无菌体液的采集、送检和接种处理

第一节 血液及骨髓标本的采集、送检和接种处理一、 血液及骨髓标本需氧菌培养（一） 血液标本的采集1. 血液培养的送检指征有哪些？答:（1）症状指征：发热（三38。0、肝脾肿大、关节疼痛、神志不清、昏迷或休克。（ 2）疾病指征：化脓性病灶或损害、黏膜损伤损伤性疾病、肝脏疾病、糖尿病、血液疾病 及恶性肿瘤、艾滋病、呼吸道感染或呼吸衰竭、长期输液或导管介入疾病、血液透析患者。2. 骨髓培养的送检指征有哪些？ 答：骨髓培养和血液培养的送检指征是基本一致的，但由于抽取骨髓不容易被患者接受，且 操作手续较血液繁琐，所以常规血液感染有指征时（如患者发热、血常规检查WBC明显升 高等时）以血液培养为主，但当骨髓炎时或长期使用抗菌药物患者，抽取骨髓培养阳性率会 远高与血液培养。3. 影响血培养阳性分离率的因素有哪些？ 答：与采集样本的时间、部位、标本量、污染、采集样本次数、样本的运送、样本的储存及 患者用药情况、培养基与检验方法的选择等有关，因此应严格把握每种因素的最佳条件以提 高阳性检出率。4. 一般情况下何时采集血培养标本阳性率较高？ 答：患者出现寒战，体温升高之前；使用抗菌药物之前，应立即采集血液作培养（心内膜炎 例外）。如因病情需要不能暂时停止服用抗菌药物的患者，患者无明显的寒战阶段，应在第 二次服药前采血，因为此时血液中抗菌药的浓度低。如患者有明显的发热前期症状，可在患 者寒战前或寒战后1h内采血也可获得高的阳性率，因为在1h内由机体释放的杀细菌的因 子还不会把细菌全部杀灭。5. 不明原因（无明显感染病灶或未找到发热原因）发热的患者应如何采集血标本？ 答：对于不热不明原因，如隐性脓肿、伤寒热和波浪热，先从不同体位采集2-3次（一次静 脉采血注入到多个培养瓶中应视为单份血培养）血标本，间隔大于或等于 1h， 24-36h 后估 计体温升高之前在采集2份以上，若24h培养结果阴性，应重新采集血标本。6. 怀疑布鲁杆菌感染时应如何采集血标本？ 答：在（寒战后或）发热期采集血液或骨髓标本最易获得阳性培养，除发热期才采血外，通 常可在 24h 内采集 3-4 次标本。7. 何时为疑似沙门菌感染患者采集血标本培养的最佳时机？ 答：感染沙门菌患者由于不同病程时期，病原体在患者体内存在的部位不同，排出的途径也 不同，所以应根据病程采集不同标本进行细菌培养才能提高培养的阳性率。发病早期（第1-2 周），由于菌血症的出现，采集血液标本可获得 80%-90%的阳性率，之后由于血清中抗 体出现细菌逐步被清除，血培养的阳性率也将下降，所以患者在病程第1-8周采集静脉血液 标本培养为最佳时机。8. 怀疑急性心内膜炎或亚急性细菌性心内膜炎时应如何采集血液标本？答:怀疑急性心内膜炎时应在抗生素治疗前1-2h内分别从3个不同部位采集3份血标本， 分别进行培养；怀疑亚急性细菌性心内膜炎时，应在抗生素治疗前1-2h （内）分别在3 个不同部位采集血标本进行培养，间隔大于或等于15min,若24h培养阴性，重新采集2-3 份或更多标本送检。9. 怀疑分支杆菌感染时应何时采集血标本？ 答：因为分支杆菌感染初期，容易发生淋巴-血流播散，所以早期采集血液标本，检出阳性 率较高。10. 怀疑螺旋体（如回归热螺旋体）感染时应何时采集血标本？ 答：因为螺旋体侵入人体后，约经一周潜伏期，可大量出现于血液内，患者在持续发热一周 后可消退，血中螺旋体可消失，间歇一至两周后，患者会再次发热，血液中可在次出现螺旋 体，所以选择间歇采样可获得较高的检出率。也可在感染早期（一周内）未用药前采集血标 本。11. 菌血症的临床症状有几种？ 答：菌血症的临床症状可分暂时性（一过性菌血症）、间歇性（多次一过性菌血症）及持续 性菌血症。