呼吸道感染的微生物检验

如 何 提 高 呼 吸 道 感 染 的 病 原 学诊 断 呼 吸 道 感 染 （ RTI） 呼 吸 道 感 染 （ RTI） 是 一 种 常 见 病 、 多 发 病 、 高 居 门 、 急诊 就 诊 患 者 人 数 的 首 位 。 据 统 计 ， 我 国 每 年 有 近 5亿 人 感 染 呼 吸 系 统 疾 病 ， 7岁 以 下儿 童 平 均 每 人 每 年 患 急 性 RTI 34次 。 RTI是 抗 菌 药 物 使 用 频 率 最 高 、 用 量 最 多 的 疾 病 。 抗 菌 药物 出 现 使 感 染 性 疾 病 病 死 率 下 降 。 人 类 平 均 寿 命 延 长 。 然而 ， 由 于 滥 用 抗 生 素 ， 导 致 菌 群 失 调 ， 耐 药 菌 株 逐 年 增 多 ，如 ： MRSA、 ESBL、 SSBL、 VRSA、 VRE等 超 级 细 菌 。耐 药 菌 感 染 成 为 除 癌 症 、 心 脑 血 管 疾 病 和 AIDS外 威 胁 人类 健 康 的 第 四 大 医 学 问 题 。 抗 菌 药 物 的 不 合 理 使 用 是 一 个世 界 范 围 的 现 象 ， 抗 菌 药 物 总 产 量 的 一 半 用 于 动 物 ， 在 人类 使 用 的 另 一 半 中 ， 近 50%用 于 呼 吸 道 感 染 。 什 么 是 呼 吸 道 感 染 呼 吸 道 感 染 包 括 鼻 、 咽 、 喉 、 气 管 、 支 气 管 及 肺 部 的 感 染 性 炎 症 。 呼吸 道 以 环 状 软 骨 为 界 ， 分 为 上 、 下 呼 吸 道 。 上 呼 吸 道 包 括 鼻 、 咽 、 喉 ，其 感 染 称 上 呼 吸 道 感 染 。 下 呼 吸 道 包 括 气 管 、 主 支 气 管 、 叶 、 段 支 气管 直 至 肺 泡 ， 其 感 染 称 下 呼 吸 道 感 染 。 上 呼 吸 道 感 染 主 要 病 原 体 ： 细 菌 和 病 毒 下 呼 吸 道 感 染 病 原 体 包 括 ： 细 菌 、 病 毒 、 真 菌 、 支 原 体 、 衣 原 体 、 立克 次 体 等 微 生 物 及 较 少 见 的 原 虫 、 吸 虫 、 绦 虫 等 寄 生 虫 。 合 理 的 诊 断 常 见 下 呼 吸 道 感 染 有 ： 社 区 获 得 性 肺 炎 （ CAP） 、 医 院 获得 性 肺 炎 （ HAP） 呼 吸 机 相 关 肺 炎 （ VAP） 、 慢 性 阻 塞 性肺 疾 病 急 性 加 重 （ AECOPD） 等 。 对 于 这 些 疾 病 ， 合 理 用药 延 缓 耐 药 发 展 的 前 提 条 件 是 对 病 原 菌 的 正 确 诊 断 。 对 于重 症 肺 部 感 染 ， 只 有 找 到 病 原 菌 ， 才 能 选 择 正 确 的 抗 菌 药物 ， 合 理 用 药 ， 避 免 耐 药 的 发 生 。 目 前 临 床 对 病 原 学 诊 断的 重 要 性 认 识 不 足 ， 常 常 满 足 于 经 验 性 治 疗 ， 经 常 见 到 病因 模 糊 的 诊 断 如 “ 慢 性 肺 炎 ” ； “ 不 明 原 因 肺 炎 或 肺 部 感染 ” 的 诊 断 屡 见 不 鲜 。 临 床 与 微 生 物 检 验 脱 节 ； 临 床 医 生不 相 信 细 菌 室 的 报 告 ， 对 合 格 标 本 的 取 材 认 识 不 足 ； 微 生物 室 不 关 心 患 者 情 况 ， 回 报 时 间 晚 ， 阳 性 率 低 ； 检 验 设 备 、科 研 投 入 不 足 。 这 些 均 限 制 了 病 原 学 诊 断 的 发 展 。 初 诊患 者 的 主 要 症 状 是 咳 嗽 、 咳痰 、 高 热 、 胸 痛 ， 可 伴 有 呼 吸异 常 、 咯 血 诊 断肺 炎 的 典 型 症 状体 检 发 现 ：*热 病 容 ， 少 数 病 人 有 呼 吸 急 迫 和 紫 绀 。*患 侧 呼 吸 度 减 弱 ， 语 颤 可 增 强 或 减 弱 ， 叩 诊 有 浊 音 ，听 诊 可 有 支 气 管 呼 吸 音 或 湿 罗 音 ， 少 数 病 人 可 有 胸膜 摩 擦 音 或 呼 吸 音 减 弱 。胸 部 X线 检 查 ： 炎 性 浸 润 阴 影 也 可 出 现 肺 叶 实 变 、空 洞 形 成 、 胸 腔 积 液 。病 原 学 检 查 ：*痰 或 胸 水 涂 片 检 查 ， 培 养 致 病 菌 及 抗 生 素 敏 感 试 验 ，连 做 2、 3次 。*免 疫 荧 光 ， 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 ， 对 流 免 疫 电 泳 等 方法 检 测 血 清 病 原 菌 的 抗 原 或 抗 体 。*聚 合 酶 链 反 应 检 测 病 原 体 。血 液 检 查 ： 细 菌 感 染 者 的 白 细 胞 计 数 及 中 性 粒 细 胞 一 般 均 升 高 ， 可 有 核 左 移 。其 他 辅 助 检 查 ： 必 要 时 进 行 血 气 分 析 ， 肝 、 肾 功 能 、血 清 电 解 质 等 相 关 检 查 。诱 发 因 素上 呼 吸 道 病 毒 感 染突 然 受 寒 、 饥 饿 、 疲 劳 、 醉 酒 等 ， 消弱 全 身 抵 抗 力 。某 些 慢 性 疾 病 患 者 ， 如 免 疫 缺 陷 。 