《生化实验技术》综合设计性大实验.ppt

生化实验技术综合设计性大实验 l 课 堂 理 论 学 习 ： 辅 导 相 关 生 化 大 分 子 提 取 分 离纯 化 基 本 知 识l 项 目 发 布 ： 了 解 项 目 内 容l 网 上 预 约 ： 理 论 自 学 设 计 实 验 方 案 网上 递 交 教 师 修 改 及 审 核 实 验 室 项 目 实施 论 文 上 交 教 师 批 阅 评 分l 实 验 分 组 ： 各 自 组 合 ， 最 多 不 超 过 4人 /组 ， 推选 组 长 ， 负 责 平 时 讨 论 、 项 目 方 案 设 计 及 材 料收 集 l 实 验 实 施 要 求 ： 平 时 按 各 组 计 划 时 间 分别 进 行 实 验 ， 组 长 有 义 务 指 导 下 组 相 关实 验 内 容 ， 每 次 实 验 必 须 登 记 。l 全 班 交 流 ： 实 验 结 束 安 排 课 堂 讨 论 交 流 ，每 组 准 备 一 人 汇 报 ， 一 人 记 录 ； 要 求 用PPT总 结 汇 报 项 目 实 施 、 实 验 创 新 、 疑 难点 ， 其 他 组 学 生 质 疑 ， 教 师 点 评 。l 指 导 教 师 ： 汪 财 生 、 斯 越 秀 l 通 过 综 合 训 练 ， 能 够 系 统 掌 握 蛋 白 质 、DNA制 备 的 基 本 原 理 和 操 作 ， 学 习 如 何进 行 实 验 设 计 ， 掌 握 实 验 过 程 中 的 关 键环 节 ， 对 实 验 中 出 现 的 问 题 进 行 科 学 的分 析 ； 在 学 习 实 验 技 术 的 同 时 ， 自 觉 培养 分 析 问 题 和 解 决 问 题 能 力 。实 验 项 目 训 练 目 标 思 考 题 （ 课 前 设 疑 ）1.如 何 保 持 生 化 物 质 的 生 物 活 性 ？ 一 般 生 化 物质 在 碱 性 条 件 下 容 易 变 性 ， 还 是 在 酸 性 条 件下 容 易 变 性 ？2.一 般 从 天 然 生 物 材 料 制 作 生 化 物 质 的 过 程 大体 可 分 为 几 个 阶 段 ？3.在 制 备 生 化 物 质 前 应 如 何 选 择 原 料 ？ 4.什 么 叫 动 态 吸 附 和 静 态 吸 附 ？ 它 们 在 应 用上 有 何 区 别 ？5.对 酸 性 物 质 的 提 取 ， 常 在 什 么 条 件 下 进 行 ？对 碱 性 物 质 的 提 取 ， 常 在 什 么 条 件 下 进 行 ？对 两 性 物 质 的 提 取 ， 常 在 什 么 条 件 下 进 行 ？6.以 血 清 球 蛋 白 为 例 解 释 提 取 制 备 每 步 骤 的基 本 原 理 ？ 7.干 燥 离 子 交 换 剂 应 如 何 进 行 处 理 ？ 何 谓离 子 交 换 剂 转 型 ？8.动 植 物 总 DNA或 RNA提 取 的 方 法 主 要 有 哪些 ？ 以 猪 脾 脏 DNA提 取 为 例 试 述 每 步 骤 主要 原 理 是 什 么 ？ 如 何 判 断 所 提 取 DNA的 纯度 ？9.蛋 白 质 浓 度 测 定 方 法 有 哪 些 ？ 如 何 鉴 定所 提 取 蛋 白 的 纯 度 ？ 未 知 蛋 白 质 分 子 量测 定 方 法 有 哪 些 ？ l11-14周 生 物 技 术 072-073班 实 验l14-16周 生 物 技 术 071班 实 验l15周 生 物 技 术 072-073班 上 交 论 文 及 讨 论 材 料 等l17周 生 物 技 术 071班 上 交 论 文 及 讨 论 材 料 等 生 化 物 质 的 制 备 分 析 一 般 从 天 然 生 物 材 料 制 作 生 化 物 质的 过 程 大 体 可 分 为 六 个 阶 段 ： 1.原 料 的 选 择 和 预 处 理 2.原 料 的 粉 碎 ；3.