蛋白质化学一级结构及分析

氨 基 酸 的 多 聚 物 ， 分 子 量 大 小 差 异 极 大 ， 可 以 是 2或3个 到 成 千 上 万 个 氨 基 酸 残 基 连 接 而 成 。 两 个 氨 基 酸 残 基 之 间 通 过 共 价 的 酰 胺 键 （ 肽 键 ） 连接 形 成 一 个 二 肽 ； 三 个 氨 基 酸 残 基 连 接 成 三 肽 ； ；有 限 数 量 的 数 十 个 氨 基 酸 残 基 连 接 成 寡 肽 ； 多 个 氨基 酸 残 基 则 连 接 成 多 肽 ； 蛋 白 质 可 以 是 成 千 上 万 个氨 基 酸 残 基 连 接 而 成 。 多 肽 与 蛋 白 质 有 时 混 用 ， 但 一 般 将 分 子 量 在 10000以下 的 称 为 多 肽 。 肽 或 蛋 白 质 的 水 解 是 耗 能 的 ， 由 于 高 的 活 化 能 ， 水解 很 慢 ， 蛋 白 质 的 肽 键 非 常 稳 定 ， 多 数 胞 内 条 件 下的 半 衰 期 为 7年 。 肽 键 就 是 一 个 氨 基 酸 的 -羧 基 与 另 一个 氨 基 酸 的 -氨 基 脱 水 缩 合 形 成 的 键 缩 合水 解 氨 基 酸 连 接 成 肽 链 后 ， 由 于 氨 基 酸 之 间 通 过 一 个氨 基 酸 的 氨 基 与 另 一 个 氨 基 酸 的 羧 基 缩 合 脱 水 ， 肽 链 上的 一 个 氨 基 酸 单 位 被 称 为 残 基 （ residue） ， 带 有 游 离 -氨 基 的 一 端 被 称 为 氨 基 （ 末 ） 端 （ 或 N端 ） ， 带 有 游 离-羧 基 的 一 端 被 称 为 羧 基 （ 末 ） 端 （ 或 C端 ） 。 H2N-S-G-Y-A-L-COOH 氨 基 酸 形 成 肽 链 后 ， 整 个 肽 链 上 留 下 N端 可 解离 的 氨 基 、 羧 基 端 可 解 离 的 羧 基 、 侧 链 上 能 够解 离 的 R基 团 ， 中 间 氨 基 酸 的 -氨 基 和 -羧 基由 于 形 成 肽 键 而 不 再 对 整 个 肽 链 的 解 离 有 贡 献 。 肽 也 有 特 征 滴 定 曲 线 及 特 征 pI。 R基 团 的 解 离 常 数 由 于 氨 基 酸 的 氨 基 和 羧 基 被用 于 形 成 肽 键 成 为 了 残 基 ， 其 解 离 在 一 定 程 度上 会 发 生 改 变 ， 这 种 变 化 受 到 -氨 基 及 -羧 基失 去 电 荷 、 与 其 他 R基 团 的 作 用 、 其 他 能 够 影响 解 离 常 数 的 环 境 因 子 有 关 。 不 能 对 生 物 活 性 肽 及 蛋 白 质 的 分 子 量与 功 能 之 间 作 出 相 关 性 结 论 。 自 然 存 在 的肽 的 大 小 从 2个 到 数 千 个 氨 基 酸 残 基 ， 甚 至最 小 的 肽 也 能 表 现 出 重 要 的 生 物 学 作 用 ，如 商 业 化 合 成 的 二 肽 L-天 冬 氨 酰 -L-苯 丙 氨酸 甲 酯 人 工 甜 味 剂 -阿 斯 巴 甜 (aspartame)或 纽 特 健 康 糖 （ NutraSweet)， 比 蔗 糖 甜200倍 。 1965年 由 科 学 家 James Schlatter在 研 究 蛋 白 质 时 发 现 ， 经 16年100多 次 的 科 学 研 究 及 验 证 后 ， 阿 斯 巴 甜 于 1981年 (FDA批 准 ）以 Nutrasweet（ 纽 特 健 康 糖 ） 品 牌 正 式 推 出 市 面 。 1986年 我 国卫 生 部 批 准 可 用 于 除 罐 头 以 外 的 所 有 食 品 中 。 