分子生物学第五章分子生物学的常规技术

第 五 章 分 子 生 物 学 的 常 规 技 术 （ 六 ） 基 因 文 库 （ Gene library） ： 由 大 量 的 含 有 基 因 组 DNA（ 即 某 一 生 物 的 全 部 DNA序 列 ）的 不 同 DNA片 段 的 克 隆 所 构 成 的 群 体 ， 称 之 为 基 因 文 库 。 一 个 完 全 的 基 因 文 库 ， 应 该 能 够 保 证 从 中 筛 选 到 目 的基 因 。 即 Genomic library 提 取 研 究 对 象 基 因 组 DNA， 制 备 合 适 大 小 的 DNA片 段 ，或 提 取 组 织 或 器 官 的 mRNA并 反 转 录 成 cDNA；n DNA片 段 或 cDNA与 经 特 殊 处 理 的 载 体 连 接 形 成 重 组 DNA；n 重 组 DNA转 化 宿 主 细 胞 或 体 外 包 装 后 侵 染 受 体 菌 ；n 阳 性 重 组 菌 落 或 噬 菌 斑 的 选 择 cDNA文 库 代 表 生 物 的 某 一 特 定 器 官 或 特 定 发 育时 期 细 胞 内 转 录 水 平 上 的 基 因 群 体 。n 由 于 基 因 表 达 具 有 组 织 和 发 育 时 期 特 异 性 ， 因此 cDNA文 库 所 代 表 的 基 因 组 具 有 同 样 的 时 空 特 性 ，它 仅 包 含 所 选 材 料 在 特 定 时 期 里 表 达 的 基 因 ， 并 不包 括 该 生 物 的 全 部 基 因 ， 且 这 些 基 因 在 表 达 丰 度 上存 在 很 大 差 异 。 基 因 组 文 库 与 cDNA文 库 最 大 的 区 别 ：n cDNA文 库 有 时 空 特 异 性 。 必 须 根 据 所 研 究 基 因 的 各 种 信 息 ， 如 表达 丰 度 、 蛋 白 质 特 性 和 DNA序 列 等 ， 以 及 基因 文 库 的 特 点 和 类 型 选 择 适 当 的 筛 选 方 法 。 一 、 载 体 的 选 择第 一 节 基 因 组 DNA文 库 的 构 建可 装 载 的 外 源 DNA Plasmid 10kb Phage 0-23kb Cosmid 45kb BAC 100kb YAC 300kb-1.2Mb Pl噬 菌 体 载 体 P1人 工 染 色 体 载 体 (PAC)。 粘 粒 克 隆 所 需 的 克 隆 子 数 是 phage的 一 半 ， 如需 700000时 ， cosmid需 350000个 因 cosmid在 构 建 文 库 和 贮 存 文 库 比 phage困难 得 多 ， 如 无 特 殊 需 要 (如 单 个 phage不 能 包 容 靶基 因 片 段 或 要 分 离 一 系 列 跨 过 染 色 体 DNA特 大 区 段的 重 叠 克 隆 时 )一 般 不 采 用 cosmid。 YAC可 用 于 克 隆 500kb以 上 ， 甚 至 几 Mb的DNA片 段 BAC 可 减 少 DNA分 子 间 的 重 组 二 、 基 因 组 DNA文 库 的 类 型 噬 菌 体 文 库 是 以 细 菌 噬 菌 体 基 因 组 衍 生 的 一 系 列 载 体 系统 构 建 的 ；n 常 用 的 有 噬 菌 体 载 体 ， M13单 链 噬 菌 体 载 体 ， P1噬 菌体 载 体 及 由 噬 菌 体 衍 生 的 质 粒 载 体 (phagemid或 phasmid)。n M13载 体 所 容 纳 的 外 源 片 段 较 小 ， 一 般 用 于 构 建 cDNA文库 或 BAC和 PAC亚 克 隆 文 库 。n 噬 菌 体 文 库 中 应 用 最 广 的 是 噬 菌 体 。 