色谱分析法基本理论课件

5 51 1 概述概述5 52 2 色谱过程及常用术语色谱过程及常用术语5 53 3 色谱法基本理论色谱法基本理论第五章第五章 色谱分析法基本理论色谱分析法基本理论An Introduction to Chromatography5 51 1 概述概述 一、色谱法定义、实质和目的意义一、色谱法定义、实质和目的意义1、定义：是一种物理或物理化学的分离、分析方法。是基于混合物各组分在固定相、流动相两相中吸附、分配等作用的差异而实现分离，再逐个进行定性或定量分析的方法。2、实质：分离3、目的意义：实现多组分混合物的分离分析51 概述 1、1906年由俄国植物学家Tswett创立（植物色素分离）二、色谱法的由来色带色带固定相固定相CaCO3颗粒颗粒流动相流动相石油醚石油醚 属于液固色谱概念：固定相流动相色谱柱51 概述 2、现在：一种重要的分离、分析技术分离混合物各组分并加以分析固定相除了固体，还可以是液体 流动相液体、气体、超临界流体等色谱柱各种材质和尺寸被分离组分不再仅局限于有色物质二、色谱法的由来和发展51 概述 三、分类流动相流动相 固定相固定相 类型类型液体固体 液-固色谱液相色谱液相色谱液体 液体 液-液色谱气体 固体 气-固色谱气相色谱气相色谱气体 液体 气-液色谱超临界流体超临界流体色谱1、按两相分子的聚集状态分柱色谱 分配色谱：利用组分在固定液中分配系数的不同吸附色谱：利用组分在吸附剂上吸附能力的差异离子交换色谱：利用组分在离子交换剂上的亲和力大小差异尺寸排阻色谱：利用大小不同的分子在多孔固定相中选择渗透性的不同51 概述 2、按固定相的固定方式分三、分类填充柱色谱 毛细管柱色谱微填充柱色谱 纸色谱（PC）薄层色谱（TLC）薄膜色谱（TFC）平面色谱 3、按分离机制分色谱法简单分类51 概述 三、分类51 概述 四、色谱法的特点及发展趋势1、优点：“三高”、“一快”、“一广”1）高选择性：可将性质相似的组分分开2）高效能：反复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果3）高灵敏度：10-1110-13g，适于痕量分析4）分析速度快：几几十分钟完成分离，一次可测得多种样品5）应用范围广：气体，液体、固体物质对未知物分析的定性专属性差，需要与其他分析方法联用（GC-MS，LC-MS、GC-FTIR、SFC-MS、HPLC-UV、TLC-UV等）2、缺点：3、发展趋势：5 52 2 色谱流出曲线及有关概念色谱流出曲线及有关概念一、色谱过程二、有关概念5 52 2 色谱流出曲线及有关概念色谱流出曲线及有关概念一、色谱过程、分离原理和特点一、色谱过程、分离原理和特点1、色谱过程：是物质分子在相对运动的两相间“分配”平衡的过程。实现色谱操作的基本条件：（1）必须具备相对运动的两相（固定相、流动相）（2）混合物中，两个组分的“分配”系数K 不等，则被流动相携带移动的速度不等差速迁移，而被分离。“分配”系数的微小差异吸附能力的微小差异微小差异积累较大差异吸附能力弱的组分先流出 吸附能力强的组分后流出以吸附色谱为例：过程：吸附（固定相）解吸（流动相）再吸附 再解吸 一、色谱过程、分离原理及特点2、色谱分离特点 1）不同组分通过色谱柱时的迁移速度不等提供了分离的可能性2）各组分沿柱子扩散分布峰宽 不利于不同组分分离3、色谱分离原理 色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异（“分配”系数的不等），平衡分配可定量地用分配系数和分配比（容量因子）来表示。分配系数不等是分离的前提。分配系数不等是分离的前提。