克隆抗体和抗体工程

第 四 章 单 克 隆 抗 体 和抗 体 工 程 第 四 章 抗 体 制 药第 一 节 概 述第 二 节 单 克 隆 抗 体第 三 节 鼠 源 性 单 克 隆 抗 体 的 改 造第 四 节 基 因 工 程 抗 体 和 抗 体 工 程第 五 节 抗 体 诊 断 试 剂第 六 节 抗 体 治 疗 药 物 第 一 节 概 述一 、 单 克 隆 抗 体u 1890年 ： Behring和 北 里 柴 三 郎 等 发 现 了白 喉 抗 毒 素 ， 并 建 立 了 血 清 疗 法 ， 开 抗 体制 药 之 先 河 。u 1937年 ： Tiselius等 人 用 电 泳 法 将 血 清 蛋白 分 为 白 蛋 白 、 甲 种 （ ） 球 蛋 白 、 乙 种（ ） 球 蛋 白 和 丙 种 （ ） 球 蛋 白 ， 并 证明 抗 体 活 性 主 要 存 在 于 丙 种 球 蛋 白 组 分 。 u 20世 纪 60年 代 初 期 ： 抗 原 决 定 簇 ， 精 制 单价 血 清 。 u1975年 ： Khler和 Milstein等 ， 单 克 隆抗 体 ， 其 具 有 高 度 特 异 性 、 均 一 性 ， 以及 来 源 稳 定 可 大 量 生 产 等 特 点 。u1984年 ： 人 -鼠 嵌 合 抗 体u1984年 至 今 ： 单 克 隆 抗 体 的 鼠 源 性 及分 子 过 大 的 问 题 得 以 解 决 ， 可 仅 作 为 与抗 原 特 异 性 结 合 试 剂 。 单 克 隆 抗 体 的 应 用n用 于 疾 病 的 诊 断 和 治 疗 ：利 用 单 克 隆 抗 体 检 测 与 某 些 疾 病 相 关 的 抗 原 ，辅 助 临 床 诊 断 ，用 放 射 性 核 素 标 记 单 克 隆 抗 体 进 行 肿 瘤 显 像 ，进 行 免 疫 鉴 定 。用 于 临 床 治 疗 -如 针 对 T淋 巴 细 胞 共 有 的 分 化抗 原 CD3的 单 克 隆 抗 体 ， 用 作 免 疫 抑 制 剂 。n单 克 隆 抗 体 还 可 作 为 载 体 药 物 可 对 肿 瘤 进 行 定向 治 疗 。 u免 疫 导 向 疗 法 成 功 障 碍 ：（ 1） 鼠 源 性 单 克 隆 抗 体 的 免 疫 原 性 ；（ 2） 完 整 的 抗 体 分 子 分 子 量 过 大 ， 难 以穿 透 实 体 肿 瘤 组 织 ， 达 不 到 有 效 的 治 疗浓 度 。 基 因 工 程 技 术n制 备 出 改 形 抗 体 、 单 链 抗 体 、 单 域 抗 体 、 最小 识 别 单 位 等 很 多 类 型 的 抗 体 或 抗 体 单 位 。基 本 消 除 了 单 克 隆 抗 体 的 鼠 源 性 ，n相 对 分 子 质 量 只 有 完 整 抗 体 分 子 的 1/801/3，n鼠 源 性 单 克 隆 抗 体 的 生 物 学 活 性 如 激 活 补 体 、促 进 吞 噬 功 能 （ 免 疫 调 理 ） 、 抗 体 依 赖 细 胞介 导 的 细 胞 毒 作 用 等 ， 只 保 留 同 抗 原 特 异 性结 合 的 活 性 。 n 抗 体 （ antibody） ： 由 B细 胞 产 生 的 免 疫 蛋白 ， 它 能 识 别 抗 原 的 某 一 特 定 位 点 。 抗 体 分子 由 两 个 完 全 相 同 的 重 链 分 子 以 及 两 个 完 全相 同 的 轻 链 组 成 。n B细 胞 （ B cell） ： 由 骨 髓 细 胞 分 化 而 来 的 能产 生 抗 体 的 淋 巴 细 胞 。n 单 克 隆 抗 体 :是 将 抗 体 产 生 细 胞 与 骨 髓 瘤 细 胞融 合 ， 通 过 有 限 稀 释 法 及 克 隆 化 使 杂 交 瘤 细胞 成 为 纯 一 的 单 克 隆 细 胞 系 而 生 产 的 。第 二 节 单 克 隆 抗 体 及 其 制 备 一 、 抗 体 的 结 构 与 功 能n Light and heavy Chain，n 可 变 区 （ variable region） ， 简 称 V区 ，n 3个 互 补 决 定 区（ complementaruty-determining region,CDR）n 重 链 分 子 上 有 3个 恒 定 区 constant region, C区（ CH1,CH2和 CH3） ,n 轻 链 上 有 一 个 恒 定 区（ CL） 。 重 链轻 链 n 用 木 瓜 蛋 白 酶 处 理 ， 将 抗 体 分 解 成 3个 部 分 (2个 Fab片 段 和 1个 Fc片 段 )；n Fab： 一 条 完 整 的 轻 链 和 重 链 的 可 变 区 ， 轻 链和 重 链 恒 定 区 。 