COCH2CH 2CHNH2COOH NH CHCH2SH CO NH CH2 COOH gamma-Glu-L-Cys-AlaGSH可 被 氧 化 成 GSSGGSH作 用 ： 在 红 细 胞 中 作 为 巯 基 缓 冲 剂 存 在 ； 维 持 血 红 蛋 白 和 其 它 红 细 胞 蛋 白 质 的 半 胱 氨 酸 残 基处 于 还 原 状 态 。例 如 ， 它 可 防 止 H2O2将 红 细 胞 中 血 色 素 的 二 价 铁 氧 化 成三 价 铁 形 成 高 铁 血 红 蛋 白 。 谷 胱 甘 肽Glutathion(e)（ GSH）(GSSG)H2N-Glu-Cys-Gly-COOH 肌 联 蛋 白 一 些 脊 椎 动 物 的 激 素 是 小 肽 ， 包 括 催 产 素（ oxytocin） （ 9个 氨 基 酸 残 基 ） ， 由 垂 体 后 叶制 造 ， 能 刺 激 子 宫 收 缩 ； 舒 缓 激 肽（ bradykinin） （ 9肽 ） 能 使 呼 吸 道 平 滑 肌 收缩 ， 抑 制 组 织 炎 症 ； 甲 状 腺 激 素 释 放 因 子 （ 3肽 ） ， 下 丘 脑 分 泌 ， 能 刺 激 垂 体 前 叶 促 甲 状 腺素 的 释 放 ， 它 们 发 挥 作 用 的 浓 度 极 低 。 与 许 多 抗 生 素 一 样 ， 一 些 极 毒 的 毒 蘑 菇 毒 素 ，如 鹅 膏 蕈 碱 （ 毒 素 ） (双 环 的 8 肽 毒 素 ） (amanitin)， 对 动 物 有 致 死 作 用 ， 与 真 核 生 物RNA II聚 合 酶 作 用 抑 制 转 录 。 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-脑 啡 肽 Leu-脑 啡 肽CysTyr ILeGlnAsnCys ProLeuGly NH2 SS 牛催产素 CysTyrGln AsnCysPro SSPheArg Gly NH2牛加压素牛 催 产 素 牛 加 压 素 NHCO CH 2 NH CO CH NH CO CH3CHCHOH CH2OHCHHN C NH CH C NH CH2 C C OCHNHHO CH2 NH NHCH CHCH3CH2CH3C OOOO CH2 CH2SO OH 鹅膏覃碱的化学结构鹅 膏 蕈 碱 （ 鹅 膏 毒 素 、 蝇 蕈 素 ） 的 化 学 结 构 一 些 蛋 白 质 只 含 有 一 条 简 单 的 多 肽 链 ， 而 另 一 些 蛋 白质 成 为 多 亚 基 蛋 白 质 ， 含 有 两 条 或 更 多 条 非 共 价 结 合的 多 肽 链 。 多 亚 基 蛋 白 质 的 独 立 的 多 肽 链 可 以 是 同 一多 肽 链 ， 也 可 以 是 不 同 的 多 肽 链 。 有 时 ， 不 同 的 亚 基 形 成 小 的 寡 聚 体 (oligomeric) ， 并以 此 进 一 步 装 配 。 这 种 小 的 寡 聚 体 被 称 为 原 体(protomers)， 原 体 再 装 配 成 更 大 的 聚 集 体 。 如 血 红 蛋白 ， 四 条 非 共 价 结 合 的 多 肽 链 ， 两 条 一 致 的 链 和 两条 相 同 的 链 ， 可 以 称 为 四 条 多 肽 亚 基 的 四 聚 体 或 者原 体 的 二 聚 体 ； 天 冬 氨 酸 氨 甲 酰 磷 酸 转 移 酶 由 6个调 节 亚 基 （ R） 和 6个 催 化 亚 基 （ C） 组 成 ， 装 配 时 先由 1个 C亚 基 和 1个 R亚 基 组 成 一 个 原 体 CR ， 再 由 6个原 体 装 配 成 一 个 有 活 性 的 酶 。 胰 岛 素 的 两 条 多 肽 链 通 过 二 硫 键 共价 连 接 ， 这 种 情 况 下 ， 单 条 多 肽 链 不是 亚 基 ， 通 常 被 简 单 地 认 为 是 肽 链 。