提 取 ， 即 从 原 料 中 经 溶 剂 分 离 有 效 成 分 ， 制 成 粗 品 的 工 艺 过 程 ；4.纯 化 ， 即 粗 制 品 经 盐 析 、 有 机 溶 剂 沉 淀 、 吸 附 、 层 析 、 透 析 、 超 离 心 、 膜 分 离 、 结 晶 等 步 骤 进 行 精 制 的 工 艺 过 程 ； 利 用 生 化 制 备 技 术 从 生 物 材 料 中 获 得特 殊 的 生 物 活 性 物 质 ， 如 蛋 白 质 、 酶 、激 素 、 核 酸 等 生 化 产 品 时 ， 通 常 要 注 意以 下 几 个 问 题 ： 6.成 品 及 制 剂 ， 即 半 成 品 或 原 料 药 经 精 细 加工 制 成 片 剂 、 口 服 液 、 针 剂 、 冻 干 剂 等 供 饮用 或 临 床 应 用 的 各 种 剂 型 。5.干 燥 及 保 存 ； 1 生 物 材 料 的 组 成 成 分 非 常 复 杂 ，有 数 百 种 甚 至 更 多 ， 各 种 化 合 物 的 形状 、 大 小 、 相 对 分 子 质 量 和 理 化 性 质都 各 不 相 同 ， 有 的 迄 今 还 是 未 知 物 ，而 且 这 些 化 合 物 在 分 离 时 仍 在 不 断 的代 谢 变 化 中 。 2 在 生 物 材 料 中 ， 有 些 化 合 物 含 量 很 低或 极 微 ， 有 的 只 有 1 l0 000， 甚 至 更 少 。 制备 时 ， 原 材 料 用 量 很 大 ， 得 到 产 品 很 少 ， 与投 料 量 相 比 “ 虎 头 蛇 尾 ” 。 近 年 来 ， 用 所 谓“ 钓 鱼 法 ” ， 利 用 某 些 分 子 特 有 的 专 一 亲 和力 ， 将 某 一 化 合 物 从 极 复 杂 的 体 系 中 “ 钓 ”出 来 ， 与 其 他 化 学 分 离 技 术 相 比 具 有 很 大 的优 越 性 。 3 许 多 生 物 活 性 物 质 ， 一 旦 离 开 了 生 物体 内 环 境 ， 很 易 变 性 及 被 破 坏 ， 应 十 分 注 意 保护 这 些 化 合 物 生 物 的 活 性 ， 常 选 择 十 分 温 和 的条 件 ， 尽 可 能 在 较 低 温 度 和 洁 净 环 境 中 进 行 。一 般 来 说 制 备 的 操 作 时 间 长 、 手 续 较 繁 琐 。 因为 许 多 大 分 子 在 分 离 过 程 中 ， 过 酸 、 过 碱 、 重金 属 离 子 、 高 温 、 剧 烈 的 机 械 作 用 、 强 烈 的 辐射 和 机 体 内 自 身 酶 的 作 用 ， 均 可 破 坏 这 些 分 子的 结 构 或 生 理 活 性 。 4 生 化 分 离 制 备 过 程 几 乎 都 在 溶 液 中 进行 ， 各 种 温 度 、 pH、 离 子 强 度 等 参 数 ， 对 溶液 中 各 种 组 成 的 综 合 影 响 ， 常 常 无 法 固 定 ，有 些 实 验 或 工 艺 的 设 计 理 论 性 不 强 ， 常 带 有很 大 的 经 验 成 分 。 因 此 ， 要 建 立 重 复 性 好 的成 熟 工 艺 ， 对 生 物 材 料 、 各 种 试 剂 及 其 辅 助材 料 等 都 要 严 格 地 加 以 规 定 。 5 生 化 制 备 方 法 最 后 均 一 性 的 证 明与 化 学 上 纯 度 的 概 念 并 不 完 全 相 同 ， 这是 由 于 生 物 分 子 对 环 境 反 应 十 分 敏 感 ，结 构 与 功 能 的 关 系 比 较 复 杂 ， 评 定 其 均一 性 时 ， 要 通 过 不 同 角 度 测 定 ， 才 能 得出 相 对 “ 均 一 性 ” 结 论 ， 只 凭 一 种 方 法所 得 纯 度 的 结 论 ， 往 往 是 片 面 的 ， 甚 至是 错 误 的 。 原 料 选 择 和 预 处 理 选 什 么 样 的 原 材 料 应 视 生 产 目 的 而 定 。