CL和 CH1之 间 以 二 硫 键 连 接 ；n 保 存 有 抗 原 结 合 活 性 和 特 异 性 。 保 留 VH和 VL即 可 完 全 获 得 原 抗 体 的 抗 原 结 合 活 性 ， Fvn Fc： 两 条 重 链 的 CH2和 CH3区 域 ， 二 硫 键 连接 ， 没 有 抗 原 接 合 活 性 ， 但 是 抗 体 结 合 上 抗原 后 激 活 免 疫 反 应 的 主 要 部 位 。 n 接 受 抗 原 刺 激 后 ， 能 分 泌 针 对 该 抗 原 的特 异 性 抗 体 ， 在 体 液 免 疫 中 具 有 重 要 功 能 。n B淋 巴 细 胞 本 身 是 一 种 终 末 分 化 细 胞 ，通 常 不 再 进 行 细 胞 分 裂 ， 存 活 一 段 时 间 后便 会 死 亡 短 命 细 胞一 、 杂 交 瘤 技 术 产 生 的 3个 技 术 关 键1. B淋 巴 细 胞 与 骨 髓 瘤 细 胞 的 特 性 ：B淋 巴 细 胞 (B lymphocytes)：二 、 杂 交 瘤 细 胞 系 的 生 产 骨 髓 瘤 细 胞 (myeloma cells):n 恶 性 增 殖 的 转 化 细 胞 ， 只 要 营 养 条 件 适合 可 永 远 分 裂 和 存 活 长 命 细 胞 。n 经 筛 选 与 驯 化 ， 现 已 建 立 多 种 骨 髓 瘤 细胞 株 没 有 抗 体 分 泌 物 。 2. 细 胞 融 合 技 术 ：脾 细 胞(B淋 巴 细 胞 ) 骨 髓 瘤 细胞杂 交 瘤 细胞 长 命 不 分 泌 抗 体分 泌 抗 体 短 命 分 泌 抗 体 长 命(Khler和 Milstein, Jerne)1984年 Nobel生 理 学 及 医 学 奖 3.杂 交 瘤 细 胞 的 筛 选脾 细 胞(B淋 巴 细 胞 ) 骨 髓 瘤 细 胞 杂 交 瘤 细 胞 脾 细 胞 /脾 细 胞 骨 髓 瘤 细 胞 /骨 髓 瘤 细 胞 骨 髓 瘤 细 胞脾 细 胞筛 选 出 不 能 长 期 存 活 不 能 长 期 存 活次 黄 嘌 呤 鸟嘌 呤 磷 酸 核 苷转 移 酶 缺 陷 型 HAT培 养 基 筛 选 原 理 (1)n 细 胞 融 合 的 选 择 培 养 基 中 有 三 种 关 键 成 分 ： 氨 甲 蝶 呤 (Aminopterin， A):可 阻 断 正 常 的 DNA合 成 （ 嘌 呤 及 TMP合 成 受 抑 制 ） 次 黄 嘌 呤 (Hypoxanthine， H):是 HGPRT的 底物 ,为 DNA合 成 提 供 原 料 （ 核 苷 酸 旁 路 合 成 原料 ） ； 胸 腺 嘧 啶 核 苷 (Thymidine， T):胸 苷 激 酶 (TK)的 作 用 下 生 成 胸 腺 嘧 啶 核 苷 酸 ， 为 DNA合 成提 供 原 料 。 核 苷 酸 合 成 途 径 -生 物 合 成 途 径 （ D途 径-主 要 途 径 ）n 主 途 径 ： 由 糖 和 氨 基 酸 合 成 核 苷 酸 ， 进 而 合成 DNA， 叶 酸 作 为 重 要 的 辅 酶 参 与 这 一 合 成过 程 。n 叶 酸 作 为 重 要 的 辅 酶 参 与 这 一 过 程 。 n HAT培 养 液 中 氨 基 喋 呤 是 一 种 叶 酸 的 拮 抗 物， 可 以 阻 断 DNA合 成 的 “ D途 径 ” 。 n 辅 助 途 径 ： 是 在 次 黄 嘌 呤 和 胸 腺 嘧 啶 核 苷存 在 的 情 况 下 ， 经 次 黄 嘌 呤 磷 酸 核 糖 转 化酶 （ HGPRT） 和 胸 腺 嘧 啶 核 苷 激 酶 （ TK）的 催 化 作 用 合 成 DNA， 两 种 酶 缺 一 不 可 。核 苷 酸 合 成 途 径 -生 物 合 成 途 径 （ 旁途 径 -S途 径 ） 筛 选 ： HAT培 养 基 筛 选 原 理 内 源 性 途 径 (D-主 要 途 径 谷 氨 酰 胺 or单 磷 酸 尿 苷 酸 外 源 性 途 径 (旁 路 途 径 ) (Hypoxanthine Guznine Phosphoribosyl Transferase) 次 嘌 呤 鸟 嘌 呤 磷 酸 核 糖 转 移 酶 ( HGPRT )胸 腺 嘧 啶 激 酶 (Thymidine kinase, TK)B淋 巴 细 胞 ： HGPRT +， TK+骨 髓 瘤 细 胞 ： HGPRT-， TK- 存 活 死 亡外 源 性 途 径 (S-旁 路 途 径 ) 1、 未 融 合 的 效 应 B细 胞 和 两 个 效 应 B细 胞 融 合nB淋 巴 细 胞 ： HGPRT+， TK+n在 HAT培 养 液 中 ， 未 融 合 的 效 应 B细 胞 和 两个 效 应 B细 胞 融 合 的 “ D途 径 ” 被 氨 基 喋 呤阻 断n虽 “ S途 径 ” 正 常 ， 但 因 缺 乏 在 体 外 培 养 液中 增 殖 的 能 力 ， 一 般 10d左 右 会 死 亡 。 