细胞固定、染色原理与方法

细胞固定、染色原理与方法 一、固定与固定液(一)固定：将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使 细胞保持原有形态、结构的一种手段。1. 目的(1) 迅速防止细胞死亡后的变化,防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构。(2) 使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态。(3) 使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定。(4) 使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。(5) 防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。2. 时期(1) 有丝分裂：有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，根尖取材容 易，操作和鉴定方便。(2) 减数分裂：选取适当大小的花蕾是观察花粉母细胞减数分裂的关键性的第一步。此时的 植株形态及花蕾大小依植物的类别及品种有所不同。小麦：在植株开始挑旗，旗叶与下一叶的叶耳间距为3-4cm,花药长度大致在l-2mm左右， 黄绿色时取材最好。如花药为绿色时则为时过早，花药为黄色，则已过时。一般上午 8-10 点为取材最佳时间。玉米：一般夏玉米在7月份取材，以上午7-8点为好。在玉米雌穗未抽出前的7-10天手摸 植株上部(喇叭口下部)有松软感觉，表明雄花序即将抽出。用刀在顶叶近喇叭口处纵向划一 刀，切口长10-15cm，剥出雄花序，顶端花药长3-5mm，花药尚未变黄时取材。蚕豆：从现蕾开始，上午 10-11 点可选取 2-3mm 大小的花蕾或一小段花序。蚕豆开花的次 序是由下而上，由外而内。3. 固定时的注意事项(1) 固定液量： 20 倍于材料的体积，以免固定液被稀释。(2) 选择合适的固定液：渗透力强的固定液既可以迅速进入组织中，又不使组织过度收缩或 膨胀。(3) 固定的时间要合适： 与材料的大小和温度有关：材料大则时间长，材料小则时间短；温度高则时间短，温度低则 时间长。经固定的材料如不及时使用，可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时，再换入一次70% 酒精，在0-4r冰箱内可保存半年。经过较长时间保存的材料进行观察前可以换新的固定液 再处理一次，效果较好。(二)固定液 固定液包括简单固定液和混合固定液两种。简单固定液就是用一种药品作为固 定液，如乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞等。简单固定液只对细胞的某种成分固定效果较好，而 不能将所有的成分都保存下来。混合固定液是指两种或两种以上的化学物质的混合液，如卡 诺氏固定液等。1. 固定液的条件(1) 迅速渗入组织,杀死原生质。在杀死的短时期中,细胞形态不致有所变化。(2) 必须具有渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。(3) 尽可能避免使组织膨胀或收缩。(4) 使细胞内的成分凝固或沉淀。(5) 增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。(6) 增加媒染作用和染色能力。(7) 使组织变硬，具有一定的硬度。(8) 固定以后能起到保存的作用。(9) 在凝固原生质以后，增加细胞对于各种穿透的抵抗力，不致于因以后的处理而使固定的 原生质变形。2. 常用的几种固定液(1) 酒精：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固 定效果较差(亲和力小且易自溶)。酒精固定的特点是杀死快，渗透力强，对组织收缩较大(可 收缩 20%左右)，可使材料变硬。酒精常用于混合固定液中，但由于它本身是一种还原剂， 很容易氧化成乙醛，甚至氧化成醋酸，因此最好不与三氧化铬、重铬酸钾及锇酸等氧化剂配 合使用。但与甲醛、醋酸或丙酸配合，用作固定效果很好。酒精能溶解脂肪及凝脂，故不宜 用来固定脂类材料。(2) 甲醛水溶液：甲醛在水中的溶解度为 37-40%，渗透力强，固定均匀，对组织收缩作用小， 一般用于固定大材料。市售溶液中含量下降，因形成三聚甲醛而失效。