检验技术离心机

第 三 章 离 心 技 术 及 仪 器centrifugal technique and centrifuge 离 心 技 术 、 电 泳 技 术 、 光 谱 技 术 、 色 谱 技 术 离 心 现 象 是 指 物 体 在 离 心力 场 中 表 现 的 沉 降 运 动 现 象 。应 用 离 心 沉 降 进 行 物 质 的 分 析和 分 离 的 技 术 称 为 离 心 技 术（ centrifugal technique） ,实 现 离 心 技 术 的 仪 器 是 离 心 机（ centrifuge） 。前 言n概 念 : n离 心 技 术 的 应 用 :低 速 离 心 机 主 要 用 于 细 胞 、 细 胞 核 、 细 胞 膜 、 细 菌 的 沉淀 和 收 集 ；高 速 离 心 机 多 用 于 制 备 和 收 集 微 生 物 、 细 胞 碎 片 、 大 的细 胞 器 、 硫 酸 铵 沉 淀 物 以 及 免 疫 沉 淀 物 等 ；超 速 离 心 机 已 成 为 分 离 、 提 纯 、 鉴 定 、 分 析 线 粒 体 、 微粒 体 、 染 色 体 、 溶 酶 体 、 质 粒 、 病 毒 、 大 分 子 核 酸 和 高 分子 蛋 白 质 第一节 离心技术原理第二节 离心机结构第三节 离心方法第四节 高、超速离心技术 教 学 基 本 要 求1.掌 握 离 心 技 术 的 基 础 原 理 ， 常 用 的 离 心 方 法 .2.熟 悉 离 心 机 的 分 类 与 结 构 ， 各 种 离 心 机 的 临 床应 用3.了 解 离 心 机 的 维 护 、 离 心 方 法 的 进 展 一 、 离 心 力 二 、 相 对 离 心 力 三 、 沉 降 系 数 四 、 沉 降 速 度第一节 离心技术原理 重力时 间 当 悬 浮 液 静 置 不 动 时 ，由 于 重 力 场 的 作 用 可 使 得 其中 悬 浮 的 颗 粒 逐 渐 下 沉 ， 下沉 的 速 度 与 微 粒 的 大 小 、 形态 、 密 度 、 重 力 场 的 强 度 及液 体 的 黏 度 有 关 。 如 红 细 胞颗 粒 ， 直 径 为 数 微 米 ， 可 以在 通 常 重 力 作 用 下 观 察 到 它们 的 沉 降 过 程 。 此 外 ， 物 质在 介 质 中 沉 降 时 还 伴 随 有 扩散 现 象 。 l重 力 沉 降 ： 混 合 液 静 置 一 段 时 间 后 扩 散 现 象 扩 散 是 由 于 微 粒 的 热 运 动 而产 生 的 质 量 迁 移 现 象 ,主 要 是 由于 密 度 差 引 起 的 。 对 小 于 几 微 米的 微 粒 如 病 毒 或 蛋 白 质 等 ， 它 们在 溶 液 中 成 胶 体 或 半 胶 体 状 态 ，仅 仅 利 用 重 力 是 不 可 能 观 察 到 沉降 过 程 的 ， 因 为 颗 粒 越 小 ， 与 溶液 密 度 越 相 近 ， 扩 散 现 象 则 越 严重 ， 而 沉 降 越 慢 。 l离 心 沉 降 ： 在 离 心 机 中 ， 离 心 管（ centrifuge tube） 放 于离 心 转 头 里 ， 当 离 心 机 开 动时 ， 离 心 管 绕 离 心 转 头 的 轴旋 转 ， 作 圆 周 运 动 ， 在 离 心管 内 的 样 品 颗 粒 将 同 样 运 动 。 假 如 颗 粒 处 于 真 空 中 ， 颗粒 会 沿 切 线 方 向 飞 去 ,也 就 是 当离 心 管 由 图 中 的 0位 转 到 1位 时 ，颗 粒 到 达 离 心 管 底 部 A位 。 