由 于 其 有 利 于利 用 分 子 杂 交 的 方 法 进 行 筛 选 ， 用 噬 菌 体 构 建 的 基 因 组DNA文 库 在 小 基 因 组 物 种 的 基 因 克 隆 中 起 着 重 要 的 作 用 phage vectors早 期 （ 70年 代 后 期 ） 使 用 ， 如 Charon 4A 和 gt-WES， 克 隆 15 20kb目 前 用 EMBL系 列 , 2001， DASH， Charon 38-40，GEM-11 等 置 换 型 载 体 ， 插 入 片 段 的 最 大 值 可 达20-24kb n 提 高 文 库 的 代 表 性 的 策 略 ：n 一 是 采 用 部 分 酶 切 或 随 机 切 割 的 方 法 来 打 断 染 色 体DNA， 以 保 证 克 隆 的 随 机 性 ， 保 证 每 段 基 因 组 DNA在 文 库 中出 现 频 率 均 等 ；n 二 是 增 加 文 库 的 总 容 量 ， 提 高 覆 盖 基 因 组 的 倍 数 。 n 文 库 总 容 量 由 外 源 片 段 的 平 均 长 度 和 重 组 克 隆 的 数 量共 同 决 定 ， 外 源 片 段 的 长 度 受 所 选 用 的 载 体 体 系 限 制 从经 济 的 角 度 考 虑 ， 重 组 克 隆 的 数 量 并 不 是 越 多 越 好 ， 因 此选 用 一 个 合 适 的 重 组 克 隆 数 量 是 很 有 必 要 的 。 1976年 Clark and Carbon提 出 了 一 个 完 全 的 基 因文 库 所 需 克 隆 的 计 算 公 式 n=ln(1-p)/ln(1-f) n: 一 个 完 全 基 因 文 库 所 应 包 含 的 重 组 体 克 隆 数 p: 所 期 望 的 目 的 基 因 在 基 因 文 库 中 出 现 的 几 率 f: 插 入 片 段 的 平 均 大 小 与 基 因 组 DNA大 小 的 比 值 哺 乳 动 物 3 109kb若 p=99% 平 均 克 隆 片 段 20kb f=20kb/3 109 n=690773.2E.coli 4639221bp p=99% f=20kb/4600kb n=1056.9 p=99% f=10kb/4600kb n=2116 四 、 基 因 组 DNA文 库 的 构 建 流 程 2.高 质 量 大 相 对 分 子 质 量 基 因 组 DNA的 提 取 和 部分 酶 切n 构 建 不 同 大 小 插 入 片 段 的 基 因 组 文 库 对 DNA相 对 分 子质 量 要 求 不 同 ， 一 般 所 提 取 的 DNA相 对 分 子 质 量 至 少 应 该是 文 库 最 终 平 均 插 入 片 段 长 度 的 3 5倍 。n 提 取 的 基 因 组 DNA相 对 分 子 质 量 越 大 ， 所 得 到 的 重 组克 隆 的 插 入 片 段 越 大 。 n 真 核 生 物 基 因 组 DNA提 取 方 法 有 ：n 液 相 法n 固 相 法 。 n提 高 连 接 效 率 是 关 键 ：在 构 建 大 片 段 基 因 组 DNA文 库 时 ， 大 量 连 接 前 都 要 先 使用 小 体 系 连 接 来 寻 找 最 适 的 比 例 。n 在 转 化 和 包 装 侵 染 过 程 中 ， 最 好 选 择 转 化 效 率 高 的 感受 态 细 胞 和 最 佳 的 转 化 条 件 或 效 价 高 且 质 量 稳 定 的 包 装 蛋白 。 4 文 库 的 质 量 检 测n 文 库 质 量 是 由 文 库 所 含 克 隆 的 数 目 、 平 均 插 入 片 段 的长 度 、 插 入 效 率 、 基 因 组 覆 盖 度 和 覆 盖 倍 数 等 因 素 决 定 的 。n 克 隆 数 越 多 ， 平 均 插 入 片 段 越 长 ， 插 入 效 率 和 基 因 组覆 盖 度 越 高 ， 文 库 质 量 就 越 好 。n 在 实 际 应 用 中 ， 克 隆 数 目 可 以 通 过 多 次 转 化 累 加 。