一 般 要 注 意 以 下 几 个 方 面 : 1 要 选 择 有 效 成 分 含 量 高 的 新 鲜 材 料 ； 2 来 源 丰 富 易 得 ； 3 制 造 工 艺 简 单 易 行 ； 4 成 本 比 较 低 ； 5 经 济 效 果 要 好 。 如 蛋 白 质 原 料 的 选 择 蛋 白 质 类 生 化 产 品 的 原 料 来 源 有 动 植物 组 织 和 微 生 物 等 ， 原 则 是 要 选 择 富 含 所需 蛋 白 质 多 肽 成 分 的 、 易 于 获 得 和 易 于 提取 的 无 害 生 物 材 料 。 对 天 然 蛋 白 质 生 化 产 品 ， 为 提 高 其 质量 、 产 量 和 降 低 生 产 成 本 ， 对 原 料 的 种 属 、发 育 阶 段 、 生 物 状 态 、 来 源 、 解 剖 部 位 、生 物 技 术 产 品 的 宿 主 菌 或 细 胞 都 有 一 定 的要 求 ， 了 解 这 些 ， 可 使 分 离 纯 化 工 作 事 半功 倍 ， 反 之 则 收 效 甚 微 。 1 种 属 牛 胰 含 胰 岛 素 （ insulin)单 位 比 猪胰 高 ， 牛 为 4000 IU kg胰 脏 ， 猪 为3000 IU kg胰 脏 。 抗 原 性 则 猪 胰 岛 素比 牛 胰 岛 素 低 ， 前 者 与 人 胰 岛 素 相 比 ，只 有 1个 氨 基 酸 的 差 异 ， 而 牛 有 3个 氨 基酸 的 差 异 。 2 发 育 生 长 阶 段 幼 年 动 物 的 胸 腺 比 较 发 达 ， 老 龄后 逐 渐 萎 缩 ， 因 此 胸 腺 原 料 必 须 采 自幼 龄 动 物 。 3 生 物 状 态 动 物 饱 食 后 宰 杀 ， 胰 脏 中 的 胰 岛素 含 量 增 加 ， 对 提 取 胰 岛 素 有 利 ， 但胆 囊 收 缩 素 的 分 泌 使 胆 汁 排 空 ， 对 胆汁 的 收 集 不 利 。 严 重 再 生 障 碍 性 贫 血症 患 者 尿 中 的 EPO（ erythropoietin,红 细 胞 生 成 素 ） 含 量 增 加 。 4 原 料 来 源 血 管 舒 缓 素 可 分 别 从 猪 胰 脏 和 猪颚 下 腺 中 提 取 ， 两 者 生 物 学 功 能 并 无二 致 ， 而 稳 定 性 以 颚 下 腺 来 源 为 好 ，因 其 不 含 蛋 白 水 解 酶 。 5 原 料 解 剖 学 部 位 猪 胰 脏 中 ， 胰 尾 部 分 含 激 素 较 多 ， 而 胰头 部 分 含 消 化 酶 较 多 。 如 分 别 摘 取 则 可 提 高各 产 品 的 收 率 。 胃 膜 素 以 采 取 全 胃 粘 膜 为 好 ， 胃 蛋 白 酶则 以 采 取 胃 底 部 粘 膜 为 好 ， 因 胃 底 部 粘 膜 富含 消 化 酶 。 6.从 简 化 提 纯 步 骤 着 手 如 从 鸽 肝 中 提 取 乙 酰 化 酶 ， 需 将动 物 饥 饿 后 取 材 ， 可 减 少 肝 糖 原 ， 以简 化 纯 化 步 骤 。 7 对 生 物 技 术 产 品 宿 主 菌 或 细 胞 的 要 求 选 择 生 物 技 术 产 品 的 宿 主 受 体 菌 或 细胞 也 应 考 虑 到 后 处 理 的 问 题 。 如 用 大 肠 杆菌 表 达 ， 由 于 其 不 能 将 所 表 达 的 蛋 白 质 分泌 到 体 外 ， 故 提 取 时 必 须 破 壁 ， 增 加 了 提取 的 困 难 ， 而 且 还 可 能 含 有 毒 素 类 有 害 因子 ； 用 肿 瘤 细 胞 作 宿 主 细 胞 制 成 的 生 化 产品 还 应 考 虑 到 其 安 全 性 ， 制 造 体 外 诊 断 用试 剂 则 是 很 好 的 高 产 方 法 。