分子生物学研究方法上

第 五 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 （ 上 ）DNA、 RNA、 蛋 白 质 操 作 技 术从 20世 纪 中 叶 开 始 ， 分 子 生 物 学 研 究 得 到 高 速发 展 ， 主 要 原 因 之 一 是 现 代 分 子 生 物 学 研 究 方 法 ，特 别 是 基 因 操 作 和 基 因 工 程 技 术 的 进 步 。基 因 操 作 主 要 包 括 DNA分 子 的 切 割 与 连 接 、 核酸 分 子 杂 交 、 凝 胶 电 泳 、 细 胞 转 化 、 核 酸 序 列 分 析以 及 基 因 的 人 工 合 成 、 定 点 突 变 和 PCR扩 增 等 ， 是分 子 生 物 学 研 究 的 核 心 技 术 。 5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 5.2 DNA基 本 操 作 技 术 5.3 RNA基 本 操 作 技 术 5.4 SNP的 理 论 与 应 用 5.5 基 因 克 隆 技 术 5.6 蛋 白 质 组 与 蛋 白 质 组 学 技 术本 章 主 要 内 容 ： 5.1 重 组 DNA技 术 回 顾5.1.1 重 组 DNA技 术 诞 生 的 理 论 基 础5.1.2 关 键 性 实 验 技 术 问 世 为 重 组 DNA技 术 奠 基 5.1.3 重 组 DNA技 术 的 概 念5.1.4 重 组 DNA技 术 的 基 本 步 骤 5.1.5 重 组 DNA技 术 的 意 义 5.1.6 重 组 DNA实 验 中 常 见 的 主 要 工 具 酶5.1.7 目 的 基 因 的 来 源5.1.8 重 组 实 验 中 的 基 因 载 体 5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 40年 代 明 确 了 遗 传 的 物 质 基 础 是 DNA 50年 代 揭 示 了 DNA 分 子 的 双 螺 旋 结 构 模 型 和 半保 留 复 制 ， 解 决 了 基 因 的 自 我 复 制 和 遗 传 信 息传 递 问 题 。 50年 代 末 和 60年 代 提 出 了 “ 中 心 法 则 ” 和 操 纵子 学 说 ， 并 成 功 地 破 译 了 遗 传 密 码 ， 从 而 阐 明了 遗 传 信 息 的 流 向 和 表 达 问 题 。 5.1.1 重 组 DNA技 术 诞 生 的 理 论 基 础 5.1.2 关 键 性 实 验 技 术 问 世 为 重 组 DNA技 术 奠 基 1、 DNA分 子 的 切 割 与 连 接 技 术 限 制 性 核 酸 内 切 酶 (1972)和 连 接 酶 (1967)的 陆 续 发 现 ， 才使 分 子 生 物 学 家 有 了 进 行 DNA操 作 的 基 本 工 具 。 2、 载 体 构 建 和 大 肠 杆 菌 转 化 体 系 的 建 立 1970年 M.Mandel和 A.Hige发 现 ， 大 肠 杆 菌 的 细 胞 经 过 氯 化钙 适 当 处 理 之 后 ， 便 能 吸 收 噬 菌 体 的 DNA。 1972年 美 国斯 坦 福 大 学 S.Cohen报 道 ， 经 氯 化 钙 处 理 的 大 肠 杆 菌 细 胞也 能 摄 取 质 粒 DNA。 大 肠 杆 菌 转 化 体 系 的 建 立 ， 对 重 组 DNA技 术 的 创 立 具 有 特 别 重 要 的 意 义 。 3、 Southern杂 交 、 DNA序 列 分 析 和 聚 合 酶 链 反 应 5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 Southern印 迹 结 果 重 组 DNA技 术 (recombinant DNA technique): 是按 照 人 们 意 愿 ， 在 体 外 对 DNA分 子 进 行 重 组 ,再 将重 组 分 子 导 入 受 体 细 胞 ， 使 其 在 细 胞 中 扩 增 和 繁殖 ， 以 获 得 该 DNA的 大 量 拷 贝 。 基 因 克 隆 (gene cloning) 分 子 克 隆 (molecular cloning) 5.1.3 重 组 DNA技 术 的 概 念5.1 重 组 DNA技 术 回 顾克 隆 来 自 同 一 始 祖 的 相 同 副 本 或 拷 贝 的 集 合 5.1.4 重 组 DNA技 术 的 基 本 步 骤 1、 四 大 要 素 外 源 基 因 （ 目 的 基 因 ） 载 体 工 具 酶 受 体 细 胞 5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 2、 重 组 DNA技 术 的 基 本 步 骤 目 的 基 因 的 获 得 与 载 体 的 制 备 目 的 基 因 与 载 体 DNA的 连 接 重 组 DNA分 子 导 入 受 体 细 胞 重 组 体 的 筛 选 与 重 组 DNA的 鉴 定 克 隆 基 因 的 表 达 及 表 达 产 物 的 检 测 与 分离 纯 化 5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 重 组 DNA技 术 操 作 的 主 要 步 骤载 体质 粒 噬 菌 体 病 毒 目 的 基 因 （ 外 源 基 因 ）基 因 组 DNA cDNA 人 工 合 成 PCR产 物限 制 酶 消 化开 环 载 体 DNA 目 的 基 因连 接 酶重 组 体转 化 体 外 包 装 ， 转 染带 重 组 体 的 宿 主筛 选 表 型 筛 选 酶 切 电 泳 鉴 定 菌 落 原 位 杂 交 5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 重 组 DNA技 术 操 作 过 程 可 形 象 归 纳 为 ： 分 分 离 目 的 基 因 切 限 制 酶 切 目 的 基 因 与 载 体接 拼 接 重 组 体 转 转 入 受 体 细 胞筛 筛 选 重 组 体 5.1.5 重 组 DNA技 术 的 意 义 重 组 DNA技 术 填 平 了 生 物 种 属 间 不 可 逾 越 的 鸿 沟 重 组 DNA技 术 缩 短 了 进 化 时 间 重 组 DNA技 术 使 人 能 对 生 物 进 行 定 向 改 造 体 外 大 量 扩 增 、 研 究 其 结 构 、 功 能 及 调 控 机 制 ，从 而 拓 宽 了 分 子 生 物 学 的 研 究 领 域 ， 这 对 医 学 上各 种 疾 病 等 病 因 的 查 明 、 诊 断 及 治 疗 具 有 重 大 意义 。 