因 此 一 条 多 肽 链 及 共 价 连 接 的 多 肽 链不 是 四 级 结 构 。 可 以 从 一 个 不 含 有 其 他 化 学 基 团 的 蛋 白 质 分 子估 算 其 中 的 氨 基 酸 残 基 的 大 概 数 目 ， 用 蛋 白 质的 分 子 量 除 以 110， 即 为 组 成 氨 基 酸 的 数 目 。 20种 氨 基 酸 的 平 均 分 子 量 为 138， 较 小 的 氨 基酸 在 多 数 蛋 白 质 中 的 丰 度 高 ， 如 果 考 虑 不 同 氨基 酸 在 蛋 白 质 中 出 现 的 比 例 ， 平 均 分 子 量 只 有128， 形 成 肽 键 时 失 去 一 分 子 水 （ 18） ， 因 此 ，蛋 白 质 分 子 中 氨 基 酸 残 基 的 平 均 分 子 量 为 128-18=110。 多 肽 具 有 特 征 性 的 氨 基 酸组 成 ， 多 肽 或 蛋 白 质 以 酸水 解 产 生 游 离 -氨 基 酸 的混 合 物 。 当 完 全 水 解 时 ，每 一 种 类 型 的 蛋 白 质 产 生一 种 特 征 性 的 氨 基 酸 比 例或 混 合 物 。 20种 氨 基 酸 几乎 从 不 以 相 同 的 比 例 出 现在 一 个 蛋 白 质 中 ， 有 高 有低 ， 甚 至 有 的 只 出 现 一 次或 根 本 不 出 现 。 很 多 蛋 白 质 ， 如 核 糖 核 苷 酸 酶 、 胰 凝 乳 蛋白 酶 ， 仅 含 有 氨 基 酸 残 基 ， 没 有 其 他 化 学 基 团 -单 纯 蛋 白 质 。 但 有 些 蛋 白 质 ， 除 氨 基 酸 残 基 外 ，还 含 有 永 久 连 接 的 化 学 组 成 ， 被 称 为 复 合 蛋 白 质 ，非 氨 基 酸 连 接 的 化 学 基 团 被 称 为 辅 基 (prosthetic group)。 复 合 蛋 白 质 的 分 类 根 据 辅 基 的 化 学 特 性 ，如 脂 蛋 白 含 有 脂 、 糖 蛋 白 含 有 糖 、 金 属 蛋 白 含 有特 异 的 金 属 。 有 些 蛋 白 质 甚 至 含 有 不 止 一 种 辅 基 ，辅 基 通 常 对 蛋 白 质 的 功 能 起 重 要 作 用 。 铁 蛋 白 酪 蛋 白质 体 蓝 素 肽 末 端 -羧 基 pKa值 比 游 离 AA中 的 大 ，而 肽 末 端 -氨 基 pKa值 比 游 离 AA中 的 小 ，侧 链 R基 的 差 别 不 大 。 等 电 点 （ 两 性 ） 。 酸 碱 性 质 取 决 于 ： -羧 基 、 -氨 基 、 侧 链 基 团 的 解 离 具 有 双 缩 脲 (biuret)反 应 (H2N-CO-NH-CO-NH2) -Pr特 有 的 反 应 （ 与 硫 酸 铜 -氢氧 化 钠 溶 液 产 生 紫 红 色 或 蓝 紫 色 颜 色 反应 ， 可 用 于 肽 和 蛋 白 质 定 量 测 定 ） 。 1952年 丹 麦 人 Linderstrom-Lang最 早 提 出 蛋白 质 的 结 构 可 以 分 成 四 个 层 次 : 一 级 结 构 ： 二 级 结 构 ： 三 级 结 构 ： 四 级 结 构 ： 1969年 正 式 将 一 级 结 构 定 义 为 氨 基 酸 序 列 和 二 硫 键的 位 置 。 介 于 二 级 结 构 和 三 级 结 构 之 间 还 存 在 超 二 级 结 构（ 二 级 结 构 的 组 合 ） 和 结 构 域 （ 在 空 间 上 相 对 独 立 的三 维 结 构 的 实 体 ） 这 两 个 层 次 。 肽 键 将 氨 基 酸 与 氨 基 酸 头 尾 相 连 CO N C N +O -C NCO HC 肽 键 的 特 点 是 氮 原 子 上 的 孤 对 电 子 与 羰 基 具 有 明显 的 共 轭 作 用 。 