糖尿 病 ， 肾 功 能 衰 竭 。 危 险 因 素1.COPD/支 扩 /陈 旧 肺 结 核 /肺 间 质 纤 维 化 等 基 础 肺 疾 病2.糖 尿 病3.慢 性 心 、 肾 功 能 不 全4.慢 性 肝 疾 患5.误 吸 或 易 致 误 吸 因 素6.脾 切 除 术 后7.慢 性 酗 酒 或 营 养 不 良 ， 吸 烟 8.精 神 状 态 改 变9.近 一 年 内 因 社 区 获 得 性 肺 炎 住 院 史 呼 吸 道 感 染 诊 断 治 疗 原 则合 理 使 用 抗 生 素 在 用 药 前 ， 尽 早 采 集 标 本 进 行 细 菌 鉴 定 及药 敏 试 验 ， 明 确 病 原 学 诊 断 ， 以 便 针 对 性使 用 敏 感 的 抗 菌 药 物 。 在 细 菌 病 原 学 未 分 离 出 来 前 ， 先 采 取 经 验性 治 疗 。 病 人 的 分 组 和 经 验 治 疗1 组门 诊 病 人 ， 60岁 以下 ， 无 危 险 因 素 ，轻 -中 症 肺 炎 常 见 病 原 菌肺 炎 链 球 菌 ， 肺 炎 衣 原 体 ，肺 炎 支 原 体 ， 流 感 嗜 血 杆 菌 适 用 抗 生 素大 环 内 酯 类 、 青 霉 素 、多 西 环 素 、 第 一 代 头 孢 、喹 诺 酮 类 复 方 新 诺 明 组门 诊 病 人 ， 60岁以 上 或 有 危 险 因 素 ，轻 -中 症 肺 炎 常 见 病 原 菌肺 炎 链 球 菌 、流 感 嗜 血 杆 菌 、需 氧 革 兰 氏 阴 性 杆 菌 、金 黄 色 葡 萄 球 菌 、 卡 他 莫 拉 菌 适 用 抗 生 素第 二 代 头 孢 、-内 酰 胺 类 / 酶 抑 制 剂氟 喹 诺 酮 类尚 可 加 用 大 环 内 酯 类 组住 普 通 病 区 的住 院 病 人 常 见 病 原 菌肺 炎 链 球 菌 、 流 感 嗜 血 杆 菌 、需 氧 革 兰 氏 阴 性 杆 菌 、金 黄 色 葡 萄 球 菌 、 混 合 菌 （ 包括 厌 氧 菌 ） 、 肺 炎 衣 原 体 、铜 绿 假 单 胞 菌 适 用 抗 生 素第 二 代 头 孢 、头 孢 噻 肟 / 头 孢 曲 松 / 头 孢 吡 肟-内 酰 胺 类 / 酶 抑 制 剂氟 喹 诺 酮 类上 述 药 物 可 加 用 大 环 内 酯 类 组 住 ICU的 病 人 常 见 病 原 菌肺 炎 链 球 菌 、需 氧 革 兰 氏 阴 性 杆 菌 、军 团 菌 、 肺 炎 支 原 体 、流 感 嗜 血 杆 菌 、铜 绿 假 单 胞 菌 适 用 抗 生 素头 孢 噻 肟 / 头 孢 曲 松 / 抗 假 单 胞 菌 -内 酰 胺 类 / 酶抑 制 剂碳 青 霉 烯 类氟 喹 诺 酮 类 +氨 基 糖 苷 类尚 可 加 用 大 环 内 酯 类 病 原 特 异 性 治 疗 参 考 09年 CLSI抗 菌 药 物 敏 感 性 试 验 标 准 1肺 炎 链 球 菌 首 选青 霉 素 和 阿 莫 西 林 次 选-内 酰 胺 类 / 酶 抑 制 剂喹 诺 酮 类 其 他大 环 内 酯 类四 环 素 类厌 氧 菌肠 杆 菌 属包 括 变 形 杆 菌克 雷 伯 菌 属大 肠 埃 希 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌军 团 菌 属 首 选青 霉 素 /-内 酰 胺酶 抑 制 剂甲 硝 唑 、 克 林 霉 素 首 选第 三 代 头 孢 菌 素可 加 用 氨 基 糖 苷 类耐 甲 氧 西 林 菌 株 ：首 选 -万 古 霉 素对 甲 氧 西 林 敏 感 菌 株 ：首 选 -耐 酶 合 成 青 霉 素 ，如 氯 唑 西 林萘 夫 西 林苯 唑 西 林双 氯 青 霉 素 钠第 一 代 头 孢 菌 素 首 选红 霉 素 +利 福 平喹 诺 酮 类 次 选其 他 -内 酰 胺 / -内 酰 胺酶 抑 制 剂 次 选碳 青 霉 烯 类耐 甲 氧 西 林 菌 株 ：次 选 -利 福 平 、 磷 霉 素 、夫 西 地 酸对 甲 氧 西 林 敏 感 菌 株 ：次 选 -万 古 霉 素 、 克 林 霉 素 次 选其 他 大 环 内 酯 类 其 他氨 基 糖 苷 类林 可 霉 素 其 他氨 曲 南青 霉 素 类 / 酶 抑 制 剂喹 诺 酮 类 其 他氨 基 糖 苷 类大 环 内 酯 类复 方 新 诺 明 其 他多 西 环 素复 方 新 诺 明 病 原 特 异 性 治 疗 （ 续 ）1 铜 绿 假 单 胞 菌流 感 嗜 血 杆 菌 支 原 体 或 衣 原 体卡 他 莫 拉 菌 首 选氨 基 糖 苷 类 或 环 丙 沙 星 ，加 以 下 任 一 具 有 抗 假 单 胞 菌 活 性 的 抗 生 素 ：半 合 成 青 霉 素 类 （ 如 替 卡 西 林 、 哌 拉 西 林 、美 洛 西 林 ） ； 头 孢 菌 素 类 （ 如 头 孢 他 啶 、头 孢 吡 肟 ） 、 氨 曲 南 首 选第 二 、 三 代 头 孢 菌 素青 霉 素 类 首 选多 西 环 素大 环 内 酯 类 首 选第 二 、 三 代 头 孢 菌 素复 方 新 诺 明 次 选碳 青 霉 烯 类（ 如 亚 胺 培 南或 美 洛 培 南 ）氟 喹 诺 酮 类 次 选-内 酰 胺 类 / 酶 抑 制 剂氟 喹 诺 酮 类 次 选氟 喹 诺 酮 类 次 选大 环 内 酯 类青 霉 素 类 / 酶 抑 制 剂 其 他大 环 内 酯 类四 环 素 类复 方 新 诺 明 其 他四 环 素 类 其 他喹 诺 酮 类请 以 药 敏 试 验 结 果 来 指 导 用 药 ， 并 合 理 运 用 最 新 CLSI标 准 来 合 理 解 释 结 果 的 可 靠 性 细 菌 室 做 药 敏 试 验 的 几 点 原 则 1、 只 有 怀 疑 该 分 离 菌 为 感 染 病 原 菌 时 才 做 药 敏 试 验 。 