n骨 髓 瘤 细 胞 HGPRT ， TKn在 HAT培 养 液 中 ， 因 此 自 身 没 有 “ S途 径”n“ D途 径 ” 又 被 氨 基 喋 呤 阻 断 ， 所 以 在HAT培 养 液 中 也 不 能 增 殖 而 很 快 死 亡 。2、 骨 髓 瘤 细 胞 以 及 自 身 融 合 细 胞 n骨 髓 瘤 细 胞 HGPRT-， TK-n既 具 有 效 应 B细 胞 的 “ S途 径 ” ， 又 具 有 骨髓 瘤 细 胞 在 体 外 培 养 液 中 长 期 增 殖 的 特 性 。n在 HAT培 养 液 中 ， 选 择 性 存 活 下 来 ， 并 不断 增 殖 。3、 杂 交 瘤 细 胞 浆 细 胞 自发 或 诱 发突 变 脾 B细 胞 用SRBC免 疫 (注射 X蛋 白 )不 能 在 HAT培 养 基 上生 长 的 骨 髓 细 胞 ( 带 有 X蛋 白 的 抗 体 )细 胞 融 合转 到 HAT培 养 基上 非 融 合 细 胞 死 亡杂 交 瘤 细 胞 生 长 在 多 孔 塑 料 板 孔 内 培 养 单 个 细 胞(HAT培 养 液 )培 养 2周杂 交 瘤 细 胞 可 继 续 繁 殖优 良 杂 交 瘤 细 胞检 测 单 克 隆 抗 体接 种 动 物 ,大 量生 产 单 克 隆 抗 体 细 胞 大 量 培 养罐 大 量 生 产 克隆 抗 体冷 冻 保 藏淘 汰 不 合 格 的 细 胞亲 代 死 亡 三 、 筛 选 阳 性 克 隆 与 克 隆 化（ 1） 筛 选 阳 性 克 隆 ：n 产 生 特 定 抗 原 的 抗 体 产 生 细 胞 只 占 所 有 脾细 胞 的 5%左 右 。n 筛 选 技 术 ： 免 疫 酶 技 术 、 免 疫 荧 光 技 术 和放 射 免 疫 技 术 。 n 免 疫 酶 技 术 和 放 射 免 疫 技 术 均 适 用 于 可 溶性 抗 原 及 颗 粒 性 抗 原 的 抗 体 检 测 。n 免 疫 荧 光 技 术 适 用 于 细 胞 抗 原 的 抗 体 检 测。 1、精制破伤风毒素抗原（ ）吸附（约10g/ml，4，3h）洗涤2、加杂交瘤培养上清液（ ）（4，1h）3、加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（ ） （4，1h）洗涤洗涤4、加酶作用底物，呈色孔为阳性克隆孔ELISA用 于 破 伤 风 抗 体 的 筛 选 杂 交 瘤 细 胞 培 养 细 胞 向 培 养基 中 分 泌 抗 体收 集 培 养 基 预 先 包 埋 好 目标 抗 原 的 培 养板抗 原 与 抗 体 的 结 合 E EE E E加 入 二 抗 显 色 说 明 有 抗 体 的存 在在 酶 的 情 况 下 ,与 二 抗结 合 的 分 子 产 生 特 殊 的颜 色(ELISA) （ 2） 克 隆 化 有 限 稀 释 法 和 软 琼 脂 法n筛 选 出 来 的 阳 性 克 隆 中 ， 可 能 含 有 不 分 泌 抗 体的 细 胞 或 有 多 株 分 泌 抗 体 的 细 胞 ， 而 且 刚 刚 融合 获 得 的 杂 交 瘤 细 胞 不 稳 定 ， 染 色 体 容 易 丢 失， 因 此 应 尽 早 克 隆 化 。n杂 交 瘤 细 胞 要 经 过 大 约 3次 的 克 隆 化 ， 才 能 达到 100%孔 内 均 为 抗 体 阳 性 细 胞 克 隆 。n常 用 的 克 隆 化 方 法 有 有 限 稀 释 法 和 软 琼 脂 法 。 n有 限 稀 释 法 ： 是 把 杂 交 瘤 细 胞 悬 液 稀 释 后 ，加 入 到 96孔 细 胞 培 养 板 中 ， 使 每 个 孔 中 在 理论 上 只 含 有 一 个 细 胞 。n第 一 次 克 隆 化 时 也 要 应 用 HT培 养 液 ， 以 后 的克 隆 化 可 用 不 含 HT的 RPMI1640培 养 液 。n单 个 细 胞 难 以 存 活 ， 克 隆 化 时 也 需 加 入 饲 养细 胞 辅 助 其 生 长 。 