1DNA重组技术的基本工具

生物选修生物选修3现代生物科技专题现代生物科技专题1目目 录录专题专题1 基因工程基因工程专题专题2 细胞工程细胞工程专题专题3 胚胎工程胚胎工程专题专题4 生物技术的安全性和伦理问题生物技术的安全性和伦理问题专题专题5 生态工程生态工程专题专题1 基因工程基因工程 是指按照人们的愿望，进行严格的设计，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过并通过体外体外DNA重组和转基因重组和转基因等技术，赋等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。合人们需要的新的生物类型和生物产品。一、基因工程的概念一、基因工程的概念 由于基因工程是在由于基因工程是在DNA分子水平上进行设分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做计和施工的，因此又叫做DNA重组技术重组技术。基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程原理（实质）原理（实质）结结 果果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基基 因因DNADNA分子水平分子水平定向地改造生物的遗传性状，产生定向地改造生物的遗传性状，产生人类需要的基因产物人类需要的基因产物剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达基因重组基因重组二、基础理论和技术的发展催生了基因工程二、基础理论和技术的发展催生了基因工程 20世纪中叶，基础理论取得了重大突破世纪中叶，基础理论取得了重大突破1.DNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立双螺旋结构和中心法则的确立3.遗传密码的破译遗传密码的破译技术发明使基因工程的实施成为可能技术发明使基因工程的实施成为可能1.基因转移载体的发现基因转移载体的发现2.工具酶的发现工具酶的发现3.DNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明4.DNA体外重组的实现体外重组的实现5.重组重组DNA表达实验的成功表达实验的成功6.第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世7.PCR技术的发明技术的发明专题专题1 1 基因工程基因工程1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具12转基因抗虫棉转基因抗虫棉抗虫棉抗虫棉普通棉普通棉基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体DNA拼接拼接导入导入棉花细胞棉花细胞(含含抗虫基因抗虫基因)棉花植株棉花植株(有有抗虫特性抗虫特性)上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来细胞内提取出来关键步骤二：关键步骤二：形成重组形成重组DNA关键步骤三：关键步骤三：重组重组DNA导入受体导入受体(棉花棉花)细胞细胞准确切割准确切割DNA的工具的工具“分子手术刀分子手术刀”DNA片段的连接工具片段的连接工具“分子缝合针分子缝合针”基因转移工具基因转移工具“分子运输车分子运输车”基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具：行基因操作最少需要以下三种工具：DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具思考：思考：在自然界中有一些生物的在自然界中有一些生物的DNA可能进入另一可能进入另一种生物的细胞中。我们有没有学过相关的实种生物的细胞中。我们有没有学过相关的实例？例？现今存在的生物为什么没有在长期的进化过现今存在的生物为什么没有在长期的进化过程中被外源程中被外源DNA的入侵而灭绝，仍能保持一的入侵而灭绝，仍能保持一种稳定状态？种稳定状态？怎样才能使外来的怎样才能使外来的DNA失效从而保护自身？失效从而保护自身？一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶 “分子手术刀分子手术刀”1 1、来源：、来源：主要从原核生物中分离纯化出来主要从原核生物中分离纯化出来 2 2、种类：、种类：约约40004000种种3、作用、作用:限制性核酸内切酶能限制性核酸内切酶能识别双链识别双链DNA分子的某种特分子的某种特定的核苷酸序列定的核苷酸序列，并使每一条链中，并使每一条链中特定部位的两个特定部位的两个核苷酸之间的核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。G A A T T C C T T A A G 中轴线中轴线C T T A A G A A T T C G C C C G G G G G G C C C C C C G G G G G G C C C 黏性末端黏性末端平末端平末端大肠杆菌的一种限制酶（大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)能识别能识别GAATTC序列，序列，Sma识别识别CCCGGG序列序列:限制酶切割限制酶切割DNA后形成的末后形成的末端端黏性末端、平末端是如黏性末端、平末端是如何形成的？何形成的？思考：思考：什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？