2、 一 定 要 用 CLSI规 定 的 药 敏 试 验 方 法 或 厂 家 提 供 的 说 明 书 来 操 作 和 解 释 结果 。 3、 只 选 择 合 适 于 靶 细 菌 及 感 染 靶 位 的 抗 菌 药 物 进 行 测 试 和 向 临 床 报 告 。 4、 要 频 繁 地 进 行 质 控 工 作 以 确 保 试 验 的 准 确 性 。 5、 要 加 快 向 临 床 或 感 控 部 门 报 告 无 菌 部 位 、 全 身 感 染 发 现 的 致 病 菌 、 耐 药 类型 和 药 敏 信 息 以 及 致 病 性 强 或 有 意 义 的 不 常 见 菌 株 ， 如 鼠 疫 杆 菌 、 炭 疽 杆 菌 、布 氏 杆 菌 等 毒 株 ； 诺 卡 菌 、 分 枝 杆 菌 、 放 线 菌 、 侵 袭 性 真 菌 等 。 同 时 还 要 报告 院 内 多 重 耐 药 株 的 爆 发 流 行 。 这 样 做 是 可 以 较 好 地 解 决 临 床 科 室 与 细 菌 室 之 间 上 面 提 到 一 些 沟 通 方 面 的 问题 的 。 如 何 提 高 诊 断 水 平 首 先 要 明 白 什 么 是 痰 ？ 在 人 体 气 管 、 支 气 管 的 内 壁 都 覆 盖 着 一 层 黏 膜 ， 由 纤 毛 柱 状 上 皮 和 杯状 细 胞 组 成 ， 在 黏 膜 下 层 含 较 多 的 黏 液 腺 和 浆 液 腺 ， 腺 体 导 管 开 口 于黏 膜 表 面 。 正 常 情 况 下 ， 杯 状 细 胞 和 腺 体 分 泌 少 量 黏 液 覆 盖 在 黏 膜 层表 面 ， 对 黏 膜 层 起 保 护 作 用 。 可 保 持 气 管 黏 膜 的 湿 润 ， 以 便 把 吸 入 气管 、 支 气 管 内 的 尘 埃 颗 粒 、 细 菌 等 黏 附 ， 阻 挡 其 进 入 肺 组 织 深 处 ， 然后 再 借 助 纤 毛 柱 状 上 皮 的 纤 毛 摆 动 ， 把 他 们 排 到 气 管 上 端 的 喉 头 部 位 ，经 口 腔 咳 出 ， 咳 出 物 就 是 痰 。 病 理 状 态 下 的 痰 ： 当 气 管 、 支 气 管 、 肺 受 到 有 害 因 素 或 致 病 菌 感 染 发生 炎 症 时 ， 黏 液 大 量 分 泌 ， 有 利 于 清 除 异 物 。 但 黏 液 分 泌 过 多 ， 加 重了 纤 毛 柱 状 上 皮 细 胞 的 负 担 ， 不 利 于 黏 液 的 排 出 ， 在 细 菌 及 其 毒 素 的作 用 下 ， 产 生 一 些 变 性 坏 死 组 织 细 胞 ， 潴 留 在 支 气 管 内 ， 黏 液 和 这 些变 性 坏 死 的 组 织 细 胞 就 构 成 了 病 理 状 态 下 的 痰 。 痰 液 检 查 的 目 的 ： （ 1） 协 助 诊 断 某 些 呼 吸 系 统 疾 病 ， 如 支 气 管 哮 喘 、支 气 管 扩 张 等 ； （ 2） 确 诊 某 些 呼 吸 系 统 疾 病 ， 如 肺 结 核 、 肺 癌 、 肺 吸 虫 病 等 ； （ 3） 观 察 疗 效 和 预 后 判 断 。 如 何 提 高 诊 断 水 平 一 、 临 床 医 生 应 当 注 意 标 本 的 正 确 取 材 。 采 集 合 格 标 本 对 细 菌 的 诊 断 尤 为 重 要 送 检 指 征 ： 凡 是 发 热 、 咳 嗽 和 咳 痰 ， 痰 呈 脓 性 、 粘 稠 或 血 性 ， 并 伴 有 胸 痛 、气 急 、 肺 部 闻 及 湿 罗 音 ， 外 周 血 白 细 胞 总 数 及 中 性 粒 细 胞 比 例 明 显 增 高 ， X线检 查 提 示 肺 部 有 炎 症 性 浸 润 或 胸 腔 积 液 ， 甚 至 出 现 感 染 性 休 克 和 呼 吸 衰 竭 等患 者 ， 应 该 采 集 痰 液 或 下 呼 吸 道 标 本 送 细 菌 室 检 验 。 正 确 的 采 集 时 间 和 频 率 ： （ 1） 在 抗 菌 素 应 用 前 采 集 （ 2） 最 好 在 清 晨 采 集 痰 标 本 ； 多 数 患 者 在 清 晨 痰 较 多 ， 且 含 菌 量 也 多 ， 即 使对 痰 量 少 的 患 者 ， 也 以 清 晨 最 为 容 易 。 （ 3） 对 于 细 菌 性 肺 炎 ， 痰 标 本 送 检 每 天 1次 ， 连 续 23天 ； 不 建 议 24h内 多 次 采 集 ， 除 非 痰 液 外 观 性 状 出 现 改 变 （ 4） 怀 疑 分 枝 杆 菌 感 染 者 ， 应 连 续 收 集 3天 清 晨 痰 液 送 检 。 正 确 的 采 集 方 法 正 确 的 采 集 方 法 ： （ 1） 自 然 咳 痰 法 ： 留 取 前 刷 牙 ， 用 清 水 漱 口 3次 (或 硼 酸 漱 口 ） ， 以 除 去 口 腔内 大 部 分 杂 菌 ， 之 后 用 力 咳 出 呼 吸 道 深 部 的 痰 液 吐 到 无 菌 广 口 瓶 内 。 