(3) 冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又称为冰醋酸。常用 0.3-0.5%的浓度作 为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。AF液：90ml乙醇10ml甲醛用于固定大块组织。 (5)卡诺氏固定液： 冰醋酸:氯仿:无水乙醇=1:3:6 改良卡诺氏固定液: 冰醋酸:无水乙醇=1:3二、染色与染色原理 根据染料的来源不同可分为天然染料(苏木精、洋红等)和人工合成染料(煤焦油染料，如碱 性品红等)。1. 苯与苯的取代物苯 醌( 红色) 苯酚 三硝基苯2. 染料的分子结构 呈酸或碱性，溶于水，可电离，可与材料结合。4. 染色原理(1) 化学作用 碱性染料染细胞核；酸性染料染细胞质。(2) 物理作用 染料通过毛细作用或渗透作用进入组织内部；组织吸附染料；染料进入细胞， 由于吸收作用而留在细胞内部。三、常用染料1. 染细胞核(1) 苏木精 苏木用乙醚连续提取即可得到苏木精。苏木精为黄棕色结晶，溶于酒精、甘油， 可氧化生成苏木红。常用于永久切片的制作，亲水力弱，不可单独使用。(2) 卡红(洋红、胭脂红) 取自雌胭脂虫，方法是将晒干后的成虫磨碎提炼出胭脂虫红，然后 用明矾去杂质。卡红是一种复杂的化合物，起作用的是卡红酸。卡红在中性溶液里溶解度很 小，所以要用酸性或碱性溶液溶解。醋酸洋红： 45%醋酸 100ml 与 1-2g 卡红混合，煮沸，充分溶解，凉后过滤。 1-2 个月后加 媒染剂铁即可使用。主要染细胞核，若时间太长，细胞质也被染红。(3) 碱性品红 染细胞核的特异染料。2染细胞质伊红Y、刚果红、苦味酸、酸性品红(品红磺基)四、洋葱根尖有丝分裂的观察流程：固定好的根尖T水洗2-3次TIN HCl7-8minT水洗2-3次T取材(1/2分生区)9切碎T染 色6-7minT加盖玻片T轻敲T压片T观察。1材料准备：将洋葱放在加满水的广口瓶上，使其根茎部接触水面，然后转移到25-28C的 条件下培养。待根尖长到2cm左右使，在上午9-10点剪取根尖备用。2. 预处理：为了有利于对有丝分裂过程中染色体的观察和计数，在固定前应对根尖进行预处 理，这样可以改变细胞质的粘度，破坏和抑制纺锤体的形成，使染色体适度缩短和分散。预 处理的方法有低温预处理和药物预处理。低温预处理将材料浸在蒸馏水中，放在1-4C冰箱内离体处理24h。此法效果很好，对染 色体无破坏作用，染色体缩短均匀，简便易行，各种作物都适用。(2)药物预处理 0.05-0.2%秋水仙素溶液与室温下处理2-4h,对抑制纺锤体活动效果明显，易获得较多的 中期分裂相，且染色体收缩较直，有利于染色体结构的研究。 饱和对二氯苯溶液室温下处理3-5h，对阻止纺锤体活动和缩短染色体效果也较好，但对 染色体小而多的植物来说个利于染色体的计数。 0.002-0.00mol/L8-羟基喹啉18C条件下处理5-6h，可以引起细胞粘度的改变，导致纺锤体 活动受阻，使中期染色体在赤道面上保持相应的排列位置。缢痕区也较为清晰。一般认为对 中等或长染色体的植物较合适。 70ppm放线菌酮和250ppm8-羟基喹啉的混合液于25C条件下，根尖不离体处理5h,可 获得大量的分裂相，是最值得首选的预处理方法。3. 固定：:预处理后的根尖用蒸馏水冲洗 2-3 次，然后移入 Carnoys 固定液中，室温下固定 2-24h后，用70%酒精冲洗2次转入70%酒精中于4C冰箱中保存，最好不要超过2个月。 如经过较长时间保存的材料，在使用前可以用固定液在处理一次。4. 解离：解离有酸解和酶解两种方法，可以使分生区组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化 或部分分解，使细胞和染色体容易压平。酸解一般用1N HCl在60C水浴中处理7-8min即可。5. 压片和染色：取处理好的根尖置于载玻片上，用吸水纸吸去多余的液体，用刀片将根尖的 分生组织切下并切碎，加1-2滴改良苯酚品红染液，6-7min后加盖玻片。用铅笔的橡皮头或 小镊子的柄端轻敲盖玻片，使材料均匀分散，然后压片。压片时用力要适当，不要移动盖玻 片。6. 镜检：低倍镜下找到分生区细胞，其特点为等直径细胞。细胞质浓厚，细胞核较大，占细 胞体积的 3/4。可以观察到有丝分裂过程中不同分裂时期的染色体。选取不同分裂时期的典 型细胞，换高倍镜观察，注意细胞核染色体及纺锤体的变化动态。注意事项： (1)取材：取分生区，尽量要小；(2)解离要软，水洗要彻底，否则不易着色；(3)压片前先敲， 可使细胞分散开；(4)防止出气泡。