用 枯 草 杆 菌 或 酵 母 菌 作 宿 主 菌 ， 虽 可 解 决 这一 矛 盾 ， 但 表 达 的 蛋 白 质 成 分 仍 有 缺 乏 糖 基化 等 翻 译 及 修 饰 的 缺 陷 ； 用 动 物 细 胞 和 昆 虫细 胞 表 达 则 能 比 较 好 地 解 决 后 处 理 及 完 整 表达 的 问 题 。 原 料 的 粉 碎 在 提 取 前 先 将 大 块 的 原 料 粉 碎 或 绞 碎成 适 用 的 粒 度 ， 或 将 细 胞 破 碎 ， 使 胞 内 生物 活 性 物 质 充 分 释 放 到 溶 液 中 ， 有 利 于 提取 或 吸 附 。 不 同 的 生 物 体 或 同 一 生 物 体 不 同 的 组织 ， 其 破 碎 的 难 易 不 一 样 ， 使 用 的 方 法也 不 完 全 相 同 。 动 物 的 脏 器 组 织 ， 常 用绞 肉 机 机 械 法 粉 碎 ； 植 物 肉 质 组 织 可 以磨 碎 ； 许 多 微 生 物 均 具 有 坚 韧 的 细 胞 壁 ，常 用 自 溶 、 冷 热 交 替 、 加 砂 研 磨 、 超 声波 、 加 压 处 理 等 破 碎 方 法 。 如 果 提 取 的 有 效 成 分 是 体 液 或 细 菌 胞外 某 些 多 肽 激 素 、 酶 等 ， 则 不 需 要 破 碎细 胞 。 主 要 通 过 机 械 力 的 作 用 ， 使 组 织 粉碎 。 粉 碎 少 量 原 料 时 ， 可 使 用 高 速 组 织捣 碎 机 （ 10 000r min） 、 匀 浆 器 、 研钵 、 研 船 等 。 工 业 生 产 上 一 般 常 用 的 粉碎 设 备 有 电 磨 机 、 球 磨 机 、 万 能 粉 碎 机 、绞 肉 机 、 击 碎 机 等 。 (一 )机 械 法 (二 )物 理 法1.反 复 冻 融 法 把 待 破 碎 的 样 品 冷 至 15 20 ，使 之 凝 固 ， 然 后 缓 慢 地 溶 解 ， 如 此 反 复 操作 ， 大 部 分 动 物 性 的 细 胞 及 细 胞 内 的 颗 粒可 以 破 碎 。 在 细 菌 或 病 毒 中 提 取 蛋 白 质 和 核 酸时 可 用 此 法 。 操 作 时 ， 将 材 料 投 入 沸水 中 ， 在 90 左 右 维 持 数 分 钟 ， 立 即置 于 冰 浴 中 ， 使 之 迅 速 冷 却 ， 绝 大 部分 细 胞 被 破 坏 。 2.冷 热 交 替 法 3 超 声 波 处 理 法 多 用 于 微 生 物 材 料 ， 处 理 的 效 果 与 样 品浓 度 、 使 用 频 率 有 关 。 用 大 肠 杆 菌 制 备 各 种酶 时 ， 常 用 50 100mg L菌 体 的 浓 度 ， 在1KHz 10KHz（ 千 赫 兹 ） 频 率 下 处 理 1015min。 对 于 其 他 细 菌 ， 则 视 具 体 情 况 而 定 。操 作 中 注 意 避 免 溶 液 中 气 泡 的 存 在 ， 制 备 对超 声 波 敏 感 的 一 些 核 酸 、 酶 ， 要 慎 重 使 用 。 4.压 破 碎 法 加 气 压 或 水 压 （ 如 上 海 高 压 匀 浆 泵 厂生 产 的 高 压 匀 质 机 ） ， 达 20.59 34.32MPa（ 210 350kgf cm2） 的 压 力 时 ， 可 使 90%以 上 细 胞 被 压 碎 。 多 用 于 微 生 物 酶 制 剂 的工 业 制 备 。 (三 )生 化 及 化 学 法 1 自 溶 法 即 新 鲜 的 生 物 材 料 存 放 在 一 定 的 pH和 适 当 温 度 下 ， 利 用 组 织 细 胞 中 自 身 的酶 系 将 细 胞 破 坏 ， 使 细 胞 内 含 物 释 放 出来 的 方 法 。 自 溶 的 温 度 ， 动 物 材 料 选 在0 4 ， 微 生 物 材 料 则 多 在 室 温 下 进 行 。 自 溶 时 ， 需 加 少 量 的 防 腐 剂 ， 如甲 苯 、 氯 仿 等 ， 以 防 止 外 界 细 菌 的 污染 。 