5 52 2 色谱流出曲线及有关概念色谱流出曲线及有关概念试样中各组分经色谱柱分离后，随流动相进入检测器，检测器将各组分的浓度（或质量）的变化转换为电压（或电流）信号，由记录仪记录下来，所得到的电信号强度时间曲线，即浓度（或质量）时间曲线，称为流出曲线，即色谱图。色谱峰对应某物质。二、常用术语二、常用术语1、色谱流出曲线（色谱图）5 52 2 色谱流出曲线及有关概念色谱流出曲线及有关概念2、基线：在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。反映仪器（主要是检测器）的噪音随时间的变化（噪音-时间曲线）。3、色谱峰流出曲线上的突起部分，即组分流经检测器所产生的信号。包括：峰高/峰面积（定量）、峰位（tR，定性）、峰宽（衡量柱效）4、拖尾因子（tailing factor，对称因子）衡量色谱峰的对称性。T=W0.05h/2d1W0.05h 为0.05 倍峰高处的峰宽；d1 为峰极大至峰前沿之间的距离。5 52 2 色谱流出曲线及有关概念色谱流出曲线及有关概念色谱峰包括正常峰（对称峰，T=0.951.05）和非对称峰（不正常色谱峰）前延峰（T 1.05）d15、保留值（tM、tR、tR、VM、VR、VR）（色谱定性参数色谱定性参数）5 52 2 色谱流出曲线及有关概念色谱流出曲线及有关概念1）保留时间（单位：min，S 或 cm）（与流速有关）A、保留时间 tR：某组分从进样开始到在色谱柱后出现浓度极大点时所需时间。（是色谱法定性的基本依据）B、死时间 tM：分配系数为0的组分即不被固定相吸附或溶解的组分（不保留组分）的保留时间。C、调整保留时间 tR=tR -tM （组分在固定相中的保留时间，实验条件（温度、固定相等）一定，tR 仅决定于组分性质）2）保留体积（与流速无关）A、保留体积 VR VR=tR Fc Fc：流动相的流速（mL/min）B、死体积 VM VM =tM Fc 固定相颗粒间所剩余的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间、检测器空间C、调整保留体积 VR VR =VR VM=tR Fc 3）相对保留值 r2,1（）：是色谱系统的分离选择性指标 r2,1=tR2/tR1=VR2/VR1 =K2/K1 仅随柱温、固定相以及流动相变化，当柱温、固定相、流动相不变时，该值与柱径、柱长、流动相流速无关。6、色谱峰峰高、峰面积及色谱峰区域宽度（1）峰高：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h 表示（2）峰面积：某色谱峰曲线与基线间包围的面积，以A 表示（3）色谱峰区域宽度：是描述色谱流出曲线的另一重要参数，反映了柱效的高低，区域宽度越窄，柱效越高，三种表示方式：1）标准差：0.607 倍峰高处色谱峰宽的一半。2）半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽度（单位：min，cm），W1/2=2.3553）基线宽度W：即峰宽，指色谱峰拐点上的切线在基线上的截距。W=4=1.699W1/2定量定量总结：1）根据峰数，可以判断样品所含组分的最少个数。2）根据保留值（tR、VR），可进行定性分析。3）根据峰高或峰面积，可进行定量分析。4）色谱峰区域宽度，是评价柱效的依据。5）两峰间的距离，是评价两相选择是否合适的依据。7、分配系数在一定温度和压力下，达到分配平衡时，K=CsCm组分在固定相中的浓度 g/mL组分在流动相中的浓度 g/mL1）样品从流动相进入固定相，很快在两相达到分配平衡。2）在流动相推动下瞬间打破平衡又瞬间达到新的分配平衡，即为动态平衡。3）样品正是在分配平衡溶解分配平衡循环往复达到分离测定目的。4）在给定条件下，同一物质K 相同，不同物质K 不同，从而出峰先后顺序不同，即保留时间不同，达到分离。