n 但 并 不 是 越 多 越 好 ， 只 要 达 到 一 定 的 基 因 组 覆 盖 倍 数和 覆 盖 度 就 行 ， 一 般 要 求 达 到 4 6倍 覆 盖 率 在 文 库 的 质 量 检 测 中 ， 除 了 克 隆 子 数 目 是 可 以 确 定 的 ，其 他 值 都 是 估 算 的 n 文 库 的 平 均 插 入 片 段 长 度 是 通 过 PFGE电 泳 检 测 一 定 数 目的 重 组 子 的 插 入 片 段 大 小 所 得 平 均 值 。n 对 于 大 片 段 文 库 而 言 ， 平 均 插 入 片 段 大 小 是 衡 量 文 库 质量 的 一 个 重 要 依 据 。n 对 BAC文 库 ， 一 般 要 求 植 物 的 片 段 在 130kb左 右 ， 而 动 物的 片 段 在 150kb左 右 。n 插 入 效 率 表 示 有 插 入 片 段 的 克 隆 在 所 检 测 的 克 隆 中 所 占的 比 例 ， 也 是 通 过 此 法 检 测 的 。 第 二 节 cDNA文 库 的 构 建将 来 自 真 核 生 物 的 mRNA体 外 反 转 录 成 cDNA， 与 载 体 连 接并 转 化 大 肠 杆 菌 的 过 程 ， 称 为 cDNA文 库 的 构 建 。n 真 核 生 物 基 因 组 大 ， 结 构 复 杂 ， 含 有 大 量 的 非 编 码 区 、基 因 间 间 隔 序 列 和 重 复 序 列 等 ， 直 接 利 用 基 因 组 文 库 有 时 很难 分 离 到 目 的 基 因 片 段 。 n 即 使 分 离 到 DNA片 段 ， 也 必 须 同 其 cDNA序 列 进 行 比 较 ， 从而 确 定 该 基 因 的 编 码 区 、 非 编 码 区 、 翻 译 产 物 和 调 控 序 列 。 mRNA是 基 因 转 录 加 工 后 的 产 物 ， 不 含 有 内 含 子 和 其 他 调控 序 列 ， 结 构 相 对 简 单 ， 且 只 在 特 定 的 组 织 器 官 、 发 育 时 期表 达 因 此 ， 在 某 些 情 况 下 从 cDNA文 库 分 离 基 因 比 从 基 因 组文 库 中 分 离 基 因 更 具 优 势 n mRNA决 定 了 功 能 蛋 白 的 初 始 肽 链 的 翻 译 ， 可 以 用 来 研 究蛋 白 质 的 功 能 n 自 20世 纪 70年 代 中 期 首 次 合 成 cDNA以 来 ， 运 用 cDNA文 库进 行 基 因 克 隆 和 基 因 功 能 研 究 发 展 很 快 ， cDNA文 库 巳 成 为 分子 生 物 学 研 究 的 一 种 基 本 工 具 。 1.mRNA的 完 整 性 指 导 合 成 高 分 子 量 蛋 白 质 的 能 力 无 细 胞 翻 译 体 系 （ 源 于 网 织 红 细 胞 ） 哺 乳 动 物 总 mRNA可 编 码 10 100kDa蛋 白 指 导 合 成 目 的 多 肽 的 能 力 利 用 免 疫 沉 淀 和 SDS-PAGE mRNA的 大 小 500bp 8kb 大 部 分 1.5 2kb 3 mRNA的 富 集 按 大 小 对 mRNA进 行 分 级 分 离 分 离 不 同 大 小 的 mRNA（ 先 变 性 ， 如 氢 氧 化 甲 基 汞 ， 后梯 度 离 心 ， 蔗 糖 ） 体 外 翻 译 ， 检 测 每 份 中 的 比 活 cDNA的 分 级 分 离 近 年 来 多 采 用 此 方 法 ， 特 别 是 大 mRNA， 可 避 免 降 解mRNA, agarose分 离 大 小 易 辩 多 聚 核 糖 体 的 免 疫 学 纯 化 法 用 抗 体 来 纯 化 合 成 的 目 的 多 肽 的 多 聚 核 糖 体 免 疫 亲 和 柱 /A蛋 白 -Sepharose柱 ， 单 克 隆 抗 体 把 正 在 合成 新 生 链 的 多 聚 核 糖 体 结 合 到 A蛋 白 -spharose柱 上 ， 随 后 用EDTA解 离 下 来 ， 通 过 oligo(dT)层 析 分 离 mRNA。 