了解菌血症的临床症状是正确采集血液培养样本的关键。12. 暂时性菌血症（一过性血症）在何种情况下发生？ 答：暂时性菌血症发生在感染组织（脓肿、疖及组织蜂窝炎）外科手术后、拔牙或其他口腔 诊疗操作与手术后、膀胱检查、尿道扩张手术及插尿道导管、吸附流产、直肠镜检查后、支 纤镜检查后、静脉导管介入后或发生于污染部位的外科手术后。13. 间歇性菌血症在何种情况下发生？ 答：间歇性血症常发生于腹腔内化脓以及盆骨、肾周围、肝脏、前列腺等处的脓肿。间歇性 菌血症常造成不明原因的发热。14. 持续性菌血症在何种情况下发生？ 答：持续性菌血症为急性或亚急性细菌性心内膜炎及血管内感染的主要特征。持续性菌血症 易发生于伤寒及布鲁菌症的最初几个星期。15. 为什么要求临床多次采集血培养标本？ 答：（1）血循环中的细菌，有“暂时性”与“持续性”之分。多次采血可提高阳性检出率， 减少漏检（尤其减少暂时性菌血症的漏检）。因为一过性菌血症时，细菌仅在外周血中持续 存在数分钟。多次采血如培养出“共生菌”（如表皮葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、类白 喉杆菌、肠杆菌、丙酸杆菌等），则可确定本次感染的病原菌。血培养如生长多种细菌在排 除污染后，可考虑“复数菌”败血症的诊断。（2）血流感染（blood stream infection）有原发性与继发性之分。许多血流感染来源于肺、 尿路、肝脏、肠道与伤口，血培养阳性有助于循环外感染的诊断。（3）菌血症患者多数为间歇性，病原菌是周期性出现在血液中随之为无菌时期。不管临床 症状经历的严重程度，但患者血液中的病原菌浓度水平相当低，据此要求临床多次采集血液 标本进行培养，可提高阳性检出率，但24h内一般不超过3次，成人每次血量10-20ml，婴 幼儿采集1-2ml，儿童采集3-5ml。16. 如何采集血液培养标本？答：（1）皮肤消毒程序：严格执行以下3步法：70%酒精擦拭静脉穿刺部位待30s以上； 1%-2%碘酊作用30s或10%碘伏作用90s以上，从穿刺点向外画圈消毒，至消毒区域直径3cm 以上；70%酒精脱碘（若用洗必泰作用30s后不必擦去，但不能用于2个月以下的婴儿）； 对碘过敏的患者，用70%酒精消毒60s，待酒精挥发干燥后采血。对酒精过敏的患者可用 1%新洁而灭菌消毒皮肤。（2）培养瓶消毒程序：70%酒精擦拭血培养瓶橡皮塞，作用60s；用无菌纱布或无菌棉签清 除橡皮塞子表面残余酒精。（3）静脉穿刺和培养瓶接种程序：在穿刺前或穿刺期间，为防止静脉滑动，可戴乳胶手套 固定静脉，不可接触穿刺点；用注射器无菌穿刺取血后，直接注入血培养瓶（勿换针头）， 或严格按厂商推荐的方法采血；血培养标本接种到培养瓶后，轻轻颠倒混匀以防血液凝固。 立即送检，切勿冷藏。17. 如何采集骨髓标本？答：在应用抗菌药物治疗前，寒战过后高热时，严格无菌操作，对穿刺一侧部位准备同外科 切口，采集骨髓接种于血培养瓶中，对于少量骨髓可直接接种到培养基。室温运送时间小于 或等于24h，室温储存时间小于或等于24h。18. 血培养标本采集过程中应注意什么？答：严格做好患者抽血部位的无菌操作技术，避免被体表或腔道正常菌群污染；不要和 血气及血沉的取血同时进行（或在先）；穿刺点消毒以醇类，洗必泰为好（不要使用低效 消毒剂），应尽可能抽取患者动、静脉血管中血液，切忌在静滴抗菌药物的静脉处采取血标 本；不宜从静脉导管或静脉留置口取血，若血液标本采集自留置管、中心静脉管内，应在 申请单上注明；若自导管设施取血（不要弃去初段血，不用抗凝剂冲洗），必须同时静脉 取血，以求对比和解释；不推荐静脉血直接入瓶，以免血量控制不好，或对患者不利； 不主张换针头入瓶，以免增加污染的机会。