n 软 琼 脂 法 ： 在 培 养 液 中 加 入 0.5%左 右 的 琼 脂 糖凝 胶 ， 细 胞 分 裂 后 形 成 小 球 样 团 块 。n 培 养 基 是 半 固 体 状 态 ， 可 用 毛 细 吸 管 将 小 球 吸出 ， 团 块 打 碎 后 ， 移 入 96孔 板 中 继 续 培 养 。n 这 种 方 法 可 以 吸 出 大 量 克 隆 细 胞 进 行 培 养 ， 因初 代 细 胞 很 不 易 增 殖 ， 所 以 用 软 琼 脂 法 进 行 克隆 化 容 易 成 功 。 三 、 杂 交 瘤 细 胞 的 鉴 定1） 染 色 体 鉴 定 :正 常 小 鼠 脾 细 胞 的 染 色 体 数 目 为 40,而 小 鼠 骨 髓 瘤 细 胞 的 染 色 体 数 目 的 变 异 较 大 ，可 以 有 62 68 条 染 色 体 。2） 特 性 鉴 定 :对 单 克 隆 抗 体 的 亲 和 力 的 鉴 定 是 最 重要 的 ,一 般 采 用 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 (ELISA)法 。3） 类 别 鉴 定 :可 以 用 相 应 的 抗 血 清 及 双 向 免 疫 扩 散法 进 行 鉴 定 ;4） 单 克 隆 抗 体 的 纯 度 鉴 定 :可 以 用 有 还 原 剂 或 者 无还 原 剂 条 件 下 的 SDS- PAGE 电 泳 进 行 鉴 定 。 四 、 单 克 隆 抗 体 的 大 量 制 备（ 1） 体 外 培 养 法 可 获 得 10g/ml的 抗 体 ；（ 2） 动 物 体 内 诱 生 法 ， 可 获 得 520mg/ml的 抗 体 。-目 前 多 采 用 此 法 生 产 制 备 单 克 隆 抗 体 。优 点 ：n操 作 简 便 、 比 较 经 济 、 所 得 抗 体 量 多 、 所 得 单 克隆 抗 体 量 较 多 且 效 价 亦 高 ，n还 可 有 效 地 保 存 杂 交 瘤 细 胞 株 和 分 离 已 污 染 杂 菌的 杂 交 瘤 细 胞 株 ，缺 点 ：n小 鼠 腹 水 中 混 有 来 自 小 鼠 的 多 种 杂 蛋 白 ， 给 纯 化带 来 难 度 。 n大 量 培 养 方 法 ：n利 用 悬 浮 培 养 方 式 可 增 加 细 胞 生 长 空 间 ， 杂交 瘤 细 胞 生 长 旺 盛 ， 单 克 隆 抗 体 产 量 得 到 提高 。n连 续 悬 浮 培 养 的 细 胞 密 度 可 达 2.0107细 胞/ml， 收 集 的 单 克 隆 抗 体 可 达 到 400g/ml左右 。n微 载 体 悬 浮 培 养 法 ， 增 大 单 位 体 积 的 表 面 积 ，利 于 杂 交 瘤 细 胞 生 长 ， 细 胞 密 度 可 达 108细 胞/ml。 并 能 收 获 更 多 的 单 抗 。 。 五 、 单 克 隆 抗 体 的 纯 化动 物 体 内 诱 生 法 制 备 单 克 隆 抗 体 具 体 方 法 及 过 程1、 澄 清 和 沉 淀 处 理n小 鼠 腹 水 中 含 有 红 细 胞 、 细 胞 碎 块 、 纤 维 蛋 白凝 块 及 脂 质 等 ， 应 首 先 用 离 心 力 1000g离 心5min， 去 除 残 留 的 小 颗 粒 物 质 ；n再 用 0.2m的 微 孔 滤 膜 过 滤 ， 除 掉 污 染 的 细 菌 、支 原 体 和 脂 质 ； 用 饱 和 硫 酸 铵 沉 淀 抗 体 ， 50%饱 和 硫 酸 铵 能 回 收 90%以 上 的 单 克 隆 抗 体 。2、 分 离 主 要 分 离 方 法 有 凝 胶 过 滤 、 阴 离 子 交 换 层 析 、 亲和 层 析 等 。 2、 分 离（ 1） 凝 胶 过 滤（ 2） 阴 离 子 交 换（ 3） 亲 和 层 析 第 三 节 基 因 工 程 抗 体 及 其 制 备(Genetic engineering antibody)基 因 工 程 抗 体 ： 根 据 研 究 者 的 意 图 ， 采 用 基因 工 程 方 法 ， 在 基 因 水 平 ， 对 免 疫 球 蛋 白 基因 进 行 切 割 、 拼 接 或 修 饰 后 导 入 受 体 细 胞 进行 表 达 ， 产 生 新 型 抗 体 。主 要 包 括 ： 嵌 合 抗 体 、 单 链 抗 体 、 人 源 化 抗体 、 双 价 抗 体 和 双 特 异 性 抗 体 。 