对 于离 心 管 而 言 ， 样 品 颗 粒 由 顶 位 移到 了 A位 ， 也 就 是 由 离 心 管 顶 部移 到 了 底 部 ， 这 与 重 力 场 中 的 由高 处 落 到 低 处 相 似 。 这 种 颗 粒 在圆 周 运 动 时 的 切 线 运 动 称 为 离 心沉 降 . 在 离 心 力 场 中 加 速度 达 到 数 万 甚 至 数 十 万倍 重 力 加 速 度 时 ， 颗 粒的 沉 降 也 加 快 了 同 样 的倍 数 。 这 就 使 得 许 多 在重 力 场 中 不 能 沉 降 的 细小 颗 粒 及 密 度 较 低 的 物体 组 份 能 用 离 心 技 术 进行 分 离 纯 化 。 5ml血 液 离 心 5分 钟 血 浆血 细 胞 l离 心 机 工 作 原 理 : 悬 浮 液 在 高 速 旋 转 下 ，由 于 巨 大 的 离 心 力 作 用 ，使 悬 浮 的 微 小 颗 粒 （ 细 胞器 、 生 物 大 分 子 的 沉 淀 等 ）以 一 定 的 速 度 沉 降 ， 从 而使 溶 液 得 以 分 离 、 浓 缩 和提 纯 ， 颗 粒 的 沉 降 速 度 取决 于 离 心 机 的 转 速 、 物 质的 沉 降 系 数 、 颗 粒 的 质 量 、大 小 和 密 度 。 血 浆试 管离 心 沉 降 物 血 液 一 、 离 心 力 当 物 体 所 受 外 力 小 于 运 动所 需 要 的 向 心 力 时 ， 物 体 将 向远 离 圆 心 的 方 向 运 动 。 物 体 远离 圆 心 运 动 的 现 象 称 为 离 心 现象 。 也 叫 离 心 运 动 。 离 心 运 动是 由 于 向 心 力 消 失 或 不 足 而 造成 的 。 旋 转离 心 力 离 心 作 用 是 根 据 在 一 定 角 速 度 下 作 圆 周 运 动的 任 何 物 体 都 受 到 一 个 向 外 的 离 心 力 进 行 的 。 离心 力 （ Fc） 的 大 小 等 于 离 心 加 速 度 2 r与 颗 粒 质量 m的 乘 积 ， 即 ： 式 中 是 旋 转 角 速 度 ， (rpm)是 每 分 钟 转 头 旋 转 次 数 ， r 为 离心 半 径 (cm)， m是 质 量 。 36004)602( 2222 rmNrNmrm Fc 二 、 相 对 离 心 力 (relative centrifugal force， RCF) =1.118 10-5 (rpm)2 rg为 地 球 重 力 加 速 度 (980 cmsec-2) 通 常 称 离 心 管 顶 部 到 旋转 中 心 的 距 离 为 最 小 离 心半 径 rmin， 该 处 承 受 的 离 心力 场 为 最 小 离 心 力 场 ； 称离 心 管 底 部 到 旋 转 中 心 的距 离 为 最 大 离 心 半 径 rmax，该 处 承 受 的 离 心 力 场 称 为最 大 离 心 力 场 。最 小离 心半 径最 大 离 心 半 径 三 、 沉 降 系 数 微 粒 (分 子 )的 沉 淀 性 质 以 沉 降 系 数 (sedimentation coefficient， S)表 示 ， 其 量 纲 为 秒 (s)。 1924年 Svedberg对 沉 降 系 数 下 的 定 义 为 ：颗 粒 在 单 位 离 心 力 场 中 粒 子 移 动 的 速 度 。积 分 得 :(X 1为 离 心 前 粒 子 离 旋 转 轴 的 距 离 ； X2为 离 心 后 粒 子 离 旋 转 轴 的 距 离 ) 若 用 2 n 60表 示 ， 则 : 定 义 10-13s为 一 个 vedberg单 位 ， 即 10-13s。 