5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 酶 类 功 能限 制 性 核 酸 内 切 酶 识 别 并 在 特 定 位 点 切 开 DNADNA连 接 酶 通 过 磷 酸 二 酯 键 把 两 个 或 多 个 DNA片 段 连 接 成 一 个DNA分 子DNA聚 合 酶 按 5到 3方 向 加 入 新 的 核 苷 酸 ， 补 平 DNA双 链 中 的缺 口反 转 录 酶 按 照 RNA分 子 中 的 碱 基 序 列 ， 根 据 碱 基 互 补 原 则 合成 DNA链多 核 苷 酸 激 酶 把 磷 酸 基 团 加 到 多 聚 核 苷 酸 链 的 5-OH末 端末 端 转 移 酶 在 双 链 核 酸 的 3末 端 加 上 多 聚 单 核 苷 酸DNA外 切 酶 从 DNA链 的 3末 端 逐 个 切 除 单 核 苷 酸 噬 菌 体 DNA外 切 酶 从 DNA链 的 5末 端 逐 个 切 除 单 核 苷 酸 碱 性 磷 酸 酯 酶 切 除 位 于 DNA链 5或 3末 端 的 磷 酸 基 团 5.1.6 重 组 DNA实 验 中 常 见 的 主 要 工 具 酶5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 限 制 性 核 酸 内 切 酶GGATCCCCTAGG GCCTAG GATCC GBam H 限 制 性 核 酸 内 切 酶 (restriction endonuclease, RE)一 类 能 识 别 和 切 割 双 链 DNA分 子 中 特 定 碱 基 顺 序 的 核 酸水 解 酶 .1972年 发 现 第 一 个 内 切 核 酸 酶 EcoR 。 分 类 : 、 、 （ 基 因 工 程 技 术 中 常 用 型 ）5.1、 重 组 DNA技 术 回 顾 第 一 个 字 母 取 自 产 生 该 酶 的 细 菌 属 名 ， 用 大 写 ；第 二 、 第 三 个 字 母 是 该 细 菌 的 种 名 ， 用 小 写 ；第 四 个 字 母 代 表 株 ；用 罗 马 数 字 表 示 发 现 的 先 后 次 序 。命 名 H in d 属 系 株 序H aemophilus influenzae d株流 感 嗜 血 杆 菌 d株 的 第 三 种 酶5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 类 酶 识 别 序 列 特 点 回 文 结 构 (palindrome)即 反 相 重 复 结 构 ， 是 DNA分 子 中 以 某 一 处 为 轴 ， 其 两 侧 核 苷 酸 排 列呈 回 文 对 称 的 序 列 。切 口 ： 平 端 切 口 、 粘 端 切 口5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 Bam H GTCCAG GCCTAG GATCC GGGATCCCCTAGGH ind GTCGACCAGCTGGACCTG平 端 切 口 粘 端 切 口5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 DNA连 接 酶 : 通 过 磷 酸 二 酯 键 把 两 个 或 多 个 DNA片断 连 接 成 一 个 整 体 DNA分 子 。 1967年 相 继 发 现 。 T4DNA连 接 酶 EcoR I 连 接 酶 T7DNA连 接 酶5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 1. 化 学 合 成 法要 求 ： 已 知 目 的 基 因 的 核 苷 酸 序 列 或 其 产 物 的氨 基 酸 序 列 。2. 基 因 组 DNA文 库 (genomic DNA library)3. cDNA文 库 (cDNA library)4. 聚 合 酶 链 反 应 (polymerase chain reaction, PCR)5.1 重 组 DNA技 术 回 顾5.1.7 目 的 基 因 的 来 源 化 学 合 成 法 获 取 目 的 基 因由 已 知 氨 基 酸 序 列 推 测 可 能 的 DNA序 列 。 组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基 因 组 DNA文 库存 在 于 转 化 细 胞 内由 克 隆 载 体 所 携 带 的 所有 基 因 组 DNA的 集 合从 基 因 组 DNA文库 获 取 目 的 基 因 限 制 酶 切 位 点 限 制 酶 消 化 除 去 中 间 片 段cos L R coscos L左 臂 R cos右 臂 真 核 生 物 染色 体 DNA限 制 酶 部 分 消 化 外 源 DNA与 载 体 DNA混 合 连 接 反 应 体 外 包 装 用 重 组 噬 菌 体感 染 大 肠 杆 菌 20 Kb DNA 片 段 cos L R cos20 Kb 外 源 DNA 片 段 基 因 文 库用 随 机 切 割 的 真 核 生 物 染 色 体 DNA片 段 构 建 基 因 文 库 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文 库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从 cDNA文 库 获 取 目 的 基 因 逆 转 录 酶A A A A T T T T AAAASI核 酸 酶 DNA聚 合 酶 碱 水 解 T T T T 5.1.8 重 组 实 验 中 的 基 因 载 体定 义 ： 为 携 带 目 的 基 因 ， 实 现 其 无 性 繁 殖或 表 达 有 意 义 的 蛋 白 质 所 采 用 的 一 些 DNA分子 。