性状 尚 未 发 生 很 大 变 化 ， 具 有 二 倍 体 的 遗 传 性 ，而 且 大 多 数 细 胞 表 现 出 原 来 组 织 的 特 性 。n 利 用 原 代 培 养 做 各 种 实 验 ， 如 药 物 测 试 、 细 胞分 化 及 病 毒 学 方 面 的 试 验 效 果 很 好 。n 原 代 培 养 也 是 建 立 各 种 细 胞 系 （ 株 ） 必 须 经 过的 阶 段 。 原代培养 消化法：这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。消化法贴块法冷消化温消化一次性消化分次消化 贴块法消化法原代培养方法分类 93 分 次 消 化 消化法的分类 解 离 释 放 细 胞 的 方 法 n 最 常 用 的 是 机 械 解 离 细 胞 法 、 酶 学 解 离 细 胞法 以 及 螯 合 剂 解 离 细 胞 法 。n用酶 学 解 离 细 胞 法 解 离 细 胞 是 体 外 培 养 动 物细 胞 时 分 散 组 织 的 基 本 方 法 ， 最 常 用 的 消 化酶 是 胰 蛋 白 酶 和 胶 原 酶 两 种 。 动物细胞原代培养过程图 方法与步骤（举例）（ 1） 动 物 处 死 ： 将 出 生 2 3d乳 鼠 ， 用 拉 颈 椎 方 法处 死 。 腹 部 向 上 钉 在 蜡 盘 中 ， 用 碘 酒 和 酒 精 棉 球擦 拭 腹 部 消 毒 。（ 2） 剪 取 心 脏 ： 在 无 菌 条 件 下 将 心 脏 （ 心 尖 ） 取出 ， 置 于 无 菌 培 养 皿 中 ， 用 Hanks液 洗 涤 1-2次 去除 血 污 ； 放 入 另 一 培 养 皿 中 ， 纵 向 剪 开 心 脏 ， 仔细 去 除 心 腔 内 血 污 后 剪 成 1mm3大 小 的 组 织 块 ， 再并 用 Hanks液 洗 涤 2 3次 ， 直 到 液 体 澄 清 。 （ 3） 消 化 及 分 散 组 织 块 ： 将 上 述 清 洗 过 的 组 织 放 入 无菌 三 角 烧 瓶 内 ， 加 入 5 6倍 量 的 0.1 胰 蛋 白 酶 液（ pH7.4 7.6） ， 置 37 恒 温 磁 力 搅 拌 器 上 分 次消 化 ： 每 次 消 化 8-10分 钟 。 在 超 净 台 中 吸 出 胰 蛋 白酶 液 于 带 盖 离 心 管 中 ， 加 入 2滴 血 清 终 止 消 化 。 直到 组 织 块 基 本 消 化 完 全 。 各 管 配 平 后 离 心 ， 收 集 细 胞 ， 无 血 清 培 养 液 洗 2-3次后 ， 将 细 胞 悬 液 用 两 层 灭 菌 纱 布 过 滤 至 另 一 烧 杯 中 。 （ 4） 计 数 与 稀 释 ： 从 过 滤 的 细 胞 悬 液 中 取 出 1ml滴 于 血 细 胞 计 数 板 上 ， 按 白 细 胞 法 进 行 计 数 ；计 数 后 用 培 养 液 稀 释 ， 稀 释 后 的 浓 度 一 般 以 每毫 升 含 30 50万 个 细 胞 为 宜 。（ 5） 分 装 与 培 养 ： 将 稀 释 好 的 细 胞 悬 液 分 装 于 细胞 培 养 瓶 中 ， 盖 好 瓶 盖 ， 在 培 养 瓶 上 做 好 标 记 ，置 于 37 的 CO2培 养 箱 中 培 养 。（ 6） 观 察 ： 逐 日 检 查 培 养 物 是 否 污 染 ， 观 察 细 胞生 长 情 况 。 待 细 胞 已 基 本 长 成 致 密 单 层 时 ， 即可 进 行 传 代 培 养 。 外植块培养步骤图解 二、传代细胞培养n 离 体 培 养 的 细 胞 群 体 增 殖 达 到 一 定 密 度 时 ， 细 胞 的 生长 和 分 裂 速 度 就 会 减 慢 甚 至 停 止 ， 如 不 及 时 分 离 传 代培 养 ， 细 胞 将 逐 渐 衰 老 死 亡 。 传 代 培 养 是 指 细 胞 从 一个 培 养 瓶 以 1： 2或 其 他 比 率 转 移 ， 接 种 到 另 一 培 养 瓶的 培 养 。 贴 壁 培 养 细 胞 的 传 代 通 常 是 采 用 胰 蛋 白 酶 消化 ， 把 细 胞 分 散 成 单 细 胞 再 传 代 ， 而 悬 浮 型 生 长 细 胞则 用 直 接 传 代 法 或 离 心 法 传 代 。 方法与步骤（ 一 ） 贴 壁 细 胞 传 代 培 养（ 1） 选 取 生 长 良 好 的 细 胞 ， 在 超 净 工 作 台 的 酒 精灯 旁 ， 倒 去 瓶 中 的 旧 培 养 液 ， 加 入 2 3ml的 D- Hanks液 ， 轻 轻 振 荡 漂 洗 细 胞 ， 以 除 去 悬 浮 在 细 胞 表 面 的 碎 片 (思 考 ： 还 有 什 么 作 用 ？ ）（ 2） 加 入 适 量 0. 0.25 胰 蛋 白 酶 消 化 液 ， 室 温 消 化 ， 倒 置 显 微 镜 下 观 察 ， 待 细 胞 单 层收 缩 突 起 出 现 空 隙 时 ， 倒 去 酶 液 。 （ 3） 用 Hanks液 洗 涤 1次 ， 加 入 适 量 培 养 液 ， 反 复吹 打 细 胞 ， 使 其 成 细 胞 悬 液 。（ 4） 以 1： 2或 1： 3进 行 分 装 ， 并 在 培 养 瓶 上 做 好标 记 ， 注 明 代 号 、 日 期 ， 轻 轻 摇 匀 ， 37 CO2 培 养 箱 培 养 。 （ 5） 观 察 ： 细 胞 培 养 24h后 ， 即 可 观 察 培 养 液 的 颜 色 及 细 胞 的 生 长 情 况 。 （ 二 ） 悬 液 细 胞 的 传 代 培 养（ 1） 取 生 长 良 好 的 细 胞 ， 在 超 净 工 作 台 用 无 菌 吸 管 把 培 养 瓶 中 的 细 胞 吹 打 均 匀 。（ 2） 转 移 到 无 菌 的 离 心 管 中 ， 盖 紧 胶 盖 ， 平 衡 后 离 心 （ 1 000r/min） 5min。 (区 别 贴 壁 传 代 )（ 3） 在 超 净 工 作 台 中 吸 去 上 清 液 ， 加 入 适 量 新 培 养 液 ， 用 吸 管 吹 打 细 胞 ， 制 成 悬 液 。（ 4） 以 1： 2或 1： 3进 行 分 装 ， 并 在 培 养 瓶 上 做 好 标 记 ， 注 明 代 号 、 日 期 ， 轻 轻 摇 匀 ， 37 CO 2培养 箱 培 养 。（ 5） 观 察 ： 细 胞 培 养 24h后 ， 即 可 进 行 观 察 。 n 三 、 人 体 活 检 (或 手 术 )材 料n (1) 在 准 备 以 临 床 材 料 为 实 验 材 料 时 ,要 预 先 与临 床 外 科 医 生 和 护 士 商 量 ,并 做 好 一 切 必 要 的 准备 工 作 。 争 取 拿 到 的 标 本 新 鲜 、 无 菌 、 少 坏 死 等 。 n (2)与 临 床 联 系 好 手 术 时 间 后 ， 立 即 做 好 如 下 准备 工 作 ： 准 备 好 1-2个 贮 有 培 养 液 和 抗 生 素 的 标本 收 集 瓶 ， 将 盖 盖 紧 ， 保 持 无 菌 ， 瓶 外 贴 上 标 签 ，写 上 工 作 人 员 名 字 、 地 点 和 电 话 号 码 ； 将 收 集 瓶送 往 医 院 ， 并 与 医 生 和 护 士 讲 清 解 取 手 术 标 本 的部 位 及 注 意 事 项 。 n (3)标 本 放 入 收 集 瓶 后 ， 送 出 手 术 间 ， 立 即 送往 组 织 培 养 实 验 室 。 工 作 人 员 最 好 是 等 在 手 术间 外 。 但 有 时 手 术 时 间 难 以 掌 握 。 则 请 护 士 将收 集 材 料 的 瓶 子 盖 好 后 ， 放 入 4 冰 箱 ， 尽 快打 电 话 通 知 工 作 人 员 。n (4)取 临 床 标 本 时 ， 虽 然 尽 可 能 做 到 无 菌 操 作 ，但 仍 有 污 染 可 能 性 的 存 在 。 可 选 用 抗 生 素 类 控制 污 染 。 如 手 术 标 本 比 较 大 （ 约 200mg以 上 ） ，可 将 其 浸 于 70%酒 精 中 约 30-60秒 ， 这 样 会 减 少表 面 污 染 而 不 损 坏 内 部 组 织 的 结 构 和 存 活 。 不要 用 纱 布 包 裹 标 本 ， 纱 布 纤 维 易 粘 附 在 组 织 上 。 n 需 要 注 意 的 事 项n 整 个 取 材 过 程 中 ， 都 要 注 意 保 持 组 织 的 湿 润 ，随 时 给 组 织 块 滴 加 一 些 培 养 液 或 平 衡 盐 溶 液 。一 般 情 况 下 ， 最 好 是 使 用 冰 冷 的 液 体 。n 在 剪 碎 或 切 割 组 织 块 时 ， 尽 量 使 用 锋 利 的 刀 剪 ，防 止 以 钝 器 对 组 织 揉 、 捻 、 撕 拉 等 而 造 成 细 胞损 伤 。n 整 个 取 材 过 程 耗 时 越 短 越 好 。 在 万 不 得 已 的 情况 下 ， 取 材 后 也 可 将 组 织 贮 存 在 冷 的 (4 )含平 衡 盐 溶 液 (或 其 它 缓 冲 盐 溶 液 )的 营 养 液 中 ，最 好 不 超 过 24 48h(视 不 同 组 织 类 型 而 定 )。