四 、 沉 降 速 度 (sedimentation velocity)沉 降 速 度 是 指 在 强 大 离 心 力 作 用 下 ， 单 位 时 间 内 物 质 运 动 的 距 离 式 中 r为 球 形 粒 子 半 径 ； d为 球 形 粒 子 直 径 ； 为 流 体 介 质 的 黏 度 ； p为粒 子 的 密 度 ； m为 介 质 的 密 度 . 将 2-7代 入 2-4可 得 当 p m， 则 SO， 粒 子 顺 着 离 心 方 向 沉 降 ； 当 p = m， 则 S=o， 粒 子 到 达 某 一 位 置 后 达 到 平 衡 ； 当 p m， 则 S0， 粒 子 逆 着 离 心 方 向 上 浮 。 Fc= FB + Ff +FK Fc： 离 心 力FB： 由 离 心 力 场 所 引 起 的 浮 力Ff： 摩 擦 阻 力 FK:扩 散 作 用 力 Fc=F B= Ff =f(dx/dt) （ f为 摩 擦 系 数 ， 单 位 是 g/s) FbFgFBFf沉 降 速 度 的 推 导 方 法 : 代 入 上 式 得 ： dx/dt = 纵向力横 向 力 Fc- fF K 第二节 离心机构造一 、 各 式 离 心 机 的 主 要 结 构 装 置二 、 驱 动 部 分三 、 制 冷 和 温 度 控 制四 、 离 心 机 的 主 要 类 型 l离 心 机 的 主 要 构 件 组 成 :驱 动 电 机制 冷 系 统 (高 速 离 心 机 )真 空 系 统 (超 离 离 心 机 ) 显 示 系 统自 动 保 护 系 统控 制 系 统l必 要 配 件 :离 心 转 头 和 离 心 管 一 、 各 式 离 心 机 的 主 要 结 构 装 置 二 、 驱 动 部 分(一 )转 头 室 转 头 室 的 设 计 要 求 :安 全 、 密 闭 、 隔 热 应 具 有 一 定 的 强 度 ， 外 有 防 护 钢 板 ， 保 证 内 部 破 裂 飞 溅 物 不 能 击 穿飞 出 。 达 到 高 速 旋 转 时 ， 自 动 锁 定 ， 不 能 人 为 地 开 启 。 有 隔 热 保 护 屋 。 有 蒸 发 盘 管 组 成 的 内 室 壁 ， 壁 的 材 质 为 不 锈 钢 的 ， 便 于 清 洁 消 毒 和耐 蚀 。 有 真 空 装 置 的 转 头 室 ， 对 室 盖 、 电 机 轴 与 转 室 交 换 处 设 有 密 封 装 置 ， 保 证 转 头 室 具 有 良 好 的 密 封 性 。 1 转 头 的 型 式(1)角 式 转 头(2)荡 平 式 转 头(3)垂 直 转 头(4)区 带 转 头(5)连 续 流 动 转 头 连 续 流 动 转 头扇 形 小 室叶 片 径 向 导 管区 带 转 头垂 直 转 头 敞 开 式 转 头 角 式 转 头 2 离 心 管 设 计 要 求 :高 强 度 、 耐 热 、 透 明 性 (1)塑 料 离 心 管 聚 乙 烯 (polyethylene， PE) 聚 碳 酸 酯 (po1ycabonate， PC) 聚 丙 烯 (poly-propylene， PP)特 点 :透 明 (或 半 透 明 )， 硬 度 小 ， 能 耐 高 温 消 毒 ， 可 用 穿 刺 法 取 出 梯 度 ,易变 形 ， 抗 强 酸 强 碱 及 某 些 有 机 溶 剂 腐 蚀 性 差 ， 使 用 寿 命 .(2)不 锈 钢 管特 点 :强 度 大 ， 不 变 形 ， 能 抗 热 、 抗 冻 、 抗 化 学 腐 蚀 。 