盖 好 盖子 。 患 者 痰 液 较 深 不 易 咳 出 时 ， 可 在 咳 痰 前 捶 背 、 协 助 排 痰 。 采 集 的 痰 量 不少 于 1ml。 （ 2） 经 支 气 管 镜 抽 吸 法 ： 纤 维 支 气 管 镜 检 查 可 直 接 从 肺 部 感 染 病 灶 获 取 支 气管 分 泌 物 ， 到 那 不 能 完 全 避 免 咽 喉 部 正 常 菌 群 污 染 。 适 用 于 不 能 咳 出 足 够 量痰 液 的 患 者 。 常 用 ： 支 气 管 肺 泡 灌 洗 液 （ BALF） 、 防 污 染 样 本 毛 刷 （ PSB） 其 中 BALF可 收 集 较 大 范 围 肺 实 质 的 肺 泡 表 面 衬 液 标 本 ， 对 肺 部 感 染 如 结 核 、霉 菌 等 感 染 可 提 高 细 菌 的 发 现 率 和 培 养 阳 性 率 。 对 于 普 通 细 菌 感 染 者 其 细 菌培 养 10 5cfu/ml 时 为 确 定 感 染 的 阈 值 。 但 对 于 某 些 特 殊 感 染 ， 如 在 肺 泡 灌 洗液 中 分 离 出 结 核 分 枝 杆 菌 、 军 团 菌 即 可 做 出 诊 断 。 对 卡 氏 肺 孢 子 菌 的 感 染 敏感 性 为 85%90%。 （ 3） 经 人 工 气 道 吸 引 分 泌 物 （ ETA） ： 目 前 较 为 常 用 的 微 生 物 检 验 标 本 （ 4） 经 气 管 穿 刺 吸 引 物 （ TTA） ： 采 集 到 的 下 呼 吸 道 标 本 不 受 上 呼 吸 道 正 常菌 群 污 染 。 效 果 好 ， 但 患 者 通 常 不 会 接 受 ， 适 用 于 高 度 怀 疑 厌 氧 菌 感 染 者 和昏 迷 患 者 。 （ 5） 经 胸 壁 针 刺 吸 引 物 （ TNA） ： 对 于 感 染 性 疾 病 ， 仅 用 来 诊 断 一 些 不 明 原因 的 肺 炎 （ 尤 其 儿 童 ） （ 6） 胃 内 采 痰 法 ： 清 晨 空 腹 时 ， 将 胃 管 插 入 胃 内 ， 用 注 射 器 抽 取 胃 液 。 适 用于 无 自 觉 症 状 的 肺 结 核 病 人 或 者 婴 幼 儿 不 会 咳 嗽 ， 常 将 痰 液 吞 咽 入 胃 ， 可 通过 采 集 胃 内 容 物 做 结 核 分 枝 杆 菌 培 养 ， 不 适 合 其 他 细 菌 培 养 。 （ 7） 小 儿 取 痰 法 ： 用 弯 压 舌 板 向 后 压 舌 ， 用 棉 拭 子 伸 入 咽 部 ， 小 儿 因 压 舌 刺激 咳 嗽 时 ， 可 喷 出 肺 部 或 气 管 分 泌 物 粘 附 在 拭 子 上 ， 从 而 获 得 标 本 。 （ 8)物 化 蒸 汽 吸 入 法 ： 适 用 于 无 痰 和 极 少 痰 的 患 者 。 用 3%5%Nacl,雾 化 吸 入进 行 导 痰 。 对 肺 组 织 标 本 ， 临 床 常 常 重 视 病 理 检 查 ， 而 忽 略 了 微 生 物 检 验 。 对 于 疑 难 病例 ， 送 病 理 的 同 时 ， 应 同 时 送 细 菌 室 进 行 细 菌 学 的 涂 片 、 镜 检 和 培 养 。 送 检时 将 肺 组 织 标 本 浸 泡 在 0.20.5ML的 无 菌 生 理 盐 水 中 ， 以 防 其 干 燥 。 呼 吸 道 标 本 运 送 不 可 接 受 的 标 本 包 括 唾 液 样 痰 、 24h收 集 的 痰 和 拭 子 。 临床 医 生 应 当 督 导 患 者 咳 出 合 格 的 痰 标 本 ， 而 非 唾 液 。 下 呼 吸 道 标 本 应 在 采 集 后 立 即 （ 20min内 ） 送 至 细 菌 室 ，并 于 1h内 接 种 ， 室 温 下 放 置 超 过 2h会 降 低 肺 炎 链 球 菌 、 流感 嗜 血 杆 菌 的 分 离 率 ， 这 是 由 于 定 植 于 上 呼 吸 道 的 非 致 病菌 过 度 生 长 所 致 。 特 别 需 要 注 意 的 是 ， 肺 炎 链 球 菌 、 流 感嗜 血 杆 菌 等 苛 养 菌 不 喜 低 温 ， 此 类 下 呼 吸 道 标 本 勿 冷 藏 。 不 能 及 时 接 种 的 标 本 可 以 4 冰 箱 保 存 （ 疑 为 肺 炎 链 球 菌 、流 感 嗜 血 杆 菌 等 苛 养 菌 感 染 不 在 此 列 ） ， 以 免 杂 菌 生 长 。但 保 存 标 本 应 在 24h内 处 理 。 对 可 疑 烈 性 呼 吸 道 传 染 病 （ 如 SARS、 肺 炭 疽 、 肺 鼠 疫 等 ）的 患 者 检 验 标 本 ， 在 采 集 、 运 送 或 保 存 过 程 中 必 须 注 意 生物 安 全 防 护 。 血 培 养 血 液 ： 当 患 者 发 热 体 温 （ 38 ） 或 低 体 温（ 36.0 ） 时 ； 或 外 周 血 白 细 胞 计 数 超 过10 109个 /L（ 特 别 是 存 在 核 左 移 时 ） ； 或 粒 细 胞绝 对 值 减 少 （ 成 熟 中 性 粒 细 胞 计 数 少 于 1 109个/L） ； 或 合 并 有 明 显 感 染 症 状 体 征 、 伴 有 感 染 病灶 存 在 时 ， 应 当 及 时 抽 血 作 23份 血 培 养 。 “ 份数 ” 是 指 “ 穿 刺 点 ” 的 数 量 ， 而 非 瓶 子 数 。 对 于成 人 ， 每 瓶 血 量 应 为 810ML。 儿 童 患 者 ， 每 瓶 血量 应 为 15ML。 当 怀 疑 厌 氧 菌 感 染 或 其 他 特 殊 细 菌 感 染 时 ，应 当 与 细 菌 室 联 系 ， 并 在 必 要 时 进 行 床 边接 种 。 临 床 医 生 应 及 时 与 细 菌 室 沟 通 ， 介绍 患 者 病 情 ， 征 求 细 菌 室 的 意 见 。 对 于 肺组 织 的 标 本 ， 应 当 展 开 大 撒 网 式 检 测 。 及时 沟 通 ， 有 助 于 提 醒 细 菌 室 在 大 撒 网 的 同时 ， 有 所 侧 重 ， 以 提 高 检 出 的 阳 性 率 。 二 、 微 生 物 室 应 当 重 视 下 呼 吸 道 标 本 的 标 准 化 操 作 。 所 有 痰 标 本 应 记 录 其 外 观 和 性 状 ， 如 脓 痰 、 黏 液 脓 痰 、 黏 痰 、 水 样 泡 沫 、 血性 等 。 每 份 标 本 必 须 进 行 涂 片 、 革 兰 氏 染 色 镜 检 ， 评 价 痰 标 本 质 量 。 评 价 痰 标 本 质 量 ： 目 测 ： 黄 色 、 灰 色 、 血 性 、 铁 锈 色 ， 浑 浊 、 稠 厚 ， 呈 现 团 块 状 的 标 本 为 合 格标 本 ； 而 无 色 、 白 色 、 有 黑 色 小 点 ， 清 稀 ， 呈 现 泡 沫 状 ， 有 明 显 食 物 渣 滓 、纸 屑 灰 尘 、 泥 土 的 为 不 合 格 标 本 。 为 什 么 鳞 状 上 皮 细 胞 多 的 标 本 不 合 格 一 般 认 为 ， 来 自 下 呼 吸 道 的 合 格 标 本 应 该 是 含 脓 细 胞 和 支 气 管 柱 状 上 皮 细 胞 较 多 ， 而 受 唾 液 污 染 严 重 的 不 合 格 标 本 则 来 自 颊 粘 膜 的 扁 平 鳞 状 上 皮 细 胞 较多 。 1.下 呼 吸 道 细 菌 学 标 本 的 涂 片 检 查 ： 选 择 标 本 的 脓 性 部 分 或 带 血 部 分 涂 成 均匀 薄 片 ， 做 革 兰 氏 染 色 镜 检 。 低 倍 镜 下 记 录 细 胞 数 ， 痰 涂 片 显 微 镜 检 查 的 分类 如 下 ： 表 1 分 类 每 低 倍 镜 下 细 胞 （ 个 ） WBC 鳞 状 上 皮 细 胞 6类 25 25 25 1025 3类 25 25 2类 1025 25 1类 25 注 :分 类 中 13类 不 做 培 养 ， 要 求 重 新 留 取 标 本 ;4、 5类 为 合 格 标 本 ； 6类 为 气 管 穿 刺 液 时 ， 如 未 见 白 细 胞 ， 而 鳞 状 上 皮 细 胞 10个 /LP时 ， 亦 应 重 新 留 取 标 本 。不 合 格 标 的 痰 标 本 ， 实 验 室 应 立 即 通 知 临 床 重 新 留 痰 送 检 。 在 涂 片 中 如 有 柱 状 上皮 细 胞 不 应 计 数 在 鳞 状 上 皮 细 胞 中 ， 但 应 注 明 其 数 量 ， 作 为 合 格 标 本 对 待 。 合 格 痰 标 本 应 当 记 录 所 见 细 菌 等 病 原 体 情 况 。 记 录 细 菌 时要 求 按 革 兰 氏 阳 性 或 阴 性 、 球 菌 或 杆 菌 等 分 别 记 录 平 均 每油 镜 视 野 中 细 菌 的 大 致 数 量 。 对 于 合 格 标 本 ， 要 记 录WBC内 有 无 吞 噬 的 细 菌 ， 这 样 的 细 胞 占 整 个 WBC总 数 的比 例 ， 细 胞 内 细 菌 的 形 态 等 。 有 文 献 认 为 ， 吞 噬 有 细 菌 的WBC达 到 5%以 上 ， 对 医 院 获 得 性 肺 炎 （ HAP） 、 呼 吸 机相 关 肺 炎 （ VAP） 的 诊 断 有 重 要 意 义 。 2.下 呼 吸 道 标 本 的 细 菌 培 养 ： （ 1） 标 本 培 养 前 处 理 ： 不 含 或 含 黏 液 很 少 的 合 格 标 本 ， 可 直 接 接 种 。 遇 到 含 有 大 量 黏液 的 标 本 ， 应 加 入 等 量 的 sputosol(一 种 商 品 化 的 痰 液 溶 解 剂 ） ， 作 用 20min溶 解 黏 液 ，使 痰 液 均 质 化 后 接 种 。 均 质 化 的 目 的 ： 一 般 情 况 下 病 原 菌 感 染 肺 部 其 部 位 在 下 呼 吸 道 深 部 ， 炎 性 渗 出 物 为 了把 炎 症 局 限 就 将 病 原 菌 包 裹 在 其 中 ， 若 直 接 接 种 于 培 养 基 上 ， 包 裹 物 中 的 细 菌 很 难 突破 包 裹 在 培 养 基 上 生 长 ， 而 痰 的 均 质 化 有 助 于 痰 核 内 部 细 菌 暴 露 ， 以 提 高 阳 性 检 出 率 。 （ 2） 分 离 培 养 ： 将 处 理 后 的 痰 液 接 种 于 血 琼 脂 平 板 、 含 抗 生 素 的 巧 克 力 琼 脂 平 板 、 沙氏 板 、 麦 康 凯 琼 脂 平 板 ， 接 种 后 放 置 在 5%10%CO2孵 育 箱 中 ， 35 培 养 1824h， 并根 据 菌 落 及 形 态 特 点 做 出 初 步 判 断 并 进 行 纯 培 养 或 上 细 菌 自 动 鉴 定 仪 。 