5 52 2 色谱流出曲线及有关概念色谱流出曲线及有关概念5）K 适合多种机理吸附色谱：吸附平衡常数分配色谱：分配系数离子交换色谱：交换常数6）K 取值 大在固定相中粒子数多，组分在固定相停留时间长后出峰 小在固定相中粒子数少，组分在固定相停留时间短先出峰K 值由组分、固定相和流动相的热力学性质决定，是组分的特征常数。与两相性质和温度有关，与两相体积、柱管性质及使用仪器无关。K，tR，组分后出柱K=0，组分不保留K，组分完全保留一、色谱过程、分离原理及特点k=VsVm=K msmm=组分在固定相中的质量组分在流动相中的质量Cs*VsCm*Vmk=K*VsVm固定相的体积8、保留因子/容量因子（分配比）与分配常数的换算关系：保留因子与保留时间的关系：k=tR=tM(1+k)tR=tM(1+KVs/Vm)tR-tMtM当色谱柱或薄层板一定时，Vs与Vm一定；流速、温度一定，tM一定，tR主要取决于分配系数K，K大，tR大。在实验条件一定时，tR主要取决于组分的性质，可用于定性。流动相的体积5 52 2 色谱流出曲线及有关概念色谱流出曲线及有关概念例：关于保留因子的计算习题：在某色谱柱上A组分流出需要10min，组分B流出需要20min，而不溶于固定相的物质C流出需要2.0min，分别计算：A、B组分在柱中的保留因子。色谱分离前提色谱分离前提各组分分配系数不等各组分分配系数不等注：应选择合适分离条件使得难分离的组分K 不等1）组分一定，K 不等的前提 A、固定相和流动相改变B、T 改变2）色谱条件（s，m，T）一定时，K一定 tR一定9、分离度（、分离度（resolution，R）又称分辨率又称分辨率给定色谱柱对两种溶质分离程度的量度。是指相邻两峰峰顶间距离与两峰基线宽度平均值的比值（衡量色谱分离条件优劣的参数）；涉及色谱过程热力学因素和动力学因素。设色谱峰为正常峰（峰形对称且满足正态分布），且W1 W2=4若R=0，峰间距 tR=0，两峰完全重合；R=1，tR=4，两峰分离度可达98；R=1.5，tR=6，两峰离度可达99.7；可视为完全分离中国药典规定R 1.5可作为两组分分离的指标10、等温线与色谱峰形的关系等温线：指在一定温度下，某一组分在固定相和流动相之间达到平衡时，以组分在固定相中浓度CS为纵坐标，在流动相中浓度Cm为横坐标得到的曲线。CS=f(Cm)意义：1）其形状是重要的色谱特征之一。2）反映了在一定温度下，吸附剂对溶液中某组分的吸附能力。CsCm色谱色谱曲线曲线等温线等温线凸形凸形 主要主要控制溶质量，控制溶质量，防止拖尾防止拖尾凹形凹形拖尾峰拖尾峰前延峰前延峰结论：控制溶质的量，减少拖尾！结论：控制溶质的量，减少拖尾！5 53 3 色谱法基本理论色谱法基本理论色谱法是利用混合物中各组分在两相中K 值的不同而进行分离。要想使各组分实现有效的分离：一、必须使两峰相距较远二、必须使峰型很窄与组分在柱中的行走速度和扩散有关，研究如何选择最佳色谱条件以提高柱效属于动力学问题，为此提出了速率理论速率理论。如何使两峰相距较远：峰间距的大小由组分的分配系数来决定，研究如何改善组分在两相间的分配属于热力学问题，为此提出了塔板理论。如何使峰型很窄：一一、塔板理论、塔板理论假想：色谱柱每个H高度内有一块塔板，共有若干块塔板，组分在每块塔板两相间分配达平衡，K小的先出柱；多次分配平衡，K有微小差异组分仍可获较好分离。对于一根固定长度的色谱柱含塔塔板板数数n的的多多少少，则则作作为为柱柱效效高高低低的的一一种种量量度度。塔板理论亦称相平衡理论，由相平衡观点来研究分离过程。1、塔板理论四个基本假设2、色谱峰的二项式分布 3、色谱峰的正态分布 4、理论板数和理论塔板高度的计算1、塔板模型的基本假设塔板理论是建立在板模型基础之上的。