一 、 单 克 隆 抗 体 靶 向 制 剂纤 溶 酶 原 纤 溶 酶 原 激 活剂 (tPA) 纤 溶 酶血 纤 维 蛋 白 原 血 纤 维蛋 白 降 解产 物 降 解产 物 2、 耦 联 了 tPA的 血 纤 维 蛋 白 的 单 克 隆 抗 体纤 溶 酶 原 纤 溶 酶抗 血 纤 维蛋 白 抗 体血 块 (1)药 物 与 单 抗 直 接 偶 联 n通 过 化 学 反 应 在 药 物 分 子 的 氨 基 和 抗 体 分 子 的羧 基 之 间 形 成 酰 胺 键 ,但 由 于 酰 胺 键 很 稳 定 ,药物 与 抗 体 分 子 结 合 后 无 法 释 放 出 来 ,因 此 其 药用 活 性 几 乎 完 全 无 法 发 挥 出 来 。n用 氧 化 剂 把 药 物 分 子 上 的 糖 基 氧 化 成 羰 基 ,然后 利 用 羰 基 与 抗 体 分 子 的 氨 基 反 应 形 成 西 佛 氏碱 ,最 后 还 原 。 这 样 制 成 的 靶 向 制 剂 可 以 保 留一 定 的 药 物 活 性 ,同 时 体 外 实 验 证 明 ,药 物 显 示出 一 定 的 选 择 性 。 (2)药 物 通 过 小 分 子 与 单 抗 连 接n 通 过 一 些 小 分 子 交 联 剂 ,把 药 物 分 子 上 的 某些 基 团 与 抗 体 分 子 上 的 某 些 基 团 连 接 起 来 。(3)药 物 通 过 大 分 子 与 抗 体 相 连 n 将 较 多 的 药 物 分 子 接 连 在 一 种 大 分 子 聚 合物 上 ,然 后 再 与 单 克 隆 抗 体 交 联 。 二 、 杂 交 人 -鼠 单 克 隆 抗 体n鼠 源 单 克 隆 抗 体 在 临 床 上 的 应 用 前 景 很 广 ,n鼠 源 的 抗 体 有 其 局 限 性 :被 清 除 出 人 的 循 环 系统 ; n鼠 源 抗 体 一 般 无 法 有 效 地 激 发 宿 主 的 免 疫 防 卫系 统 , n在 大 多 数 情 况 下 ,还 会 引 发 人 对 于 鼠 源 抗 体 本身 的 免 疫 反 应 , 人 的 抗 鼠 反 应 (human antimouse resmse), 也 就 是 产 生 人 的 抗 鼠 抗 体 (human antimouse antibody, 简 称 HAMA)。 Chimeric Antibodies Human Fc regions Mouse V regions 三 、 人 源 化 抗 体 (humanized antibody)1. 将 小 鼠 的 CDR序 列 移 植 到 人 抗 体 可 变 区框 架 中 ， 产 生 的 抗 体 称 为 CDR移 植 抗 体 。2.将 小 鼠 Ig基 因 敲 除 ， 转 染 人 Ig基 因 ， 在小 鼠 体 内 产 生 人 Ab， 再 经 杂 交 瘤 技 术 ，产 生 大 量 完 全 人 源 化 抗 体 人 源 单 克 隆 抗 体n 化 学 偶 联 的 单 抗 靶 向 制 剂 产 率 很 低 ;n 偶 联 分 子 其 连 接 位 置 也 是 随 机 的 ;n 药 物 分 子 的 酶 活 性 和 其 他 生 物 活 性 部 分 、甚 至 全 部 丧 失 。 n 嵌 合 抗 体 的 可 变 区 100% 都 是 鼠 源 的 ， 对人 体 仍 然 有 一 定 的 免 疫 原 性 。 传 统 的 杂 交 瘤 技 术 是 很 难 获 得 人 源 单 克 隆抗 体 主 要 原 因 :n 人 一 鼠 淋 巴 细 胞 的 融 合 细 胞 中 人 源 的 染色 体 不 稳 定 ,得 到 的 人 源 单 克 隆 抗 体 极 少 ;n 没 有 能 有 效 代 替 鼠 的 骨 髓 瘤 细 胞 的 人 的骨 髓 瘤 细 胞 ; n 伦 理 上 ,无 法 对 人 进 行 多 种 抗 原 的 免 疫 。 获 得 人 源 抗 体 的 方 法 In 先 分 离 出 正 在 活 跃 产 生 抗 体 的 人 B 细 胞 ,n 通 过 荧 光 标 记 选 择 能 产 生 特 殊 抗 体 的 B cell,n 病 毒 转 化 ,使 之 能 在 培 养 条 件 下 正 常 生 长 。n 其 中 的 一 些 转 化 的 B 细 胞 就 可 以 分 泌 出 能 与特 异 性 抗 原 结 合 的 单 抗 。 n 产 率 很 低 ,抗 体 对 于 抗 原 的 结 合 能 力 也 较 差 。 获 得 人 源 抗 体 的 方 法 IIn 将 人 源 免 疫 干 细 胞 导 人 缺 失 大 部 分 免 疫 细 胞 的小 鼠 体 内 ,n 这 种 小 鼠 遇 到 抗 原 时 ,会 产 生 人 源 的 抗 体 。获 得 人 源 抗 体 的 方 法 III n 将 改 造 过 的 人 的 抗 体 基 因 导 人 鼠 胚 胎 系 中 , 以 得 到 能 在 免 疫 后 产 生 人 的 抗 体 的 转 基 因 鼠 。