5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 克 隆 载 体 (cloning vector)为 使 插 入 的 外 源 DNA序 列 被 扩 增 而 特 意 设计 的 载 体 称 为 克 隆 载 体 。表 达 载 体 (expression vector) 为 使 插 入 的 外 源 DNA序 列 可 转 录 翻 译 成 多肽 链 而 特 意 设 计 的 载 体 称 为 表 达 载 体 。5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 载 体 的 选 择 标 准 能 自 主 复 制 ； 具 有 两 个 以 上 的 遗 传 标 记 物 ， 便 于 重 组 体 的 筛 选和 鉴 定 ； 有 克 隆 位 点 （ 外 源 DNA插 入 点 ） ， 常 具 有 多 个 单 一酶 切 位 点 ， 称 为 多 克 隆 位 点 ； 分 子 量 小 ， 以 容 纳 较 大 的 外 源 DNA。5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 噬 菌 体 载 体 ： 双 链 DNA病 毒 ， 约 50kb,两 端 有 一 个 12个 核 苷 酸 5端 突 出 粘 性 末 端 噬 菌 体 黏 粒 、 YAC、 BAC ： 高 容 量 载 体5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 克 隆 载 体 所 容 纳 的 外 原 DNA片 段 的 大 小 质 粒 ： 10kb 噬 菌 体 ： 23kb 黏 粒 ： 45kb BAC： 350kb YAC： 1000kb5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程5.1 重 组 DNA技 术 回 顾 5.2 DNA基 本 操 作 技 术5.2.1 核 酸 凝 胶 电 泳 技 术5.2.2 细 菌 转 化 与 目 标 DNA分 子 的 增 殖5.2.3 聚 合 酶 链 式 反 应 （ PCR） 技 术5.2.4 实 时 定 量 PCR技 术5.2.5 基 因 组 DNA文 库 构 建 在 生 理 条 件 下 ， 核 酸 分 子 之 戊 糖 -磷 酸 骨 架 中 的 磷 酸 基团 ， 呈 离 子 化 状 态 ， DNA和 RNA多 核 苷 酸 链 称 为 多 聚 阴离 子 ， 把 它 们 放 置 在 电 场 当 中 ， 会 向 正 电 极 的 方 向 迁 移。 由 于 戊 糖 -磷 酸 骨 架 在 结 构 上 的 重 复 性 质 ， 相 同 数 量的 双 链 DNA几 乎 具 有 等 量 的 净 电 荷 ， 因 此 它 们 能 以 同 样的 速 度 向 正 电 极 方 向 迁 移 。 在 一 定 的 电 场 强 度 下 ， DNA分 子 的 迁 移 速 度 ， 取决 于 核 酸 分 子 本 身 的 大 小 和 构 型 。 这 就 是 应 用凝 胶 电 泳 技 术 分 离 DNA片 段 的 基 本 原 理 。5.2 DNA基 本 操 作 技 术5.2.1 核 酸 凝 胶 电 泳 技 术 5.2 DNA基 本 操 作 技 术琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ： 分 辨 力 0.250kb （ 常 用 ）聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ： 分 辨 力 11000bp核 酸 分 析凝 胶 浓 度 的 高 低 影 响 凝 胶 介 质 孔 隙 的 大 小 ；凝 胶 浓 度 越 大 ， 空 隙 越 小 ， 其 分 辨 能 力 越 强 ；反 之 ， 凝 胶 浓 度 越 低 ， 空 隙 越 大 ， 分 辨 能 力 越 小 。 2021-5-29 36 n 在 凝 胶 电 泳 中 ， 加 入 溴 化 乙 锭 （ EtBr） 染料 对 核 酸 分 子 进 行 染 色 ， 然 后 放 置 在 紫 外 光下 观 察 ， 可 灵 敏 而 快 捷 地 检 测 出 凝 胶 介 质 中DNA的 谱 带 部 位 ， 即 使 每 条 DNA带 中 仅 含 有0.05g的 微 量 DNA， 也 可 以 被 清 晰 地 检 测 出来 。 n 溴 化 乙 锭 能 插 入 到 DNA或 RNA分 子 的 相邻 碱 基 之 间 ， 并 在 300nm的 紫 外 线 照 射 下 发出 荧 光 。5.2 DNA基 本 操 作 技 术n 荧 光 染 料 ： 溴 化 乙 锭 （ EtBr） 溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。5.2 DNA基 本 操 作 技 术 2021-5-29 40 普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于50kb的DNA分子，而要进行超大分子研究，要用到脉冲电场凝胶电泳。5.2 DNA基 本 操 作 技 术 2021-5-29 41 所 谓 细 菌 转 化 ， 是 指 一 种 细 菌 菌 株 由 于 捕 获 了 来自 另 一 种 细 菌 菌 株 的 DNA而 导 致 性 状 特 征 发 生 遗传 改 变 的 生 命 过 程 。 提 供 转 化 DNA的 菌 株 叫 作 供 体 菌 株 ； 接 受 转 化 DNA的 细 菌 菌 株 则 被 称 为 受 体 菌 株 。