（二）血液标本的接种1. 血液、骨髓标本采集量应该多少比较适宜？答:通常每毫升血量中含菌量很小，血培养的阳性率直接与血样标本容量有关，据Mermel和 Maki报道每增加1ml血样本可使血培养阳性率上升3%，所以采血量要足够。通常采血量与 培养基（肉汤）之比以1:5-1:10 （V/V）为宜，成人一次采学10-20ml平均注入两个血培养瓶 （需氧、厌氧瓶中），婴幼儿采血量为全血量的1%（1-2面临）；骨髓采集量一般为1-2ml。2. 采集血培养标本时为什么婴幼儿只需1-2ml、儿童只需抽3-5ml学，而成人需5-10ml, 是否会影响阳性率？答：当发生菌血症时，通常成人血液中含有的菌量小于1CFU/ml，而在儿童发生菌血症时， 血液中含有的菌量长超过100CFU/ml，所以婴幼儿、儿童采血量少于5ml时，不会影响培养 的阳性率。3. 采集血培养标本的最佳方案是什么？答：成人同时在不同部位采集2-3套（需氧、厌氧瓶各1瓶为一套）血培养标本培养。对 于成年患者的血液培养，只采集一瓶的血培养标本是不允许的，应为一瓶血培养标本的培养 结果很难解释是致病菌还是污染菌；婴幼儿在不同部位采集2套血培养标本培阳；在寒 战后到体温升高之间因采血20ml分别（注入）两个瓶内，先分配在需氧瓶10ml，然后剩余 的入厌氧瓶内（10ml），因为真菌、铜绿假单胞菌、窄食单胞菌只生长在需氧瓶内；当采 血量不能满足推荐的采血量时，应首先接种需氧瓶；在采血后的2-5天内，无需重复采血 培养，应为第一天采集的2-3套血培养标本，若有菌生长，治疗后的2-5天内血液中的感染 细菌不会马上消失，重复抽血会浪费资源。只有可疑为持续性菌血症：如心内膜炎，导管相 关脓毒症（sepsis）时，才要有间隔地（1-24h）几次取血监测、捕捉、指导治疗；特别是金 黄色葡萄球菌菌血症时。4. 血培养标本在接种前应注意什么？答：根据各类血液培养基的用途不同，正确选择合适的培养基，一般推荐每份标本至少使 用需氧和厌氧两瓶培养基，以防漏检；培养瓶如刚从冰箱中取出，必须使其温度平衡到室 温接种；如用自动血培养系统检测时，不能用碘酒消毒瓶盖，只需70%酒精消毒瓶盖； 所用培养瓶必须仔细检查有无变色或混浊，变色和混浊表示培养瓶有污染的可能，应立即与 临床细菌室联系，更换后再做处理；严格房指标本次续混乱，按一人一瓶原则，每做一患 者培养，化验单血培养瓶应有一致的条码号（或编码号）；严禁多个患者同时采样，流水操 作的工作作风，以防张冠李戴导致采样错误；应注意培养瓶的有效期，不用过期培养瓶。（三）血液标本的运送1. 血液标本采集后不能立即送到细菌室怎么办？答:血液标本采集后的血培养瓶如果不能立即送到细菌室，需室温保存或置35-37 孵箱中，切勿冷藏，因为有些苟氧菌如肺炎双球菌，脑膜炎奈瑟球菌、淋球菌等遇冷很容易死亡。2. 用自动化血培养系统，注入血液的血培养瓶不如立即送检，放置条件有什么要求？ 答：一般情况下可把血培养放20-22 ，不放冰箱或35C，培养结果不会受影响。自动化连 续监测系统虽然有允许延迟上机监测微生物生长的原理，还是应该尽量减少延迟上机时间， 因为在炎热的夏天室温可达35C或以上，当标本中细菌浓度大于10时，若以荧光为底物的 检测系统有可能出现假阴性。具体延迟上机时间应根据不同厂家产品要求而定。3. 血培养标本采集后送检过程中应注意什么？答：注入标本后的血培养瓶应立即送至临床细菌室，如因某些原因不能立即送检时，常规 运送时间小于2h,应将已接种样本的培养瓶置于室温保存，常规室温保存时间小于1天， 切勿置于冰箱冷藏；采样后的血培养瓶在送往细菌室的过程中，如天气寒冷应采取一定的 保暖措施;应在化验单上注明准确的采集时间及采血量;如在送检途中培养瓶不慎打破， 应封锁现场，做妥善消毒处理后再离开，并对此事故过程要有交接记录。