设想一根色谱柱，由若干小段（H）组成。组分随流动相进入色谱柱后，在两相间进行分配。由于流动相移动，而固定相保持不动，虽然较快，组分不能在柱内各点瞬间达到分配平衡。但塔板理论假设：1）在柱内一小段高度H 内，组分很快达到分配平衡。H为理论塔板高度（板高）2）载气进入色谱柱中不是连续的前进，而是间歇式的，每次载气进入量为一个塔板体积。3）所有组分开始时都加在柱中第零块塔板上，且样品沿色谱柱方向的扩散（纵向扩散）可忽略不计。4）分配系数在各塔板上为常数。理论塔板的假设，实际上是把组分在相间的连续转移过程分解为间歇的在单个塔片中的分配平衡过程。即用分离过程的分解动作来说明色谱过程。（二）色谱峰的二项式分布（二）色谱峰的二项式分布（N 50）近似对称分布讨论讨论 Cmax即流出曲线的峰高C：任意时间t时组分在柱出口处的浓度C0：峰面积，某组分的总量4、理论板数和理论塔板高度的计算、理论板数和理论塔板高度的计算 理论塔板高度H：为使组分在柱内两相间达到 一次分配平衡所需要的柱长。理论塔板数n：组分流过色谱柱时，在两相间 进行平衡分配的总次数。neff/n理 =(tR/tR)2=tR/tM(1+k)2=k/(1+k)2 小结小结1）塔板理论的贡献：从热力学角度解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大点的位置阐明了保留值与K的关系提出了评价柱效高低的n和H的计算式2）在比较相似柱的柱效时有用须在给定条件，指定组分测定时才有意义例1：在柱长为2m的5%的阿皮松柱、柱温为100C，记录纸速度为2.0cm/min的色谱条件下，测定苯的保留时间为1.5min，半峰宽为0.20cm，求理论塔板数和理论塔板高度。解：5 5、塔板理论优缺点、塔板理论优缺点成功处：解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大值对应的tR 阐明了保留值与K的关系评价柱效（n、H）存在问题:1）做出了四个与实际不相符的假设，忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程2）只定性给出塔板高度的概念，却无法解释影响板高的因素3）排除了一个重要参数流动相的线速度u，因而无法解释柱效与流速之间的关系更无法提出降低板高的途径1956年荷兰学者 Van Deemter 等人在研究气液色谱时提出了速率理论，在塔板理论的基础上引入了影响板高的动力学因素，将色谱过程与柱内组分的分子运动联系起来，认为影响板高的因素有三，并建立了速率方程（范第姆特方程）。速率方程H=A+B/u+Cu二二、速率理论速率理论速率理论阐明影响柱效（色谱峰扩展）的因素H=A+B/u+CuA：涡流扩散（eddy diffusion）系数也叫多径扩散系数B：纵向扩散（longitudinal diffusion）系数C：传质阻抗（mass transfer resistance）系数u：载气线速度 塔板高度流速曲线由速率方程及上图可看到流速对柱效的影响：1）当u小时，B/u 项大，Cu 项小；2）当u大时，B/u项小，Cu项大；3）Hmin=A+2(B.C)1/2 4）最佳载气速度：uopt=(B/C)1/2对于一根100cm长的柱来说，其最佳流量在550 mL/min，或每小时0.33倍的柱体积。