但 价 格 高 (3)玻 璃 试 管特 点 : 耐 热 和 透 明 性 好 ， 强 度 差 3 管 帽 (二 )驱 动 电 机多 为 串 激 式 ,包 括 定 子 和 转 子 两 部 分 (三 )转 速 调 节 系 统1 交 流 变 频 调 速 将 逐 步 取 代 直 流 调 速 2 多 功 能 、 自 动 化 和 微 机 控 制 三 、 制 冷 和 温 度 控 制 制 冷 系 统 高 超 速 离 心 机 和 一 部 分 低 速 大 容 量 制 备 用 离 心 机 配 置2 温 度 控 制 转 头 室 内 的 温 度 由 测 温 元 件 完 成 ,如 蒸 汽 压 力 式 温 度 表 、半 导 体 热 敏 电 阻 和 红 外 线 遥 感 元 件 。 测 温 元 件 感 测 到 的 信号 ， 通 过 放 大 器 放 大 来 控 制 制 冷 系 统 四 、 离 心 机 的 主 要 类 型根 据 用 途 ： 分 析 型 、 制 备 型 、 分 析 制 备 型根 据 操 作 方 式 ： 间 歇 、 连 续 和 半 连 续 根 据 分 离 形 式 ： 沉 降 式 和 过 滤 式 根 据 离 心 机 转 速 ： 分 常 速 (低 速 )、 高 速 和 超 速 根 据 结 构 特 点 ： 管 式 、 吊 篮 式 、 转 鼓 式 和 碟 式 根 据 是 否 冷 冻 ： 高 速 冷 冻 离 心 机 、 大 容 量 冷 冻 离 心 机 制 备 性 离 心 机 : 用 于 分 离 各 种 生 物 材 料 ， 每 次 分 离 的 样 品 容 量 比 较 大 分 析 性 离 心 机 : 一 般 都 带 有 光 学 系 统 ， 主 要 用 于 研 究 纯 的 生 物 大 分 子 和 颗粒 的 理 化 性 质 1. 制 备 性 离 心 机 : 根 据 转 速 常 速 （ 低 速 ） 高 速 超 速 rpm 5000 1000025000 25000 6000 g 89000 g 89000 g 适 用 分 离 对 象 细 胞 微 生 物 菌 体 、 大 细 胞 器 亚 细 胞 器 、 病 毒 和 和 细 胞 碎 片 等 生 物 大 分 子 等 2. 分 析 性 离 心 机 : 都 是 超 速 离 心 机 使 用 了 特 殊 设 计 的 转 头和 光 学 检 测 系 统 ， 以 便 连 续地 监 视 物 质 在 一 个 离 心 场 中的 沉 降 过 程 ， 从 而 确 定 其 物理 性 质 在 分 析 离 心 杯 中 物 质 沉 降 情 况时 ， 在 重 颗 粒 和 轻 颗 粒 之 间 形 成 的界 面 就 像 一 个 折 射 的 透 镜 ， 结 果 在检 测 系 统 的 照 相 底 板 上 产 生 了 一 个“ 峰 ” ， 由 于 沉 降 不 断 进 行 ， 界 面向 前 推 进 ， 因 此 峰 也 移 动 ， 从 峰 移 动 的 速 度 可 以 计 算 出 样 品 颗 粒 的 沉降 速 度 。 第三节离心方法一 、 分 离 离 心 法二 、 分 析 离 心 法三 、 普 通 低 速 离 心 机 使 用 的 注 意 事 项 l离 心 方 法 分 类 ：差 速 离 心 法密 度 梯 度 离 心 方 法 速 率 区 带 离 心 法等 密 度 区 带 离 心 法分 离 离 心 方 法分 析 离 心 方 法 ： 监 测 沉 降 过 程 ， 研 究 生 物 大 分 子 的 沉 降 特 性 和 结 构 一 、 分 离 离 心 法又 称 制 备 离 心 法 ， 包 括 差 速 离 心 法 和 密 度 梯 度 离 心 法 1 差 速 离 心 法 是 以 不 同 离 心 力 来 分 离 不 同 质 （ 沉 降 系 数 ） 的 微 粒 的一 种 动 力 学 方 法 ， 因 不 同 的 粒 子 在 同 一 离 心 条 件 的 离 心 力场 中 沉 降 速 度 不 同 ， 若 不 断 增 加 相 对 离 心 力 ， 一 个 非 均 匀混 合 液 内 的 大 小 、 形 状 不 同 的 粒 子 将 分 步 沉 淀 。 