（四）血液标本的接受于转种1. 细菌是接到血培养瓶后应如何验收？答：检查培养瓶是否有渗漏、破裂或明显污染；检查瓶子上的标签与申请单是否相符； 检查血液标本是否适量，并在申请单上注明采血量；对于延迟送检的血培养瓶注意肉眼 观察微生物生长可视信号：培养瓶内是否有絮状物、浑浊、溶血、凝块、薄膜、产气、白色 颗粒等，如发现可视信号提示有微生物生长，应该立即直接涂片镜检和划线转种。2. 细菌是收到不合格血培养标本应如何处理？ 答：（1）拒收培养瓶：当血培养瓶上未粘贴标签或标签与化验申请单不符或血培养瓶内血液 凝固和培养瓶破裂或明显污染时，细菌室应拒收培养瓶。处理方法：立即与临床医生联系， 报告拒收的具体理由，并在交接时核对。（2）补做培养瓶：血标本采集后放置12h以上（有些全自动血培养仪器有这个要求：既不 能采集标本后不能超过一定的时间，手工法除外），用不适当类型的培养瓶收集标本，比如： 需氧瓶、厌氧瓶、真菌瓶、成人瓶、儿童瓶没有按要求使用，或者用过期的培养瓶收集标本， 采血量不足等。（3）处理方法：立即与临床医师联系，报告标本不合格的具体理由，建议补做血培养。3. 细菌是收到合格血培养标本应如何处理? 答：（1）血培养操作过程中应注意生物安全防护。（2）血培养瓶处理：传统手工法血培养每天早，中，晚观察三次，每次观察后若无菌生 长将培养基混匀，若 48-72h 有微生物生长可视信号，应无菌抽取培养物转种至血平皿，巧 克力平皿及麦康凯平皿（或其他选择性培养皿）置于 CO2 环境培养，并无菌操作抽取培养 物，涂片作革兰染色，发现细菌，尽快报告染色结果；根据染色特征，选择合适的培养基转 种，自动血液分析仪的需氧瓶内应用无菌含棉花通气针插入消毒好的血培养瓶中，以除去 需氧瓶的真空状态（或根据具体厂家的要求而定），以利于需氧菌的生长。厌氧瓶内含有厌 氧气体，切勿通气。4. 血液培养平培养过程中应如何观察和处理？答：传统血培养瓶经12-18h35C孵育后在血琼脂和巧克力琼脂平皿上盲种一次，可提早 检出阳性标本，但也增加了污染的机会；若是双相血液培养瓶，不要误认为瓶内琼脂上出现 菌落提示细菌生长，应当每日观察液体培养基层，若有生长吉祥应马上移种；若培养至第七 天仍无菌生长，需要对需氧瓶进行末次接种;自动血液分析仪若培养5天为呈现阳性结果， 没有必要进行末次接种，直接报告经5天培养无细菌生长，因为对大多数细菌来说，培养物 天已经足够了。对培养时间的限制，可减少污染的发生，特殊情况下需延长培养时间，如布 鲁菌属等。自动血液分析仪若提示有阳性培养瓶产生时，应自仪器上写下阳性瓶，并用无菌 注射器吸出培养液转种至血琼脂和巧克力琼脂平皿，置系统外孵箱35C培养。5. 血液培养瓶培养过程中瓶内培养基有菌生长有哪些特征？答：肉汤培养基均匀混浊，发酵葡萄糖产生气泡；微浑浊有绿色变化;红细胞层上面 出现颗粒状或絮状沉淀物生长，或自下而上的严重溶血；浑浊并有胶冻状凝固，瓶壁有颗 粒粘附；液体表面有菌膜、菌环状生长，下呈浑浊，有些真菌科生长呈球状物。6. 血培养瓶中有菌生长时应如何处理？答：取一滴液体生长物直接涂片湿片镜检，以观察细菌的形态及其存在情况。取瓶中液体 生长物涂片革兰染色，以确定细菌的形态及其类型；将观察结果及时电话通知临床医生，供 其在治疗时参考；湿片在相差显微镜下观察菌体形态和动力更为直观，也可为临床医生提供 跟多的信息；如为加活性炭的培养物，革兰染色时在镜下不易区分阳性菌及真菌，此时用 美蓝单染效果更好，菌体呈蓝色，炭末呈黑色；如涂片革兰染色为单一菌时，取生长物做 直接药敏试验；如涂片革兰染色为细菌时，取生长物移种血平板、巧克力、麦康凯/中国 蓝/伊红美蓝等平板或厌氧平板，进行分离以获得纯培养，进一步做标准药敏试验及菌种鉴 定；如涂片革兰染色为真菌时，取生长物转种两块沙氏平板分别置于30C和 37C两种环 境培养；可疑L型细菌生长时，除转种血平板、巧克力、麦康凯/中国蓝外，需加种一块 高渗平板。