5.2.2 细 菌 转 化 与 目 标 DNA分 子 的 增 殖5.2 DNA基 本 操 作 技 术 5.2 DNA基 本 操 作 技 术转 化 （ transformation） ： P163感 受 态 细 胞 （ Competent cells） ：受 体 细 胞 经 过 一 些 特 殊 方 法 （ 如 ： CaCl2等 化学 试 剂 法 ） 的 处 理 后 ， 细 胞 膜 的 通 透 性 发 生 变化 ， 能 容 许 有 外 源 DNA的 载 体 分 子 通 过 ， 处 于这 种 状 态 下 的 细 胞 称 将 异 源 DNA分 子 引 入 一 细 胞 株 系 ， 使 受 体 细 胞获 得 新 的 遗 传 性 状转 导 ？ 转 染 ？ 感 染 ？ 常 用 的 转 化 方 法 ： 化 学 转 化 （ CaCl2） 法 电 击 法 重 组 DNA分 子 的 体 外 包 装 法5.2 DNA基 本 操 作 技 术 n 化 学 转 化 原 理 ： 将 快 速 生 长 中 的 大 肠 杆 菌 置 于 0 冷 冻 处 理 时 ，处 于 CaCl 2低 渗 溶 液 中 的 大 肠 杆 菌 细 胞 膨 胀 成 球 形 ，DNA可 吸 附 于 其 表 面 。 在 42 下 做 短 暂 的 热 刺 激 下 ， 外 源 DNA即 被 细胞 吸 收 。 将 转 化 后 的 细 胞 在 选 择 培 养 基 上 培 养 ， 筛 选 出带 有 外 源 DNA分 子 的 阳 性 克 隆 。 阳 性 克 隆 在 全 培 养 基 中 生 长 一 段 时 间 使 转 化 基因 实 现 表 达 。5.2 DNA基 本 操 作 技 术n CaCl 2 法 是 制 备 大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞 最 常 用 的 方 法 。 n 电 击 转 化 ： 一 种 高 效 方 法 。使 用 低 盐 缓 冲 液 或 水 洗 制 备 的 感 受 态 细 胞 ， 通 过高 压 脉 冲 的 作 用 将 载 体 DNA分 子 导 入 受 体 细 胞 。菌 液 ： 生 长 对 数 期场 强 (最 大 转 化 效 率 )： 12.5-15kV/cm 温 度 ： 0-4 5.2 DNA基 本 操 作 技 术 P1655.2 DNA基 本 操 作 技 术重 组 DNA分 子的 体 外 包 装 法 5.2 DNA基 本 操 作 技 术 DNA克 隆 的 筛 选 ： 抗 生 素 抗 性 基 因 。 常 用 的 抗 生 素 有 ： 氨 苄 青 霉 素 、 卡 那 霉 素 、 氯 霉 素 、四 环 素 、 链 霉 素 等 -互 补 蓝 白 斑 筛 选 营 养 条 件 （ 自 养 、 异 养 ）5.2 DNA基 本 操 作 技 术 Antibiotic resistance genes5.2 DNA基 本 操 作 技 术 direct selectionThe procedure to form recombinant DNA -互 补 筛 选5.2 DNA基 本 操 作 技 术n质 粒 ： 携 带 -半 乳 糖 苷 酶 基 因 （ LacZ） 的 调 控序 列 和 氨 基 端 （ N端 ） 146个 氨 基 酸 编 码 序 列 。n大 肠 杆 菌 ： 携 带 -半 乳 糖 苷 酶 （ LacZ） 羧 基 端（ C端 ） 部 分 编 码 序 列 。 只 有 LacZ的 N端 和 C端 全 部 表 达 ， 酶 才 有 活 性 。n IPTG /X-gal的 培 养 基 上 筛 选 蓝 白 斑 蓝 白 斑 筛 选 Lac Z , IPTG X-gal X + gal （ 白 色 ） （ 蓝 色 ） Lac Z（ 失 活 ） , IPTG X-gal X-gal （ 白 色 ） （ 白 色 ）5.2 DNA基 本 操 作 技 术 互补的检测 蓝 白 斑5.2 DNA基 本 操 作 技 术 转 化 率 的 计 算 ： 转 化 体 总 数 菌 落 数 （ 转 化 反 应 原 液 总 体 积 /涂板 菌 液 体 积 ） 插 入 频 率 白 色 菌 落 数 /蓝 色 菌 落 数 +白 色 菌 落 数 转 化 频 率 转 化 体 总 数 /加 入 质 粒 DNA的 量 （ 计 算出 每 微 克 的 转 化 菌 落 数 ）5.2 DNA基 本 操 作 技 术 5.2.3 聚 合 酶 链 式 反 应 （ PCR） 技 术 1985年 ， K.Mullis等 研 究 成 功 的 一 种 在 体 外快 速 扩 增 特 定 基 因 DNA序 列 的 方 法 原 理 ： 类 似 于 天 然 的 DNA复 制 过 程 。 将 待 扩增 的 DNA片 段 和 两 侧 互 补 的 两 段 寡 核 苷 酸 引物 ， 经 过 变 性 ， 退 火 和 延 伸 若 干 个 循 环 后 ，DNA扩 增 倍 数 可 达 2n 倍5.2 DNA基 本 操 作 技 术 反 应 体 系 模 板 DNA： 待 扩 增 的 目 的 片 段 特 异 性 引 物 ： 人 工 合 成 的 与 待 扩 增 的 靶 DNA两 端 序列 互 补 的 寡 核 苷 酸 片 段 ， 15-30bp DNA聚 合 酶 dNTP 含 有 Mg2+的 缓 冲 液5.2 DNA基 本 操 作 技 术 PCR的 基 本 反 应 步 骤 ：1. 变 性 ： 95 ， 模 板 DNA变 性 为 单 链 ；2. 退 火 ： 50 左 右 ， 使 引 物 与 模 板 DNA退 火 结 合 ；3. 延 伸 ： 72 ， DNA聚 合 酶 以 dNTP为 底 物 催 化 DNA的 合 成 反 应 。上 述 三 个 步 骤 为 一 个 循 环 ， 经 25-30次 循 环 后 ， 可 将 模 板 DNA扩 增 达 百 万 倍 。5.2 DNA基 本 操 作 技 术 5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 1 55 5 5 5 5Template DNA 55 555 5 5 5 PCR基 本 反 应 步 骤5.2 DNA基 本 操 作 技 术 Cycle 3 55 555 5 5 55 5 5 5 5 55 525 30 次 循 环 后 ， 模 板 DNA的 含 量可 以 扩 大 100万 倍 以 上 。