如 24h无 细 菌 生长 应 再 放 置 24h， 再 观 察 菌 落 生 长 情 况 ， 如 仍 无 生 长 才 报 告 48小 时 无 致 病 菌 生 长 。 （ 3） 痰 半 定 量 ： 即 用 接 种 环 将 痰 液 在 血 平 板 和 巧 克 力 平 板 上 按 规 定 的 划 线 要 求 作 三 区划 线 方 式 接 种 标 本 进 行 培 养 。 三 区 划 线 方 法 ： 首 先 用 无 菌 棉 签 蘸 取 经 sputosol溶 解 的 痰液 （ 或 将 接 种 环 通 过 火 焰 灭 菌 ， 冷 却 后 挑 取 少 许 标 本 ， 尽 量 挑 取 有 脓 或 血 的 部 位 ） ，然 后 将 其 涂 布 在 平 板 的 第 一 区 ， 并 做 数 次 划 线 ， 再 在 二 、 三 区 依 次 用 接 种 环 划 线 ， 每划 一 区 ， 应 将 接 种 环 烧 灼 一 次 ， 待 冷 却 后 再 划 下 一 区 。 第 一 区 第 二 区 第 三 区 血 平 板 ： 适 用 于 分 离 肺 炎 链 球 菌 和 其 他 细 菌 加 万 古 霉 素 的 巧 克 力 平 板 ： 适 用 于 分 离 流 感 嗜 血 杆 菌 麦 康 凯 琼 脂 平 板 ： 适 用 于 分 离 革 兰 氏 阴 性 杆 菌 检 验 程 序 ： 由 于 检 验 结 果 报 告 的 时 效 性 ， 分 为 初 步 报 告 和 最 终 结 果 报 告 。 痰 及 呼 吸 道 分 泌 物 标 本涂 片 、 染 色 、 镜 检 分 离 培 养 药 敏 试 验 初 步 报 告(一 级 报 告 ） 选 择 培 养 基适 宜 的 培 养 条 件BP、 CA、 MAC、 沙 氏 板 纯 培 养 分 离 鉴 定（ 最 终 报 告 ）上 细 菌 全 自 动 鉴 定 仪一 般 细 菌 培 养 特 殊 细 菌 培 养 初 步 报 告（ 二 级 报 告 ）菌 落 观 察涂 片 、 染 色 、 镜 检 最 终 报 告（ 三 级 报 告 ） 表 2. 上 呼 吸 道 存 在 的 正 常 菌 群正 常 菌 群 正 常 菌 群链 球 菌 棒 状 杆 菌 嗜 血 杆 菌 厌 氧 球 菌微 球 菌 类 杆 菌 凝 固 酶 阴 性 葡 萄 球 菌奈 瑟 菌 梭 杆 菌表 3 上 呼 吸 道 感 染 的 常 见 病 原 体种 类 革 兰 染 色 阳 性 革 兰 染 色 阴 性球 菌 金 葡 、 凝 固 酶 阴 性 葡 、 化 链 、 肺 链 脑 膜 炎 奈 瑟 菌杆 菌 结 核 分 枝 杆 菌 、 白 喉 棒 状 杆 菌 、 厌 氧 菌 肺 克 、 大 肠 埃 希 菌 、 类 杆 菌 、 流 感 嗜 血 杆 麻 风 分 枝 杆 菌 、 炭 疽 芽 孢 杆 菌 菌 、 不 动 杆 菌 、 肠 杆 菌 、 军 团 菌 、 百 日 咳 鲍 特 菌 、 铜 绿 假 单 胞 菌 、 肺 炎 衣 原 体真 菌 及 其 他 假 丝 酵 母 菌 、 放 线 菌 、 梭 状 杆 菌 、 奋 森 螺 旋 体 表 4 下 呼 吸 道 感 染 常 见 病 原 菌种 类 革 兰 染 色 阳 性 革 兰 染 色 阴 性球 菌 金 葡 、 凝 固 酶 阴 性 葡 、 肺 链 、 A群 链 、 肠 球 菌 卡 他 球 菌 、 脑 膜 炎 奈 瑟 菌 、 黄 色 球 菌杆 菌 白 喉 棒 状 杆 菌 、 类 白 喉 棒 状 杆 菌 、 结 核 分 枝 杆 肺 克 、 流 感 嗜 血 杆 菌 、 铜 绿 假 单 胞 菌 、 菌 、 炭 疽 芽 孢 杆 菌 大 肠 埃 希 菌 、 百 日 咳 杆 菌 、 军 团 菌 、 支 原 体真 菌 白 假 丝 酵 母 菌 、 曲 霉 菌 、 毛 霉 菌 合 理 区 分 致 病 菌 痰 及 下 呼 吸 道 分 泌 物 标 本 易 受 到 上 呼 吸 道 正 常 菌 群 的 污 染 ， 细 菌 室 通 常 可 以从 送 检 的 呼 吸 道 标 本 中 分 离 出 多 种 细 菌 ， 但 分 离 细 菌 是 否 能 真 正 代 表 下 呼 吸道 感 染 的 病 原 菌 ， 这 对 临 床 诊 断 与 治 疗 感 染 性 疾 病 至 关 重 要 。 细 菌 室 人 员 在检 验 过 程 中 应 重 视 判 断 所 分 离 的 细 菌 是 污 染 的 上 呼 吸 道 正 常 菌 群 还 是 引 起 下呼 吸 道 感 染 的 病 原 菌 。 对 策 ： 当 在 同 一 培 养 基 上 分 离 出 多 种 病 原 菌 （ 复 合 菌 ） 时 ， 应 主 动 与 临 床 医生 联 系 ， 结 合 患 者 的 临 床 症 状 、 痰 涂 片 染 色 镜 检 及 近 期 细 菌 培 养 结 果 （ 如 近期 同 一 患 者 多 次 分 离 出 同 一 种 菌 ） 等 综 合 判 断 所 分 离 的 多 种 细 菌 中 那 一 种 菌可 能 是 优 势 病 原 菌 。 当 分 离 的 优 势 菌 与 涂 片 染 色 镜 检 结 果 相 符 时 ， 优 势 菌 必须 进 行 药 敏 试 验 。 及 时 报 告 临 床 医 生 ， 合 理 应 用 抗 生 素 。 