7. 血培养瓶的肉汤内似有细菌生长的现象，但转种培养又不生长的原因可能是什么？ 答：培养环境不当，如缺乏二氧化碳、厌氧或微需氧生长条件；缺乏被检菌生长的营养 物质；转种培养时间不够长，有些生长缓慢的细菌容易被漏检；存在抗菌药物；无微 生物存在，若培养瓶长久培养(超过7天)，可能因血液纤维蛋白或培养基粒子引起浑浊。8. 若血培养屏内有细菌生长，但革兰染色未见细菌应如何处理？ 答：革兰染色未找到细菌的血培养瓶，补充吖啶橙染色检查弯曲菌和布鲁菌，发现阳性者进 行分离鉴定，未发现阳性则应转种厌氧和需氧平板，然后继续培养监测至最终报告的时间， 注意其他不常见细菌。9. 是否有必要对怀疑菌血症患者的血液标本直接格兰染色镜检？ 答：因为受方法学的限制革兰染色法不能检测到血液中通常含有的少量微生物(小于 10CFU/ml),所以所以不提倡对血液标本直接进行革兰染色。只要发现有细菌生长时，对阳 性肉汤培养基或固体培养基上的菌落进行革兰染色。二、导管相关性的血流感染的血培养1. 导管相关性血流感染的概念有哪些？答：(1)导管微生物定植(localized catheter colonization)：微生物在导管尖端、皮下段或 者体外端显著生长，半定量培养超过 15CFU。(2) 穿刺点感染(出口部位感染，插管部位感染)(exit site infection)：穿刺点皮肤出现红 斑或者硬结，直径小于2cm，不伴有血流感染和化脓症状。(3) 穿刺点感染(或隧道感染)(clinical exit site infection ， or tunnel infection)：穿刺点和 导管通过的皮下隧道出现触痛，红斑或者硬结直径超过2cm，不伴有血流感染(BIS)。(4) 囊状感染(袋感染)(pocket infection)：完全植入式血管内导管所在的皮下袋感染积脓， 伴有也可以不伴有皮肤破溃流脓、覆盖导管的皮肤坏死，不伴有血流感染。输液相关血流感染(infusion-relate BSI)：血流感染，输液液体中所培养出的致病菌与血培 养(最好经皮穿刺抽血送检)致病菌一致，无其他明确感染源。(6)血管内导管相关血流感染(catheter-relate BIS，CRBSI)：留置血管内导管患者，至少一 份经皮穿刺抽取血液培养为阳性，证实存在菌血症或者霉菌血症，同时伴有感染症状(例如 发热、寒战、低血压等)，除血管内导管外，无其他明确感染灶。 CRBSI 诊断成立还需满足 以下某一条件：导管半定量细菌培养阳性（15CFU/导管片段），或者定量培养阳性（103CFU/ 导管片段），同时从导管培养出的细菌与外周血培养一致（种属和药敏结果）；从中心静脉导 管、外周静脉同时抽血送细菌定量培养，二者细菌浓度比例超过 5:1；同时从中心静脉导管、 外周静脉抽血送细菌培养，中心静脉导管所取血样培养出阳性的时间毕外周血早2 个小时以 上。2. 血管内导管相关感染主要有哪些名称的缩写？答：BSIs （Bloodstream infections）：血流感染； CRBSI （Intravasculsr catheter-re-lated bloodstream infections ）：血管内导管相管血流感染；CVCs（Central venous cathe-ters）： 中心静脉导管；ICU （Intensive care units）：重症监护病房；PICC（Peripherally inserted central venous catheter）：经外周中心静脉导管。