当限制酶当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切从识别序列的中心轴线两侧切开时，开时，被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切两条单链的切口，带有几个口，带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正，他们之间正好好互补配对互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。什么叫平末端？什么叫平末端？当限制酶当限制酶从识别序列的中心轴线处切开从识别序列的中心轴线处切开时，时，切开的切开的DNA两条单链的切口，是平整两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫的，这样的切口叫平末端平末端。coRI限制酶限制酶SmaI限制酶限制酶识别序列识别序列切割位点切割位点和之间和之间和之间和之间未端类型未端类型平末端平末端黏性末端黏性末端4、切割后的形式：、切割后的形式：2种末端种末端注：注：限制酶是一大类酶，不是一种酶。限制酶是一大类酶，不是一种酶。限制酶大多可以专一性识别双链限制酶大多可以专一性识别双链DNA分子分子上的某种特定核苷酸序列，限制酶所识别上的某种特定核苷酸序列，限制酶所识别的序列，无论是的序列，无论是6个碱基还是个碱基还是4个碱基，都个碱基，都可以找到一条可以找到一条中心轴线中心轴线，中轴线两侧的双，中轴线两侧的双链链DNA上的碱基是反向对称，重复排列的。上的碱基是反向对称，重复排列的。黏性末端黏性末端平末端平末端要想获得某个特定性状的基因必须要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。要切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶用同一种限制酶来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？（被同一种限制酶切断的几个来源不同的（被同一种限制酶切断的几个来源不同的DNA是是否具有相同的黏性末端？）否具有相同的黏性末端？）会产生会产生相同的黏性末端相同的黏性末端，然后让两者的黏性，然后让两者的黏性末端末端黏合黏合起来，就似乎可以合成起来，就似乎可以合成重组的重组的DNA分子分子了。了。思考与探究思考与探究为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的DNADNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其制酶的细胞，其DNA分子中或者分子中或者不具备不具备这这种限制酶的种限制酶的识别切割序列识别切割序列，或者通过甲基，或者通过甲基化酶化酶将甲基转移将甲基转移到所到所识别序列识别序列的碱基上，的碱基上，使使限制酶不能将其切开限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被被切断，并且可以防止外源切断，并且可以防止外源DNA的入侵。的入侵。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术分子手术刀刀”T磷磷酸酸二二酯酯键键1234512345 A磷酸二酯键磷酸二酯键即脱氧核糖、磷酸即脱氧核糖、磷酸之间的连接之间的连接AAT TGGGGCCAAT TCCT TT TCCGGAAAA演示演示重播重播DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”切断的切断的DNA片段要与受体细胞的片段要与受体细胞的DNA连连接，你觉得可以用什么酶？接，你觉得可以用什么酶？DNA聚合酶和聚合酶和DNA连接酶有何相同点和连接酶有何相同点和不同点？不同点？二、二、DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”1、作用：、作用：将双链的将双链的DNA片段连接起来片段连接起来（连接两核苷酸之间的磷酸（连接两核苷酸之间的磷酸二酯键）二酯键）G A A T T C C T T A A G 即脱氧核糖、磷酸基之间的连接即脱氧核糖、磷酸基之间的连接 GP APDNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶和聚合酶和DNA连接酶的异同点连接酶的异同点DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段 的末端上，形成磷酸二酯键；而的末端上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两连接酶是在两 个个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷 酸与酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。片段之间形成磷酸二酯键。DNA聚合酶是以一条聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸链为模板，将单个核苷酸 通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；链；而而DNA连接酶是将连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接双链上的两个缺口同时连接 起来。因此起来。因此DNA连接酶不需要模板。连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。性质各不相同。DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶连接连接DNA链链双双 链链单单 链链连接部位连接部位在两在两DNA片段之片段之间形成磷酸二酯间形成磷酸二酯键键将单个核苷酸加将单个核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片段的片段的3末端的末端的羟基上，形成磷羟基上，形成磷酸二酯键酸二酯键DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶区别区别1 1区别区别2 2相同点相同点寻根问底寻根问底DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗?为什么为什么?1)1)只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已有的核酸片段上，接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键都形成都形成磷酸二酯键磷酸二酯键 本质都是蛋白质本质都是蛋白质1)1)在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键2)2)以以一条一条DNADNA链为模板链为模板，将将将将单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键连接成一条互补连接成一条互补的的DNADNA链链2)2)将将DNADNA双链上的双链上的两两个缺口同时连接个缺口同时连接起来，起来，不需要模板不需要模板 限制酶切割后有两种不同的结果，一限制酶切割后有两种不同的结果，一种产生黏性末端，一种产生平末端。那么种产生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的连接时，所用恢复它们的连接时，所用DNA连接酶是连接酶是否可以不加选择？否可以不加选择？EcoliDNA连接酶：连接酶：连接黏性末端连接黏性末端T4DNA连接酶：连接酶：连接黏性末端和平末端连接黏性末端和平末端2、种类：、种类：Ecoli DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶 Ecoli DNA 连接酶连接酶 只能将双链只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间片段互补的粘性末端之间连接起来，不能将双链连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进片段平末端之间进行连接行连接T4 DNA 连接酶连接酶 既可既可“缝合缝合”双链双链DNA片段互补的黏性末片段互补的黏性末端，又可以端，又可以“缝合缝合”双链双链DNA片段的平末端，片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低但连接平末端之间的效率比较低类型：类型：类型类型EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源功能功能功能功能大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接只能连接只能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端(效率较低效率较低效率较低效率较低)相同点相同点相同点相同点差别差别差别差别（二）（二）“分子缝合针分子缝合针”DNA连接连接酶酶例、例、阅读课本阅读课本P5，图，图14，回答下列问题：，回答下列问题：EcoR I是一种是一种 酶，其识别序列是酶，其识别序列是 ，切割位点是切割位点是 与与 之间的之间的 键。切割键。切割结果产生的结果产生的DNA片段末端形式为片段末端形式为 。不同来源不同来源DNA 片段结合，在这里需要的酶应片段结合，在这里需要的酶应是是 连接酶，此酶的作用是在连接酶，此酶的作用是在 与与 之之间形成间形成 键而起键而起“缝合缝合”作用的。还有作用的。还有一种连接平末端的连接酶是一种连接平末端的连接酶是 。限制限制GAATTCGA磷酸二酯磷酸二酯黏性末端黏性末端DNADNA片段片段磷酸二酯磷酸二酯T4 DNA连接酶连接酶DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”DNADNA分子的切割和连接分子的切割和连接二个不同的二个不同的DNA的黏性末端黏合的黏性末端黏合起来，就似乎可起来，就似乎可以合成重组的以合成重组的DNA分子了。分子了。被同一种限制切被同一种限制切断的几个断的几个DNA具具有相同的黏性末有相同的黏性末端。端。三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体 “分子运输车分子运输车”要让一个从甲生物细胞内取出来的基因要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！能将外源基因因送到乙生物的细胞内去！能将外源基因送入细胞的工具就是载体。送入细胞的工具就是载体。三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”1.使用载体的目的：使用载体的目的：作为运载工具，将目的基因转移到宿主细作为运载工具，将目的基因转移到宿主细 胞中；胞中；利用它在宿主细胞内进行大量的复制。利用它在宿主细胞内进行大量的复制。假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？样？作为载体没有切割位点将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？如果载体对受体细胞有害将怎样？如果载体对受体细胞有害将怎样？不能分离不能分离会怎样？会怎样？思考：思考：假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？样？思考：思考：导入受体细胞的目的基因不能复制，将在细导入受体细胞的目的基因不能复制，将在细胞增殖中丢失。胞增殖中丢失。