若 分 离 培 养 结 果 与涂 片 染 色 镜 检 结 果 不 相 符 时 ， 应 在 报 告 中 提 示 ： 此 结 果 请 结 合 临 床 和 涂 片 所见 进 行 分 析 。 表 5 痰 标 本 细 菌 培 养 半 定 量 培 养 结 果 判 定 标 准 及 临 床 意 义 级 别 划 线 区 菌 落 数 目 相 当 菌 落 数 临 床 意 义 第 一 区 第 二 区 第 三 区 （ cfu/ml） 1+(极 少 量 ） 10 10 5 10 5 5 107 多 为 感 染 病 原 菌重 复 培 养 的 标 本 也 必 须 是 合 格 标 本 。 列 举 一 些 常 见 致 病 菌 菌 落 形 态 痰 液 ： BP： 血 平 板 ； CA： （ 加 入 万 古 霉 素 的 巧 克 力 平 板 ） ； MAC： 麦 康 凯 琼 脂 平 板 G+菌 ： BP生 长 、 CA（ ） Gram染 色 ： 分 G+c ,G+ b G+c依 靠 溶 血 特 征 ， 菌 落 形 态 、 菌 落 颜 色 、 菌 体 形 态 区 分 : 葡 萄 球 菌 ： 淡 黄 色 /白 色 /柠 檬 色 ， 中 等 大 小 ， 光 滑 、 不 透 明 、 较 凸 ， 规 则 圆 形 ， /溶 血 ， 较 湿 润 微 球 菌 ： 黄 色 /白 色 ， 中 等 大 小 ， 较 凸 ， 规 则 圆 形 ， 不 溶 血 ， 较 干 燥 ， 不 易 乳 化 链 球 菌 ： 白 色 、 凸 起 小 菌 落 ， 溶 血 为 溶 血 型 链 球 菌 ； 灰 白 隆 起 中 心 扁 平 或 凹 陷 ， 1.0-1.5mm大 小的 宽 大 溶 血 为 肺 炎 链 球 菌 ； 细 如 针 尖 ， 白 色 凸 起 ； 溶 血 的 为 草 绿 色 链 球 菌 肠 球 菌 ： 灰 白 ， 低 凸 ， 2.0mm左 右 之 溶 血 菌 落 ， 较 湿 润 费 克 蓝 母 菌 ： 灰 白 凸 起 小 菌 落 ， 0.5mm左 右 大 小 ， /溶 血 ， 湿 润 易 乳 化口 腔 球 菌 ： 白 色 凸 起 较 大 菌 落 ， 不 溶 血 ， 黏 着 ， 接 种 针 挑 之 则 整 个 菌 落 挑 起 ， 琼 脂 上 不 留 痕 迹 G+ b依 靠 溶 血 特 征 ， 菌 落 形 态 、 菌 落 大 小 、 菌 体 形 态 区 分 ： 棒 状 杆 菌 ： 白 色 1.0-1.5mm左 右 大 小 ， 较 干 燥 ， 不 溶 血 /狭 窄 溶 血 的 为 白 喉 或 一 般 棒 状 杆 菌 ； 小 而 湿 润 ， 灰 白 /无 色 ， 半 透 明 的 为 J-K棒 状 杆 菌 ； 灰 白 细 小 ， 溶 血 的 可 能 为 假 结 核 、 化 脓 放 线 菌 、 溶血 分 泌 杆 菌 ； 芽 孢 杆 菌 ： 灰 白 大 菌 落 ， 表 面 粗 糙 如 毛 玻 璃 状 ， 宽 大 溶 血 列 举 一 些 常 见 致 病 菌 菌 落 形 态 G-菌 ： BP生 长 、 CA生 长 、 MAC生 长 ， Gram染 色 ： G- b氧 化 酶 肠 杆 菌 ： 氧 化 酶 （ ） ， BP上 圆 形 、 大 而 湿 润 、 灰 白 色 、 黏 液 样 、 不 溶 血 菌 落 ； MAC上 粉 红 色或 红 色 。 大 肠 埃 希 菌 :Mac上 粉 红 色 或 红 色 ， 在 BP上 有 些 菌 株 可 产 生 溶 血 。 肺 克 ： Mac上 红 色 黏 稠 状 ， 菌 落 中 央 有 气 泡 。 血 琼 脂 上 灰 白 色 、 大 而 粘 、 光 亮 且 易 形 成 粘 丝 的 菌 落 。 非 发 酵 菌 ： 一 般 氧 化 酶 （ +） ， 嗜 麦 芽 窄 食 单 胞 菌 、 不 动 杆 菌 氧 化 酶 （ -） ； 铜 绿 假 单 胞 菌 ： BP上 扁 平 、 湿 润 、 有 金 属 光 泽 ， 特 殊 生 姜 味 的 绿 色 或 蓝 绿 色 菌 落 ， 溶 血 嗜 麦 芽 窄 食 单 胞 菌 ： BP上 中 等 大 小 、 圆 形 、 光 滑 、 湿 润 、 产 生 不 溶 血 的 黄 色 色 素 。 氧 化 酶 （ -） 不 动 杆 菌 ： 球 杆 状 与 G-c不 好 区 分 ， BP上 菌 落 圆 形 、 光 滑 、 灰 白 色 、 边 缘 整 齐 ； 溶 血 不 动 杆 菌 呈 溶 血 。 氧 化 酶 （ -） 触 酶 （ +） NIT（ -） BP（ -） /细 小 、 CA生 长 ， Gram染 色 ： G-b、 菌 体 细 小 或 呈 扭 曲 之 长 丝 状 G-苛 养 菌 流 感 嗜 血 杆 菌 ： CA上 12mm大 小 菌 落 ， 圆 形 、 湿 润 、 光 滑 、 透 明 或 半 透 明 （ 露 滴样 ） 、 无 色 至 灰 白 色 菌 落 多 为 流 感 嗜 血 杆 菌 ； 灰 色 略 黄 ， 不 透 明 ， 1.0-1.5mm的 多 为 副 流 感 嗜 血 杆菌 BP（ ） 、 CA（ ） 、 BCYE生 长 /或 在 含 有 L-半 胱 氨 酸 、 铁 离 子 、 复 合 抗 生 素 选 择 剂 的 强 化 血 琼脂 上 生 长 Gram染 色 ： G-b、 菌 体 细 、 长 丝 状 、 生 长 缓 慢 。 