3. CRBSI的发生率与哪些因素有关？其发病机理是什么？答：CRBSI的发生几率与导管种类、导管相关医疗操作的频率、患者病情（如基础疾病、疾 病严重程度等）等因素相关。对于短期留置的血管内导管，皮肤定植细菌通过皮下隧道移植 到导管尖端，随后引起感染，为最常见的感染途径。对于长期留置导管，导管头被细菌污染， 导管腔发生细菌定植，引起感染。较少情况下，血行播散的细菌可种植于血管内导管，形成 新的感染灶。致病微生物的附着作用在发病过程中起着重要作用。例如，导管表面常吸附有 纤维蛋白等蛋白质，金黄色葡萄球菌可附着在蛋白上。与大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌相比， 凝固酶阴性葡萄球菌附着在聚合物表面的能力更强。此外，某些凝固酶阴性葡萄球菌分泌细 胞外多糖，成为菌毛，这些细菌附着在导管表面后，菌毛可抵抗白细胞的吞噬作用，消弱机 体免疫功能，可阻止抗菌药物与细菌细胞壁的结核，降低细菌对药物的敏感性，细菌的致病 力增强。在葡萄糖溶液中，某些假丝酵母菌可形成类似军帽的物质，接受静脉高营养治疗的 患者容易发生真菌血流感染，估计与此机制相关。二、血管内导管尖端培养标本的采集、培养及结果解释1. 如何采集血管内导管尖端标本？答：用75%酒精清洁导管周围皮肤；无菌手续移动导管，减区间段末端5cm，直接置入 无菌试管中；立即送至微生物实验室，防止干燥，常规培养不超过15min，4 C保存不 超过 2h2. 血管内导管尖端标本如何培养？答：（1）定量maki培养法：用无菌镊子将5cm导管在血琼脂平板上交叉滚动4次，然后弃 之，在二氧化碳孵箱35C过夜培养后如血琼脂平板上生长15个菌落，提示有潜在导管相关 性感染。（2）定量培养法：从导管中抽吸血液进行定量培养，计算导管细菌生长数量。3. 血管内导管尖端标本培养结果的解释？答：只有当作血液培养的同时，做血管内导管尖端标本培养，确定患者菌血症的来源；或 抽取患者新鲜脓性标本培养，确定软组织相关感染，并做在附近有插入导管的剪短短培养； 同此血液标本培养和导管尖端培养结果是同种细菌，解释该导管是患者菌血症的源头。3. 导管尖培养是否可以用肉汤增菌培养？目前常用的方法有哪些？ 答：既往用肉汤进行导管尖培养，但曾军可扩大污染的几率，致使培养结果不可靠，故不予 推荐。目前常用的培养方法有：（1）半定量法（maki）法：采用滚筒平明技术，阳性标准215CFU/管。当导管拔出是， 先标记插入皮肤的微店，无菌剪短并培养。（2）定量法（mski改良发）：采用震荡、激光技术，阳性标准2100CFU/管。该方法可测 定插管内不同片段的细菌，可比较混合感染不同细菌数。选择以上哪种方法取决于 插管已应用的时间：插管使用1周，管外细菌定植为主，用半定量法；如插管是用1 周，以管内细菌占优势，用定量法。对有抗生素包被的插管，注意假阴性结果。（3） 成对血培养：1 份来源以放置 CVC 插管内静脉血，另一份经皮穿刺外周血。定性分 析：应用于可疑 CR（I 静脉插管相关性感染）的患者，如插管血培养阳性需临床解释， 阴性有利于除外CRI。结果评价可采用差异时间培养：及持续监测室，从CVC插管 比从周围血早 2h 以上或阳性。对于 CVC 难于更换的患者还可采用定量分析，标准 为从CVC的血比周围学习君技术CFU高5-10倍预示CRI，或从通道型CVC的血培养 技术 100CFU/ml 以上。4. 导管相关性菌血症诊断依据是什么？