n 改 造 过 的 抗 体 ， 除 了 构 成 抗 原 结 合 部 位 的 轻 重链 各 3个 CDR区 是 鼠 源 外 ,其 余 均 为 人 源 的 。 Humanized Antibodiesn Cloned human genen Insert sequences from mouse monoclonal antibody for CDR1-3 segments n PCR amplified segments Isolation of CDR Segments n PCR amplification of CDR segments from mouse monoclonal antibody to desired targetn Insert into cDNA clone of human antibodyn Produce human antibody with desired CDRs and antigen specificity 四 、 抗 体 融 合 蛋 白n 一 种 是 将 抗 体 的 可 变 区 域 与 一 非 抗 体 蛋 白 融合 ， 使 融 合 蛋 白 继 承 有 抗 体 分 子 的 结 合 特 异性 。n 另 一 种 是 用 非 免 疫 球 蛋 白 的 序 列 替 换 抗 体 的可 变 区 ， 如 用 CD4、 白 细 胞 介 素 3和 肿 瘤 坏死 因 子 等 。 五 、 抗 体 酶n 抗 体 酶 (abzyme)： 应 用 于 单 克 隆 技 术 生 产的 兼 具 抗 体 及 酶 催 活 性 的 工 程 蛋 白 质 。 也 就是 说 ， 其 行 为 如 同 蛋 白 酶 一 样 ， 能 够 催 化 化学 反 应 的 一 类 新 型 的 抗 体 。 n 抗 体 酶 的 制 备 (自 学 ) Immunotoxins n Protein toxin connected to Fv regionn Single-chain or S-S linked Fv regionn Toxin localized to antigen-expressing cells 六 、 单 链 抗 体 (single chain antibody) n单 链 抗 体 ： 用 基 因 工 程 方 法 ， 将 抗 体 重链 和 轻 链 可 变 区 通 过 一 个 连 接 肽 连 接 而成 的 重 组 蛋 白 。n特 点 ： 能 保 持 与 抗 原 结 合 的 性 能 ， 分 子量 小 ， 穿 透 性 强 ， 体 内 循 环 半 衰 期 短 ，免 疫 原 性 低 。 单 链 抗 体n Fv片 段 抗 体 (single chain Fv fragment,scFv)n 要 获 得 正 确 的 抗 原 结 合 构 象 ,VL衔 接 物 VH;单 链 抗 体 的 应 用 前 景n 体 积 小 ,免 疫 原 性 较 低 ,不 易 引 起 人 体 的 免 疫 排斥 ,渗 透 性 好 ,能 有 效 地 穿 透 致 密 的 肿 瘤 屏 障 ,有 利 于 基 因 治 疗 。 n 构 建 双 功 能 分 子 生 物 导 弹 单 链 抗 体 的 应 用 ：n 用 于 肿 瘤 的 导 向 治 疗n 肿 瘤 的 影 像 分 布n 基 因 治 疗细 胞 内 抗 体 ： 在 细 胞 内 表 达 特 异 性 识 别 某一 基 因 产 物 的 抗 体 ， 可 干 扰 该 基 因 产 物的 生 物 活 性 。n 研 究 基 因 结 构 与 功 能 的 关 系 七 、 嵌 合 抗 体 (chimeric antibody)n嵌 合 抗 体 ： 从 杂 交 瘤 细 胞 分 离 出 功 能 性可 变 区 基 因 ， 与 人 Ig恒 定 区 基 因 连 接 ，插 入 适 当 表 达 载 体 ， 转 染 宿 主 细 胞 ， 表达 人 -鼠 嵌 合 抗 体 。n特 点 ： 减 少 了 鼠 源 性 抗 体 的 免 疫 原 性 ，同 时 保 留 了 亲 本 抗 体 特 异 性 结 合 抗 原 的能 力 。 八 、 双 价 抗 体 与 双 特 异 性 抗 体 (bispecific antibody)许 多 抗 原 抗 体 反 应 要 求 双 价 的 抗 原 结 合 位点 ， 使 抗 原 分 子 上 的 两 个 表 位 交 联 或 使 两个 抗 原 分 子 连 接 。