5.2 DNA基 本 操 作 技 术 PCR技 术 在 基 因 克 隆 方 面 的 应 用 （ 1） 目 的 基 因 的 直 接 克 隆 ， （ 2） 通 过 RT-PCR进 行 cDNA的 克 隆 ； （ 3） 制 备 DNA探 针 ， 进 行 分 子 检 测 等 。 5.2 DNA基 本 操 作 技 术 PCR反 应 中 ， 当 引 物 模 板 与 DNA聚 合 酶 达 到 一 定 比 值时 ， DNA聚 合 酶 催 化 的 反 应 趋 于 饱 和 ， 出 现 “ 平 台 效应 ” ， 即 PCR反 应 产 物 不 再 增 加 。 定 量 PCR与 定 性 PCR测 定 指 数 扩 增 期 扩 增 的 平 台 期 5.2 DNA基 本 操 作 技 术5.2.4 实 时 定 量 PCR技 术实 时 PCR(real-time PCR)技 术 通 过动 态 监 测 反 应 过 程 中 的 产 物 量 ， 消 除 了产 物 堆 积 对 定 量 分 析 的 干 扰 ， 亦 被 称 为定 量 PCR。 20世 纪 90年 代 末 期 出 现 。 实 时 荧 光 定 量 PCRPCR扩 增 反 应 中 ， 引 入 一 种 荧 光 化 学 物 质， 对 每 一 个 循 环 产 物 荧 光 信 号 的 实 时 检 测 可 以 得 到 荧 光 扩 增 曲 线实 现 对 起 始 模 板 定 量 和 定 性 分 析5.2 DNA基 本 操 作 技 术 两 种 定 量 化 学荧 光 染 料 染 色 SYBR Green I EB探 针 标 记 Tagman 分 子 信 标5.2 DNA基 本 操 作 技 术 荧 光 染 料 染 色SYBR Green I 是 一 种 DNA小 沟 结 合 染 料与 DNA双 链 结 合 时 发 光游 离 时 不 发 光5.2 DNA基 本 操 作 技 术 PCR过 程 中 荧 光 染 料 的 掺 入 ： 信 号 强 度 与 双 链DNA分 子 数 正 比 。 激 发 光 波 长 520nm。5.2 DNA基 本 操 作 技 术 染 料 的 特 点5.2 DNA基 本 操 作 技 术 Taqman探 针一 种 寡 核 苷 酸 探 针 ， 它 的 荧 光 与 目 的 序 列 扩 增 有 关 。探 针 5端 连 接 荧 光 (报 告 )基 团 ， 3端 连 接 淬 灭 基 团 。PCR延 伸 反 应 时 ， 利 用 DNA聚 合 酶 的 5 3外 切 酶活 性 ， 使 荧 光 基 团 和 淬 灭 基 团 分 离 ， 发 出 荧 光 信 号 。5.2 DNA基 本 操 作 技 术 5端 连 接 荧 光 基 团中 段 特 异 碱 基 序 列 （ 50-150bp）3端 连 接 淬 灭 基 团 信 号 强 度 与 结 合 探 针 的 DNA分 子 数 成 正 比 5.2 DNA基 本 操 作 技 术n 实 时 荧 光 定 量 PCR技 术 原 理 n 实 时 荧 光 定 量 PCR技 术 原 理QR 335 5上 游 引 物 下 游 引物荧 光 标 记 引 物 R Q 3 355 5.2 DNA基 本 操 作 技 术 分 子 信 标 TaqMan探 针 的 衍 生 物 发 夹 型 杂 交 探 针形 成 茎 环 结 构 的 双 标 记 寡 核 苷 酸 探 针发 夹 结 构 的 两 端 分 别 连 接 荧 光 基 团 和 淬 灭 基 团 。利 用 分 子 构 象 的 改 变 使 得 荧 光 基 团 和 淬 灭 基 团 分 开 。5.2 DNA基 本 操 作 技 术 探 针 的 特 点5.2 DNA基 本 操 作 技 术 方 法 优 点 缺 点 适 用 范 围SYBR Green I 方 法 适 用 性 广灵 敏方 便便 宜 引 物 要 求 高易 出 现 非 特 异 性带不 能 进 行 多 重 定量 适 合 科 研 中 对 各 种 目的 基 因 定 量 分 析 ， 基因 表 达 量 的 研 究 ， 转基 因 重 组 动 植 物 的 研究TaqMan 方 法 特 异 性 高重 复 性 好多 重 定 量 价 格 高只 适 合 特 定 目 标 病 原 体 检 测 ， 疾 病 耐药 基 因 研 究 ,药 物 疗效 考 核遗 传 疾 病 的 诊 断不 同 实 时 定 量 方 法 的 比 较5.2 DNA基 本 操 作 技 术 基 因 组 DNA文 库 (genomic DNA library) cDNA文 库 (cDNA library) n 基 因 文 库 (gene library)是 指 一 个 包 含 了 某 一 生 物 体 全 部DNA序 列 的 克 隆 群 体 。5.2 DNA基 本 操 作 技 术5.2.5 基 因 组 DNA文 库 构 建 基 因 组 DNA文 库基 因 组 DNA文 库 是 指 生 物 的 基 因 组DNA的 信 息 （ 包 括 所 有 的 编 码 区 和 非 编码 区 ） 以 DNA片 段 形 式 贮 存 的 克 隆 群 体 。 用 于 构 建 基 因 组 文 库 的 载 体 有 噬 菌体 、 粘 粒 和 酵 母 人 工 染 色 体 等 。5.2 DNA基 本 操 作 技 术 n基 因 组 文 库 和 cDNA文 库 的 构 建 和 筛 选体 外 包 装 噬 菌 体 5.3 RNA基 本 操 作 技 术5.3.1 总 RNA的 提 取5.3.2 mRNA的 纯 化5.3.3 cDNA的 合 成5.3.4 cDNA文 库 的 构 建5.3.5 基 因 文 库 的 筛 选 5.3 RNA基 本 操 作 技 术5.3.1 总 RNA的 提 取 RNA易 遭 降 解 ， 实 验 要 求 较 严 格 。 总 RNA提 取 的 方 法 有 多种 ， 主 要 有 LiCl法 、 CTAB法 、 异 硫 氰 酸 胍 法 （ TriZol） 。 异 硫 氰 酸 胍 法 （ TriZol） 原 理 ： TRIZOL试 剂 中 的 主 要 成 分 为 异 硫 氰 酸 胍 和 苯 酚 ， 其 中 异 硫氰 酸 胍 可 裂 解 细 胞 ， 促 使 核 蛋 白 体 的 解 离 ， 使 RNA与 蛋 白质 分 离 ， 并 将 RNA释 放 到 溶 液 中 。 