组 成 肽 键 的 原 子 处 于 同 一 平 面 。 肽 键 中 的 C-N键 具 有 部 分 双 键 性 质 ， 不 能 自 由 旋转 。 在 大 多 数 情 况 下 ， 以 反 式 结 构 存 在 。 肽 键 平 面 两 个 肽 键 平 面 之 间 的 -碳 原子 ， 可 以 作 为 一 个 旋 转 点形 成 二 面 角 (dihedral angle)。二 面 角 的 变 化 ， 决 定 着 多肽 主 键 在 三 维 空 间 的 排 布方 式 ， 是 形 成 不 同 蛋 白 质构 象 的 基 础 。 绕 C-N键 轴 旋 转 的 二 面 角 （ C-N-C-C） 称 为 ， 绕 C-C键 轴 旋 转 的 二面 角 （ N-C-C-N） 称 为 ， 原 则 上 和可 以 取 -180 +180 之 间 的 任 一 值 ，这 样 多 肽 链 主 链 的 各 种 可 能 构 象 都 可用 和 这 两 个 二 面 角 或 扭 角 来 描 述 。 研 究 蛋 白 质 的 ， 就 是 要 将氨 基 酸 的 排 列 顺 序 搞 清 楚 。 二 十 世 纪 四 十 年 代 起 ， 许 多 人 不 遗余 力 地 从 事 蛋 白 质 的 一 级 结 构 研 究 ，第 一 个 将 一 个 蛋 白 质 （） 的 所 有 氨 基 酸 的 排 列 顺 序 通 过高 度 的 实 验 技 巧 加 以 确 定 。 最 小 的 蛋 白 质 ， 由 A链 (21 AA)和 B链 (30 AA)组 成 ； 胰 腺 细 胞 分 泌 的 一 种 激 素 ， 告诉 细 胞 往 里 面 运 输 糖 、 氨 基 酸 、 K+； 1921年 Banting for this discovery he received Nobel Prize in Chemistry in 1958. In 1965, he developed the chain termination method, also known as the Sanger method. He later received another Nobel Prize in Chemistry in 1980 for contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids. In 1992, the Sanger Centre in Cambridge, named after Frederick Sanger, was founded by the Wellcome Trust and the British Medical Research Council, the purpose of which is stated on their website as “to provide a major focus in the UK for mapping and sequencing the human genome, and genomes of other organisms. 两 获 诺 贝 尔 奖（ 仅 4人 ） ，唯 一 两 获 诺 贝尔 化 学 奖 。 Sanger试 剂 (FDNB)标 记 N末 端 ABCDE*ABCDE*A， *AB， *ABC， *ABCD， *ABCDE*A,*A+B, *A+B+C+D+E*A,*A+*B, *A+*B+*C+*D+*E 结 论 ： A B C D E 氨 基 酸 自 动 分 析 仪Edman降 解 法 Sanger法 1958年 设 计 获 1972年 诺 贝 尔 化 学 奖 氨 基 酸 分 析 仪 是 进 行 氨 基 酸 分 离 、衍 生 和 检 测 的 自 动 化 分 析 系 统 ， 广泛 用 于 制 药 、 食 品 、 饲 料 、 农 业 、育 种 、 医 学 研 究 、 临 床 诊 断 和 地 质考 察 等 领 域 。 