此 法 分 离 的 mRNA只 占 总 mRNA的 0.01-0.05% 并 非 都 可 用 ， 根 据 材 料 、 来 源 、 特 异 性 来 选 择 根 据 计 算 公 式 ， 如 果 要 从 文 库 中 筛 到 每 个 细胞 只 含 1个 mRNA分 子 的 基 因 (期 望 值 p 0.99)，cDNA文 库 应 包 含 5,000,000 10,000,000个 重 组 子 ，而 对 于 高 丰 度 或 中 等 丰 度 基 因 ,文 库 包 含 105个 克隆 子 。n 早 期 的 cDNA文 库 多 以 噬 菌 体 为 克 隆 载 体 ， 主要 用 于 筛 选 单 个 目 的 基 因 。 在 经 过 均 一 化 处 理 的 cDNA文 库 中 ， 前 两 种 类 型 mRNA分 子对 应 的 cDNA克 隆 的 比 例 之 和 仅 为 4.6 ， 相 当 于 降 低 了 13.5倍 ， 低 丰 度 基 因 在 文 库 中 的 比 例 高 达 95.4 ， 相 当 于 提 高了 2.5倍 n 在 EST测 序 和 cDNA芯 片 的 研 究 中 ， 可 以 大 幅 度 降 低 成 本 ，相 对 提 高 一 些 极 低 丰 度 基 因 出 现 的 频 率 。n 随 着 越 来 越 多 物 种 的 全 基 因 组 测 序 的 完 成 ， 需 要 借 助 全长 cDNA序 列 进 行 基 因 预 测 和 功 能 注 释 ， 所 以 近 年 又 开 发 了多 种 全 长 cDNA文 库 构 建 技 术 。 二 、 cDNA文 库 的 构 建cDNA文 库 的 构 建 共 分 4步 ：n 1.细 胞 总 RNA的 提 取 和 mRNA分 离 ;n 2.第 一 链 cDNA合 成 ;n 3.第 二 链 cDNA合 成 ;n 4.双 链 cDNA克 隆 进 质 粒 或 噬 菌 体 载 体 并 导 入 宿主 中 繁 殖 。 n 1 RNA的 分 离n mRNA是 构 建 cDNA文 库 的 起 始 材 料 总 RNA中 绝 大 多 数 是tRNA和 rRNA， 而 mRNA只 占 总 RNA的 1 -5 ， mRNA的 含 量 取 决于 细 胞 类 型 和 细 胞 的 生 理 状 态 。n 在 单 个 哺 乳 动 物 细 胞 中 ， 大 约 有 360000个 mRNA分 子 ， 约12000种 不 同 的 mRNA， 有 些 mRNA分 子 占 细 胞 mRNA的 3 ， 而 有些 mRNA分 子 只 占 不 到 0.01 这 些 “ 稀 有 ” 或 “ 低 丰度 ” mRNA分 子 多 达 11000种 ， 在 每 个 细 胞 中 只 有 5-15个 分 子 ，占 基 因 总 数 的 45 n 由 于 mRNA在 总 RNA中 所 占 比 例 很 小 ， 因 此 从 总 RNA中 富 集mRNA是 构 建 cDNA文 库 的 一 个 重 要 步 骤 。 通 过 降 低 rRNA和 tRNA含 量 ， 可 大 大 提 高 筛 选 到 目 的 基 因 的 可 能 性 。 2 第 一 链 cDNA的 合 成n 由 mRNA到 cDNA的 过 程 称 为 反 转 录 ， 由 反 转 录 酶 催 化 n 常 用 的 反 转 录 酶 有 2种 :n AMV(来 自 禽 成 髓 细 胞 瘤 病 毒 ) n (42 ) RNase Hn Mo-MLV(来 白 Moloey鼠 自 血 病 病 毒 ) n (37 ) RNase H弱 长 mRNA n 二 者 都 是 依 赖 于 RNA的 DNA聚 合 酶 有 5 3 DNA聚 合 酶 活性 。n 目 前 常 用 的 反 转 录 酶 多 是 通 过 点 突 变 去 掉 了 RNase H活性 的 Mo-MLV。 反 转 录 酶 是 依 赖 RNA的 DNA聚 合 酶 ， 合 成 DNA时 需 要 引 物 引 导 。n 常 用 的 引 物 主 要 有 oligo(dT)引 物 和 随 机 引 物 。