当 加 入 氯 仿 时 ， 它 可 抽提 酸 性 的 苯 酚 ， 而 酸 性 苯 酚 可 促 使 RNA进 入 水 相 ， 离 心 后可 形 成 水 相 层 和 有 机 层 ， 这 样 RNA与 仍 留 在 有 机 相 中 的 蛋白 质 和 DNA分 离 开 。 水 相 层 （ 无 色 ） 主 要 为 RNA， 有 机 层 （ 黄 色 ） 主 要 为 DNA和 蛋 白 质 。收 集 含 有 RNA的 水 相 ， 通 过 异 丙 醇 沉 淀 ， 可 获 得 比 较 纯 的 总 RNA。 DNA或 RNA的 定 量OD260=1.0相 当 于50g/ml 双 链 DNA40g/ml RNA33g/ml 单 链 DNA 判 断 核 酸 样 品 的 纯 度DNA纯 品 : OD260/OD280 = 1.8RNA纯 品 : OD 260/OD280 = 1.8-2.0 u OD260的 应 用 5.3.2 mRNA的 纯 化5.3 RNA基 本 操 作 技 术 mRNA的 分 离 方 法 较 多 ， 其 中 以 寡 聚 （ dT） -纤 维 素 柱 层 析法 最 为 有 效 ， 已 成 为 常 规 方 法 。 利 用 mRNA的 Poly A结 构 ， 试 剂 盒 提 供 一 种 生 物 素 化 寡 聚dT引 物 ， 与 Poly A杂 交 ， 形 成 生 物 素 化 寡 聚 dT-mRNA的 杂交 体 ， 然 后 利 用 生 物 素 与 抗 生 物 素 蛋 白 的 结 合 作 用 ， 形 成 抗生 物 素 -顺 磁 颗 粒 （ SA-PMPs） 结 合 杂 交 体 ， 形 成 生 物 素 化寡 聚 dT-mRNA-SA-PMPs复 合 物 ， 再 利 用 磁 性 吸 附 作 用 以磁 性 条 吸 附 复 合 物 中 的 SA-PMPs颗 粒 ， 最 后 利 用 高 严 紧 度盐 溶 液 中 分 子 杂 交 体 磁 性 减 弱 ， 杂 交 体 中 生 物 素 化 寡 聚 dT引 物 与 mRNA分 离 ， 从 而 纯 化 得 到 mRNA。 2021-5-29 85 PolyATtract mRNA的分离纯化过程简图5.3 RNA基 本 操 作 技 术 5.3.3 cDNA的 合 成5.3 RNA基 本 操 作 技 术 cDNA的 合 成 包 括 第 一 链 和 第 二 链 cDNA的 合 成 。 第 一 链 cDNA的 合 成 是 以 mRNA为 模 板 ， 反 转 录 为 cDNA，有 反 转 录 酶 催 化 ， 该 酶 合 成 DNA时 需 要 引 物 引 导 ， 常 用 引物 是 oligo dT。 第 二 链 合 成 是 以 第 一 链 为 模 板 ， 由 DNA聚 合 酶 催 化 。 cDNA文 库 是 包 含 某 一 组 织 细 胞 在 一定 条 件 下 所 表 达 的 全 部 mRNA经 逆 转 录而 合 成 的 cDNA序 列 的 克 隆 群 体 ， 它 以cDNA片 段 的 形 式 贮 存 着 该 组 织 细 胞 的基 因 表 达 信 息 。 5.3 RNA基 本 操 作 技 术5.3.4 cDNA文 库 的 构 建 cDNA文 库 (complementary DNA library)以组 织 细 胞 中 的 mRNA为 模 板 ， 反 转 录 合 成双 链 cDNA ， 各 cDNA分 子 分 别 插 入 载 体 形成 重 组 子 ， 再 导 入 宿 主 细 胞 克 隆 扩 增 。 这些 在 重 组 体 内 的 cDNA的 集 合 即 cDNA文 库 。5.3 RNA基 本 操 作 技 术l cDNA文 库 构 建 基 本 程 序 ： 构 建 步 骤 ： 1、 高 质 量 mRNA制 备 ： 纯 化 试 剂 盒 ， 生 物 素 2、 反 转 录 生 成 cDNA: 反 转 录 酶 ， olig(dt) ,R6 3、 与 噬 菌 体 载 体 分 子 连 接 4、 噬 菌 体 的 包 装5.3 RNA基 本 操 作 技 术 5.3 RNA基 本 操 作 技 术 mRNA逆转录酶 cDNA复制 双 链 cDNA载体 重 组 DNA分 子受体菌 含重组分子的转化菌 5.3 RNA基 本 操 作 技 术 2021-5-29 92 基 因 文 库 的 筛 选 是 指 通 过 某 种 特 殊 方 法 从 基 因 文 库中 鉴 定 出 含 有 所 需 重 组 DNA分 子 的 特 定 克 隆 的 过 程。 筛 选 方 法 有 很 多 种 ， 常 用 的 有 ：核 酸 杂 交 法 ： 广 泛 的 适 用 性 和 快 速 性 。PCR筛 选 法 ： 前 提 是 获 得 基 因 的 特 异 性 引 物 。免 疫 筛 选 法 ： 适 用 于 表 达 文 库 的 筛 选 。5.3.5 基 因 文 库 的 筛 选5.3 RNA基 本 操 作 技 术 DNA探 针 ：带 有 特 殊 碱 基序 列 的 单 链 DNA或 RNA分 子 ,可以 用 放 射 性 物质 或 免 疫 性 物质 标 记 ,通 过 杂交 ,检 查 样 品 。DNA探 针 常 用 于检 测 互 补 的 碱基 序 列 。 5.3 RNA基 本 操 作 技 术 5.4 SNP的 理 论 与 应 用5.4.1 SNP概 述5.4.2 SNP的 检 测 技 术5.4.3 SNP的 应 用 5.4.1 SNP概 述 SNP（ single nucleotide polymorphism） 即 单核 苷 酸 多 态 性 ， 指 基 因 组 DNA序 列 中 由 于 单个 核 苷 酸 的 突 变 而 引 起 的 多 态 性 。 在 人 类 基 因 组 发 生 的 频 率 可 达 1%或 更 高 。 每 300-1000个 bp就 有 一 个 SNP。 一 个 SNP表 示 在 基 因 组 某 个 位 点 上 有 一 个 核苷 酸 的 变 化 ， 源 于 单 个 碱 基 的 转 换 或 颠 换5.4 SNP的 理 论 与 应 用 SNP分 类 ：5.4 SNP的 理 论 与 应 用 1、 根 据 SNP在 基 因 组 的 位 置 分 三 种 ： 基 因 编 码 区 SNP： 变 异 率 较 少 ， 占 1/5。 