将 识 别 肿 瘤 抗 原 的 抗 体 和 识 别 细 胞 毒 性免 疫 效 应 细 胞 表 面 分 子 的 抗 体 连 结 在 一 起 ，可 使 效 应 细 胞 更 容 易 与 肿 瘤 细 胞 结 合 识 别 ，取 得 杀 伤 肿 瘤 细 胞 的 作 用 。 九 、 单 克 隆 抗 体 的 改 造 和 应 用n单 克 隆 抗 体 与 杀 伤性 药 物 耦 联 破 坏 特定 的 目 标 细 胞 ;n单 克 隆 抗 体 与 药 物前 体 耦 联 在 酶 的 作用 下 ,可 转 化 为 具 杀伤 活 性 的 药 物 ,杀 伤靶 细 胞 转 基 因 的 方 法 在 杂 交 瘤 细 胞 中 生 产 完 全的 人 源 单 克 隆 抗 体n 轻 链 和 重 链 各 由 位 于 两 条 染 色 体 上 的 两 组基 因 分 别 编 码 。n 通 过 重 排 产 生 大 量 的 各 不 相 同 的 轻 链 和 重链 分 子 。 n 再 通 过 轻 链 和 重 链 分 子 之 间 的 排 列 组 合 而形 成 几 乎 无 限 的 多 的 抗 体 分 子 。 1 2 3 4 5 1 2 3 4 593 94 95 28 29 30 1 2 3 4 5 6 VH DH JH CHVH(1/95) DH(1/30) JH(1/6) CH(1/5)基 因 重 排 后得 到 的 重 链 A 74 75 76 1 2 3 4 5VK Jk1 2 3 4 5 CkCkVk(1/76) Jk(1/5) Ck B基 因 重 排 后得 到 的 轻 链 ES细 胞人 重 链 基 因YAC 人 轻 链 基 因YACH 抗 体 基因 敲 除的 小 鼠 抗 体 基因 敲 除的 小 鼠 h H h只 表 达 人 重 链 的纯 合 转 基 因 鼠 只 表 达 人 轻 链 的纯 合 转 基 因 鼠hAb只 表 达 人 源 抗 体 的 纯 合 转 基 因 鼠 第 四 节 基 因 工 程 抗 体 和 抗 体 工 程一 、 噬 菌 体 抗 体 库 技 术 的 基 本 方 法1、 获 得 目 的 基 因2、 抗 体 库 技 术 的 载 体 ： 现 在 普 遍 使 用 噬菌 粒 （ phagemid） 载 体 ， 其 中 的 pHEN1为 新 一 代 载 体 ， 转 化 效 率 高 ， 有 利 于 提高 库 容 量 。 3、 淘 筛 ： 抗 原 固 定 化 后 ， 对 噬 菌 粒 群 的 吸附 、 洗 涤 和 洗 脱 后 再 感 染 扩 增 ， 与 辅 助 噬菌 体 超 感 染 获 得 大 容 量 次 级 文 库 ， 再 反 复与 抗 原 吸 附 ， 经 几 轮 淘 筛 后 ， 淘 汰 了 非 目的 克 隆 ， 且 使 目 的 克 隆 大 量 扩 增 。四 、 表 达 与 鉴 定 ： 目 的 克 隆 经 过 鉴 定 后 ， 再导 入 感 受 态 菌 株 ， 进 行 可 溶 性 表 达 ， 其 产物 用 western blot分 析 确 定 后 ， 就 完 成 了全 过 程 。 二 、 噬 菌 体 抗 体 库 技 术 的 特 点1、 模 拟 天 然 全 套 抗 体 库n 抗 体 文 库 1011库 容 ， 能 包 含 B细 胞 全 部 克隆 。n 建 库 的 外 源 基 因 来 自 人 外 周 血 、 骨 髓 或 脾脏 的 淋 巴 细 胞 提 取 的 mRNA反 转 录 形 成 的cDNA扩 增 ， 使 用 的 通 用 引 物 采 自 多 个 人体 ， 具 有 人 的 种 属 普 遍 性 。 n VH和 VL随 机 重 组 增 加 抗 体 的 多 样 性 。 2、 避 开 了 人 工 免 疫 和 杂 交 瘤 技 术3、 可 获 得 高 亲 和 力 的 人 源 化 抗 体n在 噬 菌 体 抗 体 库 中 ， VH和 VL基 因 的 随 机重 组 模 拟 了 体 内 抗 体 亲 和 力 成 熟 过 程 ， 所用 抗 体 基 因 又 都 是 来 自 人 体 ，n因 此 产 生 的 抗 体 必 然 都 是 高 亲 和 力 的 。 三 、 基 因 工 程 抗 体 的 表 达1、 原 核 细 胞 表 达2、 真 核 细 胞 表 达3、 转 基 因 植 物 表 达4、 转 基 因 动 物 表 达 第 五 节 抗 体 诊 断 试 剂一 、 血 清 学 鉴 定 用 的 抗 体 类 试 剂1、 鉴 定 病 原 菌 的 抗 体 试 剂 ： 诊 断 血 清 制 备步 骤 ：（ 1） 制 备 细 菌 抗 原 ， O（ 菌 体 ） 抗 原 ， H（鞭 毛 ） 抗 原 ；（ 2） 免 疫 动 物 和 制 备 抗 体 血 清2、 乙 型 肝 炎 病 毒 表 面 抗 原 （ HBsAg） 的 反向 被 动 血 凝 诊 断 试 剂3、 妊 娠 诊 断 试 剂4、 抗 ABO血 型 系 统 血 清 二 、 免 疫 标 记 技 术 用 的 抗 体 类 试 剂1、 荧 光 抗 体 诊 断 试 剂n 荧 光 色 素 如 异 硫 氰 酸 荧 光 素 （ FITC） 等 标 记 抗体 球 蛋 白 ， 即 成 为 荧 光 抗 体 。