原 理 ： 阳 离 子 交 换 分 离 、 柱 后 茚 三酮 衍 生 、 可 见 光 光 度 法 测 定 。 1. 样 品 必 需 纯 （ 97%以 上 ） ；2. 测 定 蛋 白 质 的 分 子 量 ；3. 测 定 蛋 白 质 由 几 个 亚 基 组 成 ；4. 测 定 蛋 白 质 的 氨 基 酸 组 成 ； 并 根 据分 子 量 计 算 每 种 氨 基 酸 的 个 数 。5. 测 定 水 解 液 中 的 氨 量 ， 计 算 酰 胺 的含 量 。 (1)、 肽 链 的 拆 开 和 分 离 (2)、 测 定 蛋 白 质 分 子 中 多 肽 链 的 数 目 (3)、 二 硫 键 的 断 裂 (4)、 测 定 每 条 多 肽 链 的 氨 基 酸 组 成 ， 并 计 算 出氨 基 酸 成 分 的 分 子 比 (5)、 N端 、 C端 的 测 定 (6)、 多 肽 链 断 裂 (7)、 测 定 每 个 肽 段 的 氨 基 酸 顺 序 (8)、 确 定 肽 段 在 多 肽 链 中 的 次 序 (9)、 确 定 原 多 肽 链 中 二 硫 键 的 位 置 测 定 每 条多 肽 链 的氨 基 酸 组成 ， 并 计算 出 氨 基酸 成 分 的分 子 比 。 由 多 条 多 肽 链 组 成 的 蛋 白 质 分 子 ， 必 须先 进 行 拆 分 。 几 条 多 肽 链 借 助 非 共 价 键 连 接 在 一 起 ，称 为 寡 聚 蛋 白 质 ， 如 血 红 蛋 白 为 四 聚 体 ，烯 醇 化 酶 为 二 聚 体 。 可 用 8 mol/L尿 素 或6 mol/L盐 酸 胍 处 理 ， 即 可 分 开 多 肽 链 (亚基 )。 通 过 测 定 末 端 氨 基 酸 残 基 的 摩 尔 数与 蛋 白 质 分 子 量 之 间 的 关 系 ， 即 可 确定 多 肽 链 的 数 目 。 常 用 6 mol/L HCl或 4 mol/L H2SO4在 105-110 条 件 下 进 行 水 解 ， 反 应 时 间 约 20小时 。 优 点 是 不 容 易 引 起 水 解 产 物 的 消 旋 化 。缺 点 是 Trp被 沸 酸 完 全 破 坏 ； 含 有 羟 基 的 氨 基 酸 如 Ser或 Thr有 一 小 部分 被 分 解 ； Asn和 Gln侧 链 的 酰 胺 基 被 水解 成 了 羧 基 。 一 般 用 5 mol/L NaOH煮 沸 10-20小 时 。 由 于 水 解 过 程 中 许 多 氨 基 酸 都 受 到 不同 程 度 的 破 坏 ， 产 率 不 高 。 部 分 的 水 解 产 物 发 生 消 旋 化 。 该 法 的 优 点 是 Trp在 水 解 中 不 受 破 坏 。 目 前 用 于 蛋 白 质 肽 链 断 裂 的 蛋 白 水 解 酶（ proteolytic enzyme） 或 称 蛋 白 酶（ proteinase） 已 有 十 多 种 。 应 用 酶 水 解 多 肽 不 会 破 坏 氨 基 酸 ， 也 不 会 发生 消 旋 化 。 水 解 的 产 物 为 较 小 的 肽 段 。 