基 因 调 控 区 SNP： 会 影 响 基 因 表 达 量 的 多 少 。 基 因 间 随 机 非 编 码 区 SNP2、 根 据 对 生 物 遗 传 性 状 的 影 响 分 两 类 ： 同 义 SNP： 不 影 响 氨 基 酸 的 翻 译 。 。 非 同 义 SNP： 改 变 氨 基 酸 序 列 ， 影 响 蛋 白 质 功 能 。 u SNPs的 研 究 意 义1. SNPs作 为 第 三 代 遗 传 标 记 （ 已 知 性 、 可遗 传 性 、 可 检 测 性 ） ， 用 于 疾 病 基 因 的定 位 、 克 隆 和 鉴 定 。 _路 标 的 作 用5.4 SNP的 理 论 与 应 用 2. 基 因 多 态 性 研 究 研 究 SNPs本 身 对 机 体 的 影 响 （ 生 理 特 征 、 病 理 条 件 下 的 千 差 万 别 ） u SNPs研 究 进 展 和 方 向1. SNPs数 据 库 的 构 建 发 现2. SNPs功 能 的 研 究 （ 在 1的 基 础 上 ）5.4 SNP的 理 论 与 应 用 1. 理 想 的 检 测 SNP的 方 法 发 现 未 知 的 SNP， 或 检 测 已 知 的 SNP(1) 灵 敏 度 和 准 确 度 的 要 求 （ 反 应 原 理 严 紧 ）(2) 快 速 、 简 便 、 高 通 量 (操 作 和 分 析 的 自 动 化 程 度 高 ） (3) 费 用 相 对 低 廉5.4 SNP的 理 论 与 应 用 5.4.2 SNP的 检 测 技 术 3.每 种 SNP的 检 测 方 法 都 由 两 部 分 组 成 : 区 分 SNPs特 异 位 点 的 原 理 方 法 数 据 的 检 测 分 析 手 段5.4 SNP的 理 论 与 应 用 2. 现 状 ： 到 现 在 还 没 有 一 个 符 合 以 上 条 件 的 理 想 方 法 出 现 , 但 根 据 实 际 情 况 ,可 以 选 择 出 较 合 适 方 法 。 SNP检 测 方 法 的 分 类u 区 分 SNP 特 异 位 点 的 原 理 方 法 1.基 于 杂 交 的 方 法 2.基 于 酶 的 方 法 3.以 构 象 为 基 础 的 方 法 4.直 接 测 序 的 方 法 u 数 据 检 测 分 析 技 术 1.凝 胶 分 析 技 术 2.荧 光 检 测 技 术 3.DNA 芯 片 4.质 谱 检 测 技 术 5.4 SNP的 理 论 与 应 用 5.4 SNP的 理 论 与 应 用 5.4.3 SNP的 应 用1、 人 类 基 因 单 体 型 图 的 绘 制2、 SNP与 疾 病 易 感 基 因 的 相 关 性 分 析3、 指 导 用 药 与 药 物 设 计4、 遗 传 病 研 究 、 动 植 物 遗 传 育 种 2021-5-29 103 在 多 细 胞 的 高 等 生 物 个 体 水 平 上 ， 人 们 用 克 隆 （ clone） 表 示 由 具 有 相 同 基 因 型 的 同 一 物 种 的 两 个 或 数 个 个 体组 成 的 群 体 。 从 同 一 受 精 卵 分 裂 而 来 的 单 卵 双 生 子 （ monozygotic twins） 便 是 属 于 同 一 克 隆 。 在 细 胞 水 平 上 ， 克 隆 一 词 是 指 由 同 一 个 祖 细 胞 （ progenitor cell） 分 裂 而 来 的 一 群 带 有 完 全 相 同 遗 传物 质 的 子 细 胞 群 体 。 在 分 子 生 物 学 上 ， 人 们 把 将 外 源 DNA插 入 具 有 复 制 能 力的 载 体 DNA中 ， 使 之 得 以 永 久 保 存 和 复 制 这 种 过 程 称 为克 隆 。5.5 基 因 克 隆 技 术概 述 ： 5.5 基 因 克 隆 技 术5.5.1 RACE技 术5.5 基 因 克 隆 技 术5.5.2 应 用 cDNA差 示 分 析 法 克 隆 基 因5.5.3 G ateway 大 规 模 克 隆 技 术5.5.4 基 因 的 图 位 克 隆 5.5 基 因 克 隆 技 术5.5.1 RACE技 术 是 一 种 在 已 知 cDNA序 列 的 基 础 上 ， 快 速 克 隆3 或 5 端 缺 失 序 列 的 技 术 ； 是 以 mRNA为 模 板 反 转 录 成 cDNA第 一 链 后 ， 用PCR技 术 扩 增 出 某 个 特 异 位 点 到 3 或 5 端 之间 未 知 序 列 的 方 法 。 RACE： rapid amplification of cDNA ends 2021-5-29 106 RACE技 术 是 用 于 从 已 知 cDNA片 段 扩 增 全 长 基 因 的 方 法 ， 它 根 据 已知 序 列 设 计 基 因 片 段 内 部 特 异 引 物 ， 由 该 片 段 向 外 侧 进 行PCR扩 增 得 到 目 的 序 列 。 用 于 扩 增 5端 的 方 法 称 为 5RACE; 用 于 扩 增 3端 的 称 为 3RACE。 已 知 cDNA序 列 可 来 自 序 列 表 达 标 签 、 减 法 cDNA库 、 差法 显 示 和 基 因 文 库 筛 选 。5.5 基 因 克 隆 技 术 2021-5-29 107 5 RACE 在 反 转 录 酶 作 用 下 ， 以 已 知 基因 片 段 内 部 特 异 性 引 物 启 始cDNA第 一 条 链 的 合 成 RNase混 合 物 降 解 模 板 mRNA， 纯 化 cDNA第 一 条 链 。 用 末 端 转 移 酶 在 cDNA链 3端加 入 连 续 的 dCTP 以 连 有 oligo(dG) 的 锚 定 引 物和 基 因 片 段 内 部 特 异 的 nested引 物 进 行 PCR扩 增 ， 以 期 得 到目 的 片 段 ， 并 可 用 nest PCR进 行 检 测 。 5.5 基 因 克 隆 技 术 2021-5-29 108 3RACE 是 在 反 转 录 酶 的 作 用 下 ， 以 连有 可 以 和 p o l y A 配 对 的oligo(dT)的 锚 定 引 物 启 始cDNA第 一 条 链 的 合 成 。 