1、涡流扩散项（多径扩散项）：A 产生原因：载气携样品进柱，遇到来自固定相颗粒的阻力 不断改变流向，路径长短不一 涡流扩散影响因素：固体颗粒越小，填充越实，A项越小 注：颗粒太小，柱压过高填充柱：60100目空心毛细管柱（0.20.5mm），A=0，n理 较高对于填充柱，填充均匀性与柱径大小有关，25mm最均匀 讨论：2、纵向扩散项（分子扩散项）：B/u产生原因：组分在固定相中被流动相推动向前、展开 前后存在浓度差 r影响因素：讨论：注：为了减小纵向扩散，宜选用分子量较大的载气、较高线速度和较低柱温选择载气原则：兼顾分析时间和减小纵向扩散 u 较小时，选M 较大的N2气（粘度大）u 较大时，选M 较小的H2气，He 气（粘度小）3、传质阻抗项：Cu产生原因：样品在气液两相分配，样品未及分配平衡就被载气带走，有的则滞后，而造成峰扩张影响因素：固定液应完全覆盖载体表面，不可以太薄，否则柱子寿命短，k太小；T不可以超过固定液最佳使用温度采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度小结：范氏方程说明了在色谱分离条件的选择中，以下各因素对柱效和峰宽的影响。（1）填充物填充均匀程度、粒度；（2）载气种类及流速；（3）色谱柱温度（4）固定相的液膜厚度（5）柱直径1、流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）三三、液相色谱中的液相色谱中的速率理论速率理论 速率理论也适用于液相色谱。只是由于液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作流动相，使速率方程式中的纵向扩散项（分子扩散项）对H值的影响与气相色谱不同，可以忽略。2、涡流扩散项、涡流扩散项（多径扩散项）：A 影响因素：dp：降低dp，采用小粒度固定相，常用3-5m。：降低，球形、粒度均匀的固定相。使用小而均匀的填充颗粒能改善柱效讨论：3、传质阻抗项、传质阻抗项H=A+Cu=A+Cmu+Csmu 4、液相色谱中的、液相色谱中的速率理论速率理论 在液相色谱中，提高柱效的方法：1）减小填料孔穴深度；2）减小填料颗粒；3）用低黏度的溶剂作流动相；4）流动相采用低流速；5）适当提高柱温。四、色谱分离基本方程式（影响色谱分离的条件）四、色谱分离基本方程式（影响色谱分离的条件）n：理论塔板数：选择因子（分配系数比）k2：色谱图上相邻两个组分中第二组分的容量因子柱容量项柱效项柱选择项前提：定义式基础上，相邻两组分的n一致（假设）1 1、柱效项及其影响因素、柱效项及其影响因素影响色谱峰的宽窄（峰形）主要取决于色谱柱（固定相）性能及载气流速1）增加柱效是提高分离度的一个直接有效手段提高柱效、改善分离的途径：增加柱长；降低板高；增加柱长虽使n，但延长分析时间，引起峰扩张设法使H，才是增加R 的最好办法2）根据速率理论（H=A+B/u+Cu），降低板高、提高柱效的方法是：A、采用粒度较小、均匀填充的固定相（A项）B、分配色谱应控制固定液液膜厚度（C项）C、适宜的操作条件：流动相的性质和流速，柱温等（B项）选用分子量较大、线速度较小的载气，如N2气（GC）控制较低的柱温讨论：讨论：2 2、柱选择项及其影响因素：、柱选择项及其影响因素：影响峰的间距 受固定相、流动相性质及柱温影响 2 时 短时间内组分会完全分离 接近1时 延长时间才能完全分离 (=1.01分离时间是=1.1时的84倍)=1时 无法分离增大柱选择性是改善分离度的最有力手段1）气相色谱中，柱选择性取决于固定相性质和柱温A、选择合适的固定相与不同组分的作用，产生差别，实现分离B、一般说，降低柱温可以增大柱的选择性2）在液相色谱中主要通过改变流动相性质讨论：讨论：3、柱容量项及其影响因素：、柱容量项及其影响因素：影响峰位（tR）主要受固定相用量、柱温和载气流速的影响综合考虑分离度、分离时间和峰检测几项因素k 太大 A、延长分析时间 B、造成检测困难k 10 分离度提高不明显k 2 淋洗时间会出现极小值控制 k 的最佳范围 25GC中，增加固定液用量和降低柱温可以增加 kLC中，改变流动相性质来增加 k讨论：讨论：影响两峰间距k 影响峰位n 影响峰宽窄