n 用 荧 光 抗 体 浸 染 含 有 抗 原 物 质 的 组 织 切 片 或 细胞 ， 荧 光 抗 体 与 抗 原 集 合 ， 在 荧 光 显 微 镜 下 成为 可 发 光 的 可 视 物 ， 从 而 达 到 诊 断 或 定 位 的 目的 。（ 1） 荧 光 抗 体 的 制 备（ 2） 免 疫 荧 光 测 定 法 有 直 接 和 间 接 两 种 方 法 。 2、 免 疫 酶 抗 体 诊 断 试 剂免 疫 酶 技 术 是 用 酶 标 记 抗 体 来 检 测 抗 原 的 方 法 ，本 法 分 为 免 疫 酶 染 色 （ 组 化 法 ） 和 酶 免 疫 测 定（ EIA） 两 种 类 型 。（ 1） 免 疫 酶 染 色 法 用 抗 体 诊 断 试 剂 ： 常 用 的 酶 为HRP， 其 底 物 为 二 氨 基 联 苯 胺 （ DAB） ， 两 者作 用 可 生 成 棕 褐 色 沉 淀 物 质 ， 使 抗 原 呈 色 。（ 2） 酶 免 疫 测 定 用 抗 体 诊 断 试 剂 ： 见 书 中 介 绍 的几 种 试 剂 ， 重 点 掌 握 酶 免 疫 法 的 基 本 概 念 。 比如 ELISA方 法 （ 夹 心 法 、 间 接 法 ） 。3、 放 射 免 疫 用 抗 体 诊 断 试 剂 13.4 抗 体 的 表 达 系 统n 哺 乳 动 物 细 胞 :具 有 对 蛋 白 进 行 正 确 表 达 的加 工 翻 译 后 修 饰 的 能 力 ,能 抗 体 分 泌 出 来 。但 不 能 表 达 完 整 有 功 能 的 抗 体 。n 细 菌 :抗 体 片 段 ,不 能 完 整 地 表 达 抗 菌 素 体 , 抗 体 分 子 遇 到 不 能 糖 基 化 、 组 装 错 误 以 及不 能 形 成 正 确 的 二 硫 键 ； 容 易 形 成 包 函 体 n 抗 体 片 段 分 子 前 加 上 前 导 序 列 ， 可 以 表 达并 分 泌 到 胞 外 。 13.4.1在 重 组 噬 菌 体 中 筛 选 生 产 抗 体组 合 抗 体 文 库n常 用 的 表 达 系 统 :丝 状 噬 菌 体 ,主 要 包 括 大 肠杆 菌 丝 状 噬 菌 体 、 M13、 fd、 f1。n 结 构 特 性 ： 单 链 环 状 DNA分 子 ; 5 种 外 壳 蛋 白 （、和） ； 蛋 白,位 于 丝 状 噬 菌 体 的 管 状 部 分 ,和,分 别 位 于 两 端 ; 外 源 基 因 与 外 壳 蛋 白 的基 因 连 接 ; 在 丝 状 噬 菌 体 中 表 达 抗 体 的 过 程 丝 状 噬 菌 体 抗 体 文 库 的 构 建 组 合 抗 体 文 库 的 优 点n 省 去 了 单 元 克 隆 抗 体 制 备 过 程 中 许 多费 时 费 力 的 过 程 ， 改 变 了 制 备 单 隆 抗体 的 思 路 ；n 使 单 克 隆 抗 体 的 制 备 由 细 胞 水 平 进 入到 基 因 水 平 ， 为 解 决 人 源 单 抗 体 的 制备 提 供 了 新 的 途 径 ； n 重 、 轻 链 的 随 机 组 合 提 高 了 抗 体 的 多样 性 。 解 决 分 离 抗 体 亲 和 力 较 低 的 抗 体 的 方 法 ：n 噬 菌 体 展 示 技 术 （ phage display） ：将 Fv和 Fab片 段 以 多 拷 贝 抗 体 的 形 式 表达 在 丝 状 噬 菌 体 的 表 面 上 ， 这 就 是 。 使 用 人 源 可 变 区 制 造 完 全 人 的 基 因 编 码 的抗 体 方 法 ：n 基 本 原 理 ： 丝 状 体 的 外 壳 蛋 白基 因 和 外源 抗 体 之 间 引 入 一 个 琥 珀 突 变 密 码 子 UAG。n 当 丝 状 体 感 染 有 琥 珀 突 变 抑 制 的 大 肠 杆 菌株 时 ， UAG密 码 子 被 读 为 Glu， 外 源 蛋 白就 可 以 整 合 蛋 白 的 形 式 附 着 于 噬 菌 体 表 面 ； n 则 UAG被 读 为 终 止 密 码 子 ， 外 源 蛋 白 就 以可 溶 性 蛋 白 的 形 式 被 分 泌 到 细 菌 体 外 。