作为载体没有切割位点将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？载体没有切割位点，外源的目的基因不可能载体没有切割位点，外源的目的基因不可能插入。插入。目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？如果载体上有遗传标记基因，这样，在载如果载体上有遗传标记基因，这样，在载体进入受体细胞后，就可通过标记基因的体进入受体细胞后，就可通过标记基因的表达来检测。表达来检测。如果载体对受体细胞有害将怎样？如果载体对受体细胞有害将怎样？不能分离不能分离会怎样？会怎样？载体对受体细胞有害，将影响受体细胞新陈载体对受体细胞有害，将影响受体细胞新陈代谢，进而使转入的目的基因也无立足之地。代谢，进而使转入的目的基因也无立足之地。载体不能分离，就不能获得更多带有目的基载体不能分离，就不能获得更多带有目的基因的载体。因的载体。2.作用：作用：将外源基因导入受体细胞将外源基因导入受体细胞3.载体的条件：载体的条件：能自我复制能自我复制有一个或多个限制酶的切割位点有一个或多个限制酶的切割位点有遗传标记基因有遗传标记基因对受体细胞无害、易分离对受体细胞无害、易分离载体载体DNA分子大小应适合，以便提取和分子大小应适合，以便提取和 体外操作体外操作4.载体的种类：载体的种类：质粒（最常用）质粒（最常用）噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物某些动植物病毒某些动植物病毒基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”大肠杆菌及质粒载体结构模式图大肠杆菌及质粒载体结构模式图能复制并带着插能复制并带着插入的目的基因一入的目的基因一起复制起复制有切割位点有切割位点有标记基因的存有标记基因的存在，将来可用含在，将来可用含青霉素的培养基青霉素的培养基鉴别。鉴别。目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。须将它从中检测出来。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。模拟操作：重组模拟操作：重组DNA分子的模拟操作分子的模拟操作注意：注意：这两条这两条DNA分子的碱基对不是随意乱分子的碱基对不是随意乱写的。写的。首先，每个首先，每个DNA分子上的两条链上的碱基要分子上的两条链上的碱基要互补配对；互补配对；第二，每个第二，每个DNA分子中每条链都存在一个分子中每条链都存在一个G-A-A-T-T-C的碱基序列，也就是说是的碱基序列，也就是说是EcoRI限限制酶的识别位点，并存在制酶的识别位点，并存在G-A的切割位点。的切割位点。练习：练习：1、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（片段，需使用（）A.同种限制酶同种限制酶 B.两种限制酶两种限制酶 C.同种连接酶同种连接酶 D.两种连接酶两种连接酶A2、不不属属于于质质粒粒被被选选为为基基因因运运载载体体的的理理由由是是（）A.能复制能复制能复制能复制 B.有多个限制酶切点有多个限制酶切点有多个限制酶切点有多个限制酶切点 C.具有标记基因具有标记基因具有标记基因具有标记基因 D.它是环状它是环状它是环状它是环状DNADNAD3、关于限制酶的说法中，正确的是（、关于限制酶的说法中，正确的是（）A限制酶是一种酶，只识别限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱碱 基序列基序列 BEcoRI切割的是切割的是GA之间的氢键之间的氢键 C限制酶一般不切割自身的限制酶一般不切割自身的DNA分子，分子，只切割外源只切割外源DNA D限制酶只存在于原核生物中限制酶只存在于原核生物中C4、下列关于限制酶的说法正确的是（、下列关于限制酶的说法正确的是（）A、限制酶广泛存在于各种生物中，但微生、限制酶广泛存在于各种生物中，但微生 物中很少物中很少B、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸 序列序列C、不同的限制酶切割、不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性后都会形成黏性 末端末端D、限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的、限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的 氢键氢键B5、以下是两种限制酶切割后形成的、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，片段，试分析：试分析：GC AATTC CG G GC CTTAA CG G 其中其中和和 是由一种限制酶切割形成的是由一种限制酶切割形成的 末端，两者要重组成一个末端，两者要重组成一个DNA 分子，分子，所用所用DNA连接酶通常是连接酶通常是 。和和 是由另一种限制酶切割形成的是由另一种限制酶切割形成的 末端，两者要形成重组末端，两者要形成重组DNA片段，片段，所用的连接酶通常是所用的连接酶通常是 。平平T4 DNA连接酶连接酶黏性黏性Ecoli DNA连接酶连接酶6、（多选）、（多选）有关基因工程的叙述中，错误的有关基因工程的叙述中，错误的 是（是（）A基因工程技术能定向地改造生物的遗传基因工程技术能定向地改造生物的遗传 性状，培育生物新品种性状，培育生物新品种 B重组重组DNA的形成在细胞内完成的形成在细胞内完成 C目的基因须由运载体导入受体细胞目的基因须由运载体导入受体细胞 D质粒都可作为运载体质粒都可作为运载体BD7、下列四条、下列四条DNA分子，彼此间具有黏性末分子，彼此间具有黏性末 端的一组是（端的一组是（）A B C DD