原 理 ： 速 度 逐 渐 提 高 ， 样 品 按 大 小 先 后 沉 淀 用 差 速 离 心 法 分 离 已 破 碎 的 细 胞 各 组 份 特 点 及 应 用 ： 特 点 ： 分 辨 率 不 高 ； 离 心 次 数 多 ， 操 作 繁 杂 ； 产 品 的 纯 度 和 回 收 率 都 达不 到 理 论 值 。 应 用 ： 用 于 组 织 匀 浆 液 中 细 胞 器 和 病 毒 的 分 离 及 其 他 分 离 手 段 之 前 的 粗制 品 提 取 。 如 破 碎 细 胞 各 组 分 (细 胞 核 、 细 胞 膜 碎 片 、 线 粒 体 、 溶 酶 体 、 核 糖体 )的 沉 淀 分 离 。 2 密 度 梯 度 离 心 法 原 理 ： 将 样 品 加 在 惰 性 梯 度 介 质 中 进 行 离 心 沉 降 或 沉 降 平 衡 ，在 一 定 的 离 心 力 下 把 颗 粒 分 配 到 梯 度 中 某 些 特 定 位 置 上 ， 形成 不 同 区 带 的 分 离 方 法 。 分 类 ： 依 据 离 心 分 离 原 理 。 （ 连 续 密 度 梯 度 离 心 法 ） （ 不 连 续 密 度 梯 度 离 心 法 ） (1)速 率 区 带 离 心 法 原 理 ： 在 离 心 前 于 离 心 管 内 先 装 入 密 度 梯 度 介 质 (如 蔗 糖 )，把 待 分 离 的 样 品 铺 在 梯 度 液 的 顶 部 、 离 心 管 底 部 或 梯 度 层中 间 ， 与 梯 度 液 一 起 离 心 。 靠 近 旋 转 轴 处 的 介 质 密 度 最 小 ，离 旋 转 轴 最 远 处 的 介 质 密 度 最 大 ， 但 最 大 介 质 密 度 必 须 小于 样 品 中 粒 子 的 最 小 密 度 。 这 种 方 法 是 根 据 分 离 的 粒 子 在 梯 度 液 中 沉 降 速 度 的 不同 ， 使 具 有 不 同 沉 降 速 度 的 粒 子 处 于 不 同 的 密 度 梯 度 层 内分 成 一 系 列 区 带 ， 达 到 彼 此 分 离 的 目 的 。 梯 度 液 （ 聚 蔗 糖 (ficoll)、 硅 溶 胶 (pereoll)及 蔗 糖 (sucrose)）在 离 心 过 程 中 以 及 离 心 完 毕 后 ， 取 样 时 起 着 支 持 介 质 和 稳 定 剂的 作 用 ， 避 免 因 机 械 振 动 而 引 起 已 分 层 的 粒 子 再 混 合 。 特 点 及 应 用 ： 特 点 ： 分 辨 力 高 ， 但 离 心 时 间 要 严 格 控 制 。 应 用 ： 速 率 区 带 离 心 法 是 一 种 动 力 学 方 法 ， 适 用 于 测 定 生 物大 分 子 颗 粒 的 沉 降 系 数 。 速 率 区 带 离 心 是 一 种 不 完 全 的 沉 降 ， 沉 降 受 物 质 本 身 大小 的 影 响 较 大 ， 一 般 应 用 于 物 质 大 小 相 异 而 密 度 相 同 的 情况 。 (2)等 密 度 区 带 离 心 法 原 理 ： 根 据 样 品 组 分 的 密 度 差 别 进 行 分 离 纯 化 ， 一 般 是将 待 分 离 的 样 品 铺 在 梯 度 液 顶 上 或 和 梯 度 液 先 混 合 ，密 度 梯 度 液 柱 的 密 度 范 围 很 大 ， 液 柱 底 部 的 密 度 明 显大 于 样 品 组 分 的 密 度 。 