内 切 酶 ： 胰 蛋 白 酶 、 胰 凝 乳 （ 糜 ） 蛋 白 酶 、 胃 蛋 白 酶 、 嗜 热 菌 蛋 白 酶 外 切 酶 ： 羧 肽 酶 和 氨 肽 酶 颌 下 腺 蛋 白 酶胰 蛋 白 酶胰 凝 乳 蛋 白 酶金 黄 色 葡 萄 球菌 V8蛋 白 酶Asp-N-内 切 酶胃 蛋 白 酶 溴 化 氰 NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1 胰 蛋 白 酶 （ trypsin） R1=Lys（ K） 和 Arg（ R）专 一 性 较 强 ， 水 解 速 度 快 R2=Pro（ 抑 制 ）水 解 位 点 NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1胃 蛋 白 酶 （ pepsin） R1和 /或 R2 Phe（ F） 、 Trp（ W） 、Tyr（ Y） 、 Leu（ L） 及 其 它 疏 水 性 AA水 解 速 度 较 快 R1=Pro（ 抑 制 ） pH2 NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1糜 蛋 白 酶 /胰 凝 乳 蛋 白 酶 （ chymotrypsin）水 解 位 点 R1=Phe（ F） 、 Trp（ W）Tyr（ Y） 等 疏 水 性 AA Leu、 Met和 His稍 慢 R2=Pro（ 抑 制 ） pH8-9 NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1嗜 热 菌 蛋 白 酶 （ thermolysin) R2=Phe（ F） 、 Trp（ W） 、 Tyr（ Y） 、Leu（ L） 、 Ile（ I） 、 Met（ M） 、 Val（ V） 及 其 它 疏 水 性 强 的 AA水 解 速 度 较快 。R2= Pro或 Gly， 不 水 解R1或 R3=Pro， 抑 制 水 解水 解 位 点 化 学 法 : （ 1） BrCN-Met的 C端CH3 S：CH2CH2CHNH C NH CH CO OR + Br C + N Br-CH3 S+CH2CH2CHNH C NH CH CO ORC N CH3 S C NCH2CHNH C NH CH CO ORCH2 +H2O +CH2CHNH COCH2 O H3N+ CH COR高丝氨酸内酯 （ 2） NH2OH（ 羟 胺 ） 断 裂 ： 较 专 一 性 断 裂 Asn-Gly之 间 的 肽 键 Asn-Leu及 Asn-Ala键 也 能 部 分 断 裂 多 肽 链 端 基 氨 基 酸 分 为 两 类 ： N-端 氨 基 酸(amino-terminal)和 C-端 氨 基 酸 (carboxyl-terminal) 。 在 肽 链 氨 基 酸 顺 序 分 析 中 ， 最 重 要 的 是 N-端氨 基 酸 分 析 法 。N末 端 ：1、 Sanger法2、 Edman法3、 DNS-Cl4、 酶 降 解 法 C末 端 ：1、 肼 解 法2、 酶 降 解 法3、 硼 氢 化 锂 法 几 条 多 肽 链 通 过 二 硫 键 交 联 在 一 起 ，可 在 8 mol/L尿 素 或 6 mol/L盐 酸 胍 存 在下 ， 用 过 量 的 -巯 基 乙 醇 处 理 ， 使 二硫 键 还 原 为 巯 基 ， 然 后 用 烷 基 化 试 剂保 护 生 成 的 巯 基 ， 以 防 止 它 重 新 被 氧化 。 1、 过 甲 酸 performic acid CH2SO3H 2、 还 原 氧 化 巯 基 乙 醇 ， DTT 碘 乙 酸 等 S-CH2-COOH 3、 亚 硫 酸 分 解 Sulfitolysis R1-S-S-R2 HSO3- R1-S-SO3H + R2-S-SO3H -OOC CHCH2 SHNH3+ CH2OCClOICH2CNH2O -OOC CHCH2 SNH3+ OCCH2OCH2CNH2O-OOC CHCH2 SNH3+ 苯 乙 酰 氯 /碘 乙 酰 胺 可 采 用 两 种 或 多 种 不 同 的 断 裂 方法 (如 酶 解 、 化 学 断 裂 等 ） 将 多 肽 样 品断 裂 成 两 套 或 多 套 肽 段 或 肽 碎 片 ， 并将 其 分 离 开 来 。 