n oligo(dT)引 物 一 般 包 含 15-30个 脱 氧 胸 腺 嘧 啶 核 苷 和 一段 带 有 稀 有 酶 切 位 点 的 寡 核 苷 酸 片 段 随 机 引 物 , 一 般 是 包 含6-10个 碱 基 的 寡 核 苷 酸 短 片 段 。n oligo(dT)引 导 的 cDNA合 成 是 在 反 应 体 系 中 加 入 高 浓 度 的oligo(dT)引 物 ， oligo(dT)引 物 与 mRNA 5 末 端 的 poly(A)配对 ， 引 导 反 转 录 酶 以 mRNA为 模 板 合 成 第 一 链 cDNA。n 这 种 cDNA合 成 的 方 法 在 cDNA文 库 构 建 中 应 用 极 为 普 遍 。由 于 cDNA末 端 存 在 较 长 的 poly(A)， 对 后 续 的 cDNA测 序 产 生 一定 影 响 随 机 引 物 引 导 的 cDNA合 成 是 采 用 6-10个 随 机 碱基 的 寡 核 苷 酸 短 片 段 来 锚 定 mRNA并 作 为 反 转 录 的 起点 n 由 于 随 机 引 物 可 能 在 一 条 mRNA链 上 有 多 个 结 合位 点 而 从 多 个 位 点 同 时 发 生 反 转 录 ， 比 较 容 易 合 成特 长 的 mRNA分 子 的 5 端 序 列 。n 由 于 随 机 引 物 法 难 以 合 成 完 整 的 cDNA片 段 ， 因而 不 适 合 构 建 cDNA文 库 ， 一 般 用 于 RT-PCR和 5 -RACE. 3 第 二 链 cDNA的 合 成n cDNA第 二 链 的 合 成 就 是 将 上 一 步 形 成 的mRNA-cDNA杂 合 双 链 变 成 互 补 双 链 cDNA的 过 程 。 n cDNA第 二 链 合 成 的 方 法 大 致 有 4种 :n 自 身 引 导 合 成 法n 置 换 合 成 法n 引 导 合 成 法n 引 物 -衔 接 头 合 成 法 有 效 无 须 进 一 步 纯 化 不 需 用 S1酶 ， 否 则 会 导 致 cDNA的 大 量 损 失问 题 ： 如 何 脱 帽 以 便 进 入 载 体 5 端 cDNA不 能 合 成 （ 少 几 个 Nt） 有 可 能 仍 形 成 发 夹 结 构 (3)引 导 合 成 法 n 制 备 一 端 带 有 poly(dG)的 片 段 II和 带 有 poly(dT)的 载体 片 段 I;n 用 片 段 I来 代 替 oligo(dT)进 行 cDNA第 一 链 的 合 成n 在 第 一 链 cDNA合 成 后 直 接 采 用 末 端 转 移 酶 在 第 一 链 cDNA的 3 端 加 上 一 段 poly(dC)的 尾 巴n 用 限 制 性 内 切 酶 创 造 出 一 个 黏 性 末 端 ， 与 片 段 II一 起形 成 环 化 体 n 环 化 了 的 杂 合 双 链 在 RNase H、 大 肠 杆 菌 DNA聚 合 酶 I和 DNA连 接 酶 的 作 用 下 合 成 与 载 体 联 系 在 一 起 的 双 链 cDNA n (4)引 物 -衔 接 头 合 成 法 n 由 引 导 合 成 法 改 进 而 来 的 。n 第 一 链 cDNA合 成 后 直 接 采 用 末 端 转 移 酶 在 第 一 链 cDNA的 3 端 加 上 一 段 poly(dC)的 尾 巴 ，n dC后 用 一 段 带 接 头 序 列 的 poly(dG)短 核 苷 酸 链 作 引 物合 成 互 补 的 cDNA链 ，n 按 头 序 列 可 以 是 适 用 于 PCR扩 增 的 特 异 序 列 或 方 便 克隆 的 酶 切 位 点 序 列 。 n 这 一 方 法 目 前 已 经 发 展 成 PCR法 构 建 cDNA文 库 的 常用 方 法 。 