军 团 菌 ： 小 菌 落 ， 灰 色 ， 较 粘 氧 化 酶 （ -） 或 （ ） 触 酶 （ +） BP生 长 、 CA生 长 ， Gram染 色 ： G-c氧 化 酶 （ +） 、 触 酶 （ +） 奈 瑟 菌 ： 白 色 /黄 色 中 等 大 小 菌 落 ， 脑 膜 炎 奈 瑟 菌 ： 直 径 12mm， 灰 褐 色 、 光 滑 、 半 透 明 、 稍 扁 菌 落 。 卡 他 莫 拉 菌 ： 白 色 小 菌 落 直 径 13mm（ 24h内 ） ， 菌 落 有 脆 性 ， 用 接 种 环 推 之 可 在 培 养 基 表 面 移 动 列 举 一 些 常 见 致 病 菌 菌 落 形 态 真 菌 及 奴 卡 菌 ： BP、 CA、 沙 氏 板 均 生 长 Gram染 色 G+， 蓝 黑 色 。 真 菌 ： 中 等 大 小 、 湿 润 、 黄 白 色 乳 酪 样 或 浆 糊 样 ， 生 长 快 ， 具 有 显 著 酵母 样 气 味 的 菌 落 ， 多 数 可 在 显 色 培 养 基 上 显 色 ： 绿 色 、 翠 绿 色 为 白 色 假 丝 酵 母 菌 ； 蓝 灰 色 、 铁 灰 色 为 热 带 假 丝 酵 母 菌 ； 紫 红色 边 缘 模 糊 有 微 毛 为 克 柔 假 丝 酵 母 菌 ； 整 个 菌 落 湿 润 且 紫 红 色 为 光 滑 球 拟 假丝 酵 母 菌 ； 白 色 为 无 法 鉴 定 的 其 他 假 丝 酵 母 菌 。 奴 卡 菌 ： 小 菌 落 ， 生 长 慢 ， 菌 落 皱 褶 ， 呈 颗 粒 状 ， 有 时 产 生 褐 色 、 黄 色 、黑 色 等 色 素 ； 需 氧 性 放 线 菌 。 肺 炎 支 原 体 ： 固 体 培 养 基 上 ， 低 倍 镜 或 解 剖 显 微 镜 下 为 典 型 “ 荷 包 蛋 ” 样菌 落 ， 在 Hayflick双 相 培 养 基 的 液 体 中 使 培 养 基 变 黄 。 3.肺 组 织 标 本 的 微 生 物 学 检 验 介 入 操 作 获 得 的 肺 组 织 标 本 很 珍 贵 ， 细 菌 室 应 当 对 其 进 行大 撒 网 式 检 验 ， 即 同 时 进 行 细 菌 、 真 菌 、 分 枝 杆 菌 的 涂 片和 培 养 。 穿 刺 获 得 的 肺 组 织 常 常 很 少 ， 要 提 高 检 验 的 阳 性率 ， 首 先 应 当 对 组 织 标 本 进 行 研 磨 。 对 于 标 本 量 少 的 组 织 ，建 议 用 小 号 的 研 磨 器 。 最 好 涂 片 3张 ， 如 标 本 量 少 ， 也 要至 少 涂 片 一 张 。 研 磨 的 标 本 可 以 接 种 于 自 动 化 加 有 抗 生 素中 和 剂 的 需 氧 或 厌 氧 血 培 养 瓶 上 机 培 养 。 每 日 观 察 平 板 生 长 情 况 或 仪 器 中 的 生 长 曲 线 。 4.重 视 直 接 涂 片 直 接 涂 片 镜 检 的 优 势 在 于 ： （ 1） 简 单 快 速 ， 通 常 24h可 以 报 告 结 果 。 而 普 通 细 菌 培 养 鉴 定 的 时 间 至 少23d， 真 菌 和 分 支 杆 菌 的 时 间 更 长 。 因 此 直 接 涂 片 可 以 快 速 指 导 临 床 选 药 。（ 2） 对 于 某 些 难 生 长 的 细 菌 ， 直 接 涂 片 可 能 是 唯 一 的 诊 断 手 段 。 如 肺 毛 霉 菌病 ， 因 为 毛 霉 菌 不 易 培 养 ， 阳 性 率 不 高 。 卡 氏 肺 孢 子 菌 无 法 体 外 培 养 ， 诊 断只 能 靠 直 接 涂 片 或 PCR技 术 。 （ 3） 直 接 涂 片 可 以 为 组 织 培 养 提 供 方 向 。 肺 组 织 标 本 常 常 很 少 ， 简 单 的 涂片 可 以 让 我 们 把 握 培 养 的 重 心 。 （ 4） 呼 吸 道 标 本 ， 如 痰 标 本 ， 杂 菌 相 对 较 多 ， 特 别 是 一 些 生 长 快 的 细 菌 会掩 盖 慢 生 长 的 细 菌 导 致 培 养 阴 性 ， 但 涂 片 可 以 发 现 这 些 慢 生 长 的 细 菌 。 如 某 肺 部 空 洞 患 者 的 黄 脓 痰 标 本 革 兰 氏 染 色 发 现 ： WBC25/LP,EP10/LP， 油 镜 下 发 现 较 多 的 假 菌 丝 和 孢 子 ， 以 及 一 些 着 色 不 均 的 革 兰 氏 阳 性 丝 状 菌（ 可 疑 奴 卡 菌 ） 。 24h培 养 发 现 白 色 念 珠 菌 遍 布 整 个 平 板 。 此 患 者 口 服200mg氟 康 唑 后 ， 再 次 进 行 培 养 ， 平 板 放 置 48h培 养 出 奴 卡 菌 。 未 来 的 方 向 快 速 检 测 和 分 子 检 测 技 术 为 提 高 肺 部 感 染 诊 断 的 阳 性 率 ， 目 前 许 多快 速 检 测 技 术 如 军 团 菌 抗 原 检 测 、 肺 炎 链球 菌 抗 原 检 测 、 曲 霉 菌 半 乳 甘 露 聚 糖 试 验 、隐 球 菌 抗 原 检 测 等 已 在 临 床 开 展 和 应 用 。以 多 重 PCR为 基 础 的 分 子 检 测 技 术 可 以 检测 10多 种 呼 吸 道 病 原 菌 ， 包 括 病 毒 和 非 典型 分 枝 杆 菌 ， 随 着 这 些 分 子 技 术 的 标 准 化 ，未 来 也 会 在 临 床 得 到 应 用 。