1、 蛋 白 质 的 分 离 纯 化、 二 硫 键 的 拆 分 与 保 护3、 (亚 基 分 离 ）4、 多 种 方 法 的 部 分 水 解5、 分 离 水 解 后 得 到 的 多 肽6、 测 序7、 重 叠8、 二 硫 键 位 置 的 确 定 1、 受 空 气 氧 化 而 形 成2、 和 会 发 生 交 换 反 应3、 分 析 氨 基 酸 组 成 时 ， Cys容 易 受 修 饰 而 不 利 于 定 量4、 S-S键 使 蛋 白 酶 难 于 作 用5、 Edman反 应 中 不 能 形 成 稳 定 的 PTH-AA6、 多 条 肽 链 以 S-S键 相 连 ， 拥 有 两 个 以 上 N末 端 ， 无 法 用 Edman法 测 序 DABITC： 有 色 Edman试 剂在 Edman试 剂 上 加 发 色 基 团pH 9CF3COOH/无 水 DABITC: 4-N,N-二 甲 氨 基 偶 氮苯 4 乙 内 酰 硫 脲 瑞 典 人 , 1916.4.14-1977.3.19 1946-47年 在 美 国 留 学 时 想 到 改 进 1930 年 Abderhalden 他 坚 持 不 申 请 专 利 , 给 了 美 国 公 司 得 以 随 便 开 发仪 器 的 方 便 。 1972年 到 德 国 ， 1977年 因 脑 瘤 过 世 。 由 于 Edman降 解 产 物 需 要 在 紫 外 域 进 行 检 测 , 只 有 HPLC和 相应 的 紫 外 检 测 手 段 进 步 后 才 得 到 普 及 ;60年 代 后 期 Moore & Stein利 用 该 反 应 测 定 了 RNase的 一 级 结 构 , 遗 憾 的 是 Edman没 有 和 他 们 分 享 Nobel化 学 奖 . PTH-AA 序 列 ABCDEFGHIJK- 酶 解 AB， CD， EF， GH， IJ， K Edman循 环 后 再 酶 解 BC， DE， FG， HI， JK， - 质 谱 法 + + + 蛋 白 质 吡 啶 / 3H2O /醋 酸 酐 （ 3:1:3,v/v） 蛋 白 质 C末 端 C原 子 会 被 3H置 换室 温 1 2 h 利 用 外 切 蛋 白 水 解 酶 () 将 肽 链 的 氨 基 酸 从 N端 (氨肽 酶 ， )或 C端 (羧 肽酶 ， ) 一 个 接 一 个 游离 出 来 ， 在 不 同 时 间 取 样 进 行 分 析 ，根 据 所 游 离 的 氨 基 酸 的 摩 尔 数 的 多 少来 判 断 氨 基 酸 的 排 列 顺 序 。 C2F5COOH C2F5-COOOC-C2F5 这 两 种 物 质 在 酸 性 条 件 下 低 温 反 应 ， 可 以从 C端 一 个 接 一 个 地 切 除 氨 基 酸 ， 与 质 谱 相 结合 就 可 以 确 定 C端 多 个 氨 基 酸 的 序 列 。 如 果 蛋 白 质 分 子 中 存 在 链 间 或 链 内 二硫 键 ， 在 多 肽 链 的 氨 基 酸 顺 序 分 析 后 ， 需要 对 二 硫 键 的 位 置 加 以 确 定 。 确 定 二 硫 键的 位 置 一 般 采 用 胃 蛋 白 酶 水 解 含 二 硫 键 的蛋 白 质 ， 因 酶 的 专 一 性 较 低 、 切 点 多 、 生成 的 肽 段 包 括 含 有 二 硫 键 的 肽 段 较 小 ， 便于 后 面 的 分 离 及 鉴 定 ； 酶 的 作 用 pH在 酸 性范 围 （ -2） ， 有 利 于 防 止 二 硫 键 发 生 交 换 。 