4 双 链 cDNA连 接 到 质 粒 或 噬 菌 体 载 体 并 导入 大 肠 杆 菌 中 繁 殖 n 添 加 带 有 限 制 性 酶 切 位 点 接 头 有 两 种 方 式 :n 1)是 添 加 单 酶 切 位 点 接 头n 在 第 一 链 cDNA合 成 时 不 引 入 接 头 ， 而 直 接 在 第 二 链 上 通过 平 端 连 接 导 入 接 头 。n 当 导 入 的 黏 端 接 头 已 经 去 磷 酸 化 ， 则 可 以 在 分 级 分 离 后直 接 用 于 连 接 n 当 导 入 的 黏 端 接 头 带 有 活 性 磷 酸 基 团 时 ， 要 求 接 头 带 有对 甲 基 化 敏 感 的 限 制 性 内 切 酶 ， 且 加 接 头 之 前 须 对 双 链 cDNA进 行 甲 基 化 修 饰 以 免 被 限 制 酶 切 割 ， 加 接 头 后 再 用 接 头 带 有对 甲 基 化 敏 感 的 限 制 性 内 切 酶 消 化 双 链 cDNA， 创 造 黏 端 用 于连 接 。 2)是 在 cDNA的 5 和 3 末 端 分 别 引 入 不 同 的限 制 性 内 切 酶 位 点n 在 第 一 链 合 成 时 在 cDNA的 5 端 引 入 一 稀 有 酶 切 位 点(如 Not I)， 在 双 链 cDNA平 端 连 接 去 磷 酸 化 的 黏 端 接 头 (如Sal I)， 然 后 用 Not I酶 切 创 造 出 另 一 端 的 黏 端 ， 这 样 可以 与 对 应 双 酶 切 载 体 连 接 双 酶 切 法 连 接 的 cDNA插 入 方 向是 固 定 的 。 双 链 cDNA在 连 接 之 前 最 好 经 过 cDNA分 级 分 离 ， 回 收 大于 500bp的 cDNA用 于 连 接 。n 在 未 处 理 的 双 链 cDNA中 ， 有 很 多 小 于 500bp的 分 子 ，包 括 引 物 、 接 头 以 及 反 转 录 产 生 的 各 种 不 完 整 的 cDNA产 物 ，这 些 组 分 都 会 影 响 cDNA文 库 的 质 量 ， 如 造 成 很 多 假 阳 性 的重 组 子 ， 重 组 子 的 插 入 片 段 太 小 。n 分 级 分 离 最 简 单 的 、 应 用 最 广 的 是 层 析 柱 法 ， 它 可 以方 便 快 速 地 去 除 组 分 中 小 于 500bp的 分 子 ， 提 高 文 库 的 质量 cDNA文 库 的 载 体 选 择n 因 为 一 般 cDNA的 长 度 范 围 多 在 0.5-8kb之 间 ， 常 用 的 质粒 载 体 或 噬 菌 体 类 载 体 都 能 满 足 要 求 。n 一 般 而 言 ， 噬 菌 体 cDNA文 库 比 质 粒 文 库 筛 选 方 便 ， 如单 个 培 养 皿 内 可 以 铺 展 更 多 的 重 组 子 ， 复 制 用 于 杂 交 的 膜方 便 快 捷 ， 杂 交 背 量 低 等 。n 但 质 粒 文 库 在 后 续 操 作 上 更 加 方 便 且 用 途 更 广 。 四 、 酵 母 双 杂 交 系 统用 于 分 离 与 某 一 已 知 蛋 白 发 生 相 互 作 用 的蛋 白 质 基 因GAL4蛋 白 ： 酵 母 半 乳 糖 苷 酶 基 因 gal的 转 录 激 活 因 子 ， 该 蛋白 结 合 在 gal基 因 上 游 激 活 区 (UAS)可 启 动 gal基 因 的 转录 GAL4蛋 白 ： 可 分 为 两 个 区 域 DNA-BD: DNA结 合 域 , N-末 端 1-147aa AD: 转 录 激 活 域 ， C-末 端 768-881aa 融 合 蛋 白 ： DNA-BD域 / X蛋 白X蛋 白 与 靶 蛋 白 Y 可 发 生 作 用 构 建 融 合 表 达 文 库AD域 / cDNAhost 当 文 库 中 的 某 个 重 组 子 装 载有 蛋 白 Y的 cDNA时 ， 可 能 启动 LacZ(HIS)报 告 基 因 的 表 达 Invitrogen Hybrid Hunter