如 果 样 品 中 有 几 个 密 度 不 相 同的 组 分 ， 它 们 将 分 别 集 中 于 密 度 梯 度 液 柱 中 相 应 的 密度 位 置 上 ， 形 成 几 个 分 离 的 区 带 ， 收 集 各 个 区 带 即 得到 各 个 提 纯 的 组 分 。 分 辨 力 高 ， 耗 时 。 是 一 种 测 定 生 物 大 分 子 或 颗 粒 的 浮 力 密 度 的 静 力 学 方法 。 此 法 一 般 应 用 于 物 质 的 大 小 相 近 ， 而 密 度 差 异 较 大 时 ，如 分 离 核 酸 、 亚 细 胞 器 等 ， 也 可 以 分 离 复 合 蛋 白 质 ， 简 单蛋 白 质 不 适 用 。梯 度 介 质 通 常 为 氯 化 铯 (CsCl) 特 点 及 应 用 ： 二 、 分 析 离 心 法目 的 : 为 了 研 究 生 物 大 分 子的 沉 降 特 性 和 结 构 ， 而 不是 专 门 收 集 某 一 特 定 组 分 。 方 法 : 使 用 特 殊 的 转 子 和 检测 手 段 ， 连 续 监 视 物 质 在一 个 离 心 场 中 的 沉 降 过 程 沉 降 速 度 法 沉 降 平 衡 法 等 密 度 区 带 分 析 离 心 法 特 点 :在 短 时 间 内 ， 用 少 量 样 品 就 可 以 得 到 一 些 重 要 信 息 确 定 生 物 大 分 子 是 否 存 在 、 其 大 致 的 含 量计 算 生 物 大 分 子 的 沉 降 系 数结 合 界 面 扩 散 ， 估 计 分 子 的 大 小 ， 检 测 分 子 的 不 均 一性 及 混 合 物 中 各 组 分 的 比 例测 定 生 物 大 分 子 的 相 对 分 子 质 量检 测 生 物 大 分 子 的 构 象 变 化 三 、 普 通 低 速 离 心 机 使 用 的 注 意 事 项稳 定平 衡限 速清 洁 第四节高、超速离心技术一 、 高 、 超 速 离 心 机 的 组 成 及 特 点二 、 高 、 超 速 离 心 机 的 机 型 介 绍 和 应 用三 、 超 速 离 心 在 医 学 中 的 应 用 四 、 高 、 超 速 离 心 机 操 作 的 注 意 事 项 一 、 高 、 超 速 离 心 机 的 组 成 及 特 点1 高 、 超 速 离 心 机 的 驱 动 装 置 2 高 、 超 速 离 心 机 的 温 度 控 制 3 超 速 离 心 机 的 真 空 系 统 4 高 、 超 速 离 心 机 的 转 头 5 高 、 超 速 离 心 机 离 心 管 的 选 用 速 度 控 制 系 统 过 速 保 护 系 统 装 甲 钢 板 密 闭红 外 线 射 量 感 受 器 解 决 温 度 和 摩 擦 力 的 影 响 角 转 头 和 水 平 转 头 选 用 塑 料 试 管 二 、 高 、 超 速 离 心 机 的 机 型 介 绍 和 应 用三 、 超 速 离 心 在 医 学 中 的 应 用 某 些 品 牌 型 号 的 离 心 机 的 独 特 性 能 和 特 点(一 )分 离 超 速 离 心 技 术 的 应 用(二 )分 析 性 超 速 离 心 技 术 的 应 用 提 取 和 纯 化 病 毒 颗 粒 ， 分 离 和 纯 化 RNA、 DNA、 质 粒 和蛋 白 质 等 生 物 大 分 子 测 定 生 物 大 分 子 的 相 对 分 子 质 量 纯 度 构 象 变 化 四 、 高 、 超 速 离 心 机 操 作 的 注 意 事 项1 离 心 管 平 衡 允 许 的 误 差 要 小 于 0.1g。2 超 速 离 心 时 ， 液 体 一 定 要 加 满 离 心 管 。3 使 用 角 度 头 时 别 忘 盖 转 头 盖 。