胃 蛋 白 酶 处 理 没 有 断 开 二 硫 键 的 多 肽 链 经 电 泳 分 离 各 肽 段 用 过 甲 酸 断 开 二 硫 键 ， 含 有 -S-S-的 肽 段 带 电 性 质 发生 变 化 ， 转 向 90 二 次 电 泳 ， 曾 含 二 硫 键 的 肽 段 迁移 率 发 生 变 化 然 后 同 其 它 方 法 分 析 的 肽 段 进 行 比 较 ， 确 定 二 硫 键的 位 置 。胃 蛋 白 酶 最 适 pH约 2， 此 时 二 硫 键 不 断 开 专 一 性 低 、 肽 段 短 H2N-CH-COOH CH2 S S CH2 H2N-CH-COOH 6HCOOOH H2N-CH-COOH CH2 SO3H H2N-CH-COOH CH2 SH 2R-SH + + 6HCOOH R-S-S-R 采 用 对 角 线 电 泳 (Brown及 Hartlay， 1966)， 将 水解 肽 段 点 样 在 滤 纸 上 ， pH6.5条 件 进 行 第 一 向 电 泳 ， 肽段 按 大 小 及 电 荷 不 同 被 分 离 。 然 后 将 滤 纸 暴 露 在 过 甲酸 蒸 气 中 ， 使 -S-S-断 裂 ， 含 二 硫 键 的 肽 段 被 氧 化 成 一对 含 半 胱 氨 磺 酸 的 肽 段 。 将 滤 纸 旋 转 90度 ， 在 与 第 一向 完 全 相 同 的 条 件 下 进 行 第 二 向 电 泳 。 结 果 是 大 多 数肽 段 的 迁 移 率 未 变 ， 将 位 于 滤 纸 的 一 条 对 角 上 。 而 含半 胱 氨 磺 酸 对 成 对 肽 段 比 原 来 含 二 硫 键 的 肽 小 并 所 带负 电 荷 增 加 ， 结 果 偏 离 对 角 线 。 肽 斑 用 茚 三 酮 显 色 确定 。 将 每 对 含 半 胱 氨 磺 酸 对 肽 段 分 别 取 下 （ 未 用 茚 三酮 显 色 ） ， 进 行 氨 基 酸 序 列 分 析 ， 再 与 多 肽 的 氨 基 酸顺 序 比 较 ， 可 推 断 二 硫 键 在 链 间 或 链 内 的 位 置 。 对 角 线 电 泳 技 术 a) 混 合 肽 段 点 到 滤纸 。 b) 第 一 向 电 泳 ， 将产 物 分 开 。 c) 用 过 甲 酸 将 二 硫键 打 断 d) 进 行 第 二 向 电 泳 e) 偏 离 对 角 线 的 样品 就 是 含 二 硫 键 的 片 段Diagonal Electrophoresis 断 裂 蛋 白 质 及测 定 肽 段 的 序列 。 首 先 测 定氨 基 酸 组 成 及N端 氨 基 酸 残基 ； 如 有 二 硫键 ， 在 肽 链 断链 前 打 开 二 硫键 ； 胰 蛋 白 酶水 解 及 肽 段 分析 ； 溴 化 氰 水解 及 肽 段 分 析 ；拼 接 整 个 肽 段序 列 。 其 他 方 法 可 以 用 于 蛋 白 质 的 序 列 分 析 ， 质谱 法 可 以 在 几 分 钟 内 测 定 短 肽 （ 20-30 AA） 的 序列 。 DNA的 快 速 测 定 方 法 的 发 展 、 遗 传 密 码 分析 、 基 因 的 分 离 技 术 可 以 从 编 码 基 因 的 核 苷 酸 序列 来 分 析 蛋 白 质 的 多 肽 序 列 。 用 于 分 析 蛋 白 质 和DNA的 技 术 方 法 是 互 补 的 ， 获 得 基 因 后 ， DNA的 序 列 分 析 比 蛋 白 质 序 列 分 析 要 快 且 准 确 ， 现 在多 数 蛋 白 质 的 序 列 都 是 通 过 这 种 方 法 测 定 的 。 如果 基 因 没 有 获 得 ， 蛋 白 质 序 列 的 直 接 分 析 是 必 需的 ， 并 且 能 获 得 DNA序 列 中 没 有 的 信 息 （ 如 二硫 键 的 位 置 ） ， 蛋 白 质 N末 端 的 序 列 能 加 快 相 应基 因 的 分 离 。