用 RNaseH 降 解 模 板 mRNA。 用 通 用 锚 定 引 物 和 基 因 片 段 内部 特 异 引 物 进 行 PCR扩 增 得 到目 的 3片 段 ， 并 可 用 nest PCR的 方 法 继 续 进 行 检 测 和 扩 增 。5.5 基 因 克 隆 技 术 mRNA的 获 取去 磷 酸 化加 寡 聚 接 头 （ 5 ）反 转 录 合 成 第 一 条 cDNA 5RACE， 扩 增 5 未 知 序 列 3 RACE扩 增 3未 知 序 列5 已 知 的 接 头 序 列 ；基 因 特 异 反 向 序 列 3 寡 聚 dT下 游 序 列 ； 基 因 特 异 反 向 序 列5.5 基 因 克 隆 技 术 5.5.2 应 用 cDNA差 示 分 析 法 克 隆 基 因 差 减 杂 交 与 RT-PCR方 法 相 结 合 ， 以 指数 形 式 扩 增 双 链 DNA模 板 ， 以 线 性 形 式扩 增 单 链 DNA模 板 ， 通 过 降 低 cDNA群体 复 杂 性 和 更 换 cDNA两 端 接 头 等 方 法 ，特 异 性 扩 增 目 的 基 因 片 段5.5 基 因 克 隆 技 术 cDNA-RDAcDNA差 示 分 析 法 ： 5.5 基 因 克 隆 技 术mRNA逆 转 录 为 cDNA，用 4碱 基 识 别 酶 消 化 ，与 接 头 1连 接 ， PCR 扩 增 ； 去 除 接 头 1，扩 增 子 接 上 接 头 2，与 驱 逐 子 杂 交 ， PCR扩 增 ； 去 除 接 头 2，加 上 接 头 3， 再 与driver杂 交 ， 再 扩增 ， 筛 选 出 目 的 片段 、 克 隆 、 测 序 。 cDNA-RDA主 要 步 骤 : 2021-5-29 112 v相 对 酶 切 构 建 载 体 来 说， 该 技 术 具 有 需 时 短 、 操作 简 单 、 易 于 各 实 验 室 交流 的 特 点 ， 即 只 需 通 过 简单 、 高 效 的 BP 和 LR 反 应就 可 实 现 把 PCR 产 物 定 向转 入 克 隆 质 粒 和 表 达 质 粒， 实 现 PCR 产 物 在 各 种 质粒 间 的 平 行 转 移 。5.5.3 G ateway 大 规 模 克 隆 技 术5.5 基 因 克 隆 技 术 2021-5-29 113 所 有 具 有 某 种 表 现 型 的 基 因 都 可 通 过 该 法 克 隆 得 到 。 首 先 ，通 过 构 建 遗 传 连 锁 图 ， 将 目 的 基 因 定 位 到 某 染 色 体 的 特 定 位点 ， 并 在 其 两 侧 确 定 紧 密 连 锁 的 RFLP或 RAPD分 子 标 记 。 通 过 对 许 多 不 同 的 生 态 型 及 大 量 限 制 性 内 切 酶 和 杂 交 探 针 的分 析 ， 找 出 与 目 的 基 因 距 离 最 近 的 RFLP标 记 ， 通 过 染 色 体步 移 技 术 将 位 于 这 两 个 标 记 之 间 的 基 因 片 段 克 隆 并 分 离 出 来5.5.4 基 因 的 图 位 克 隆 法 （ Map-based cloning）5.5 基 因 克 隆 技 术 1986年 提 出 ， 根 据 目 的 基 因 在 染 色 体 上 的 位 置 进 行 的 ， 无 需 预 先 知 道 基 因 的 DNA顺 序 ， 也 无 需 预 先 知 道 其 表 达 产 物 的 有 关 信 息 ， 但 必 须 建 立 遗 传 分 离 群 体 . 主 要 用 于 与 遗 传 病 相 关 基 因 等 致 病 基 因 的 克 隆 .5.5 基 因 克 隆 技 术基 因 的 图 位 克 隆 法 （ Map-based cloning） 1、 将 目 的 基 因 定 位 到 某 个 染 色 体 的 特 定 位 点 ， 并 在 其 两 侧 确 定 紧 密 连 锁 的 RFLP或 RAPD分 子 标 记2、 利 用 与 目 的 基 因 最 紧 密 连 锁 的 一 对 分 子 标 记 作 探 针 ， 通 过 染 色 体 步 移 技 术 将 位 于 这 两 个 标 记 之 间 的 基 因 片 段 克 隆 并 分 离 出 来3、 鉴 定 目 的 基 因步 骤 : 5.3 基 因 克 隆 技 术 简 介 染 色 体 步 移 ： 利 用 已 知 的 基 因 或 分 子 标 记 来 筛 选 大 片 段 的DNA文 库 获 得 阳 性 克 隆 ， 如 此 得 到 的 阳 性 克隆 是 “ 一 步 克 隆 ” ， 利 用 获 得 的 克 隆 作 探 针对 文 库 进 行 第 二 次 杂 交 ， 得 到 与 探 针 具 有 重复 序 列 的 阳 性 克 隆 称 为 “ 二 次 克 隆 ” ， 如 此反 复 即 可 取 到 需 要 要 得 克 隆 ， 获 得 目 的 基 因 。 5.5 基 因 克 隆 技 术 2021-5-29 117 蛋 白 质 组 学 的 发 展 既 是 技 术 所 推 动 的 ， 也 是 受技 术 限 制 的 。 蛋 白 质 组 学 研 究 成 功 与 否 ， 很 大 程 度上 取 决 于 其 技 术 方 法 水 平 的 高 低 。 蛋 白 质 研 究 技 术远 比 基 因 技 术 复 杂 和 困 难 。 蛋 白 质 组 的 研 究 实 质 上 是 在 细 胞 水 平 上 对 蛋白 质 进 行 大 规 模 的 平 行 分 离 和 分 析 ， 往 往 要 同 时 处理 成 千 上 万 种 蛋 白 质 。 因 此 ， 发 展 高 通 量 、 高 灵 敏度 、 高 准 确 性 的 研 究 技 术 平 台 是 现 在 乃 至 相 当 一 段时 间 内 蛋 白 质 组 学 研 究 中 的 主 要 任 务 。5.6 蛋 白 质 组 与 蛋 白 质 组 学 研 究 技 术 蛋 白 质 组 学 ： 蛋 白 质 和 基 因 组 研 究 相 结 合 ， 研 究 某 一 物 种 、 个 体 、 器 官 、 组 织 或 细 胞 在 特 定 条 件 、 特 定 时 间 所 表 达 的 全 部 蛋 白 质 图 谱 。5.6 蛋 白 质 组 与 蛋 白 质 组 学 研 究 技