因 自 溶 的 时 间 较 长 ， 不 易 控 制 ，故 制 造 具 有 活 性 的 核 酸 、 蛋 白 质 时 比较 少 用 。 2 酶 处 理 法 用 外 来 酶 处 理 生 物 材 料 ， 如 溶 菌 酶 （ Lysozyme）是 专 一 地 破 坏 细 菌 细 胞 壁 的 酶 。 如 用 噬 菌 体 感 染 大肠 杆 菌 细 胞 制 造 DNA时 ， 采 用 pH8的 0.1mol L三 羟 甲基 氨 基 甲 烷 （ Tris） 0.01mol L乙 二 胺 四 乙 酸（ EDTA） 制 成 每 毫 升 含 2亿 个 细 胞 的 细 胞 悬 液 ， 然 后加 入 100 g 1mg的 溶 菌 酶 ， 在 37 保 温 10min， 细菌 胞 壁 即 被 破 坏 ； 还 有 把 蜗 牛 酶 用 于 酵 母 细 胞 的 破碎 ； 用 胰 酶 处 理 猪 脑 制 备 脑 安 素 。 用 于 专 一 性 分 解细 胞 壁 的 酶 还 有 纤 维 素 酶 （ 破 坏 植 物 细 胞 ） 、 细 菌蛋 白 酶 、 酯 酶 、 壳 糖 酶 等 。 3.表 面 活 性 剂 处 理 法 表 面 活 性 剂 的 分 子 中 ， 兼 有 亲 脂性 和 亲 水 性 基 团 ， 能 降 低 水 的 界 面 张力 ， 具 有 乳 化 、 分 散 、 增 溶 作 用 。 较常 用 的 有 十 二 烷 基 硫 酸 钠 (SDS)、 氯化 十 二 烷 基 吡 啶 、 去 氧 胆 酸 钠 等 。 生 化 物 质 的 提 取 利 用 一 种 溶 剂 对 不 同 物 质 溶 解 度 的 差 异 ，从 混 合 物 中 分 离 出 一 种 或 几 种 组 分 的 过 程称 为 提 取 （ extraction） ， 提 取 又 称 萃 取或 抽 提 ， 其 含 义 基 本 相 同 。 用 冷 溶 剂 从 固体 态 物 质 提 取 的 过 程 可 称 为 浸 渍（ maceration） ； 用 热 溶 剂 者 可 称 为 浸 提（ digestion） ， 也 称 浸 煮 一 、 物 质 的 性 质 与 提 取（ 一 ） 物 质 的 性 质 与 提 取 方 法 的 选 择 选 择 合 适 的 溶 剂 系 统 与 提 取 条 件 。 （ 二 ） 活 性 物 质 的 保 护 措 施1 采 用 缓 冲 系 统2 添 加 保 护 剂 （ 半 胱 氨 酸 ， 还 原 性 谷 胱 甘 肽 等 ）3 抑 制 水 解 酶 的 作 用 (SDS,EDTA)4 其 他 保 护 措 施 (避 免 过 酸 过 碱 和 剧 烈 搅 拌 ） （ 三 ） 生 化 物 质 的 提 取 一 般 生 产 上 多 用 2 3次 提 取 。 溶 剂 用量 （ L） 为 生 物 材 料 的 2 5倍 ， 少 数 情 况 也有 用 10 20倍 量 溶 剂 作 一 次 性 提 取 。 目 的 是节 省 提 取 时 间 ， 降 低 有 害 酶 的 作 用 。 二 、 影 响 提 取 的 因 素 （ ） 温 度（ 二 ） 酸 碱 度 （ 三 ） 盐 浓 度 三 、 提 取 方 法 （ 一 ） 用 酸 、 碱 、 盐 水 溶 液 提 取（ 二 ） 用 表 面 活 性 剂 提 取（ 三 ） 有 机 溶 剂 提 取 对 酸 性 物 质 的 提 取 ， 常 在 碱 性 条件 下 进 行 ； 对 碱 性 物 质 的 提 取 ， 常 在酸 性 条 件 下 进 行 ； 对 两 性 物 质 的 提 取 ，则 使 水 溶 液 的 pH值 在 远 离 该 两 性 物 质的 等 电 点 为 佳 。 （ 三 ） 超 临 界 气 体 的 萃 取 技 术 以 气 体 为 萃 取 剂 ， 当 气 体 处 于 超 过 临界 温 度 和 临 界 压 力 时 ， 呈 现 一 种 既 非 液 相又 非 气 相 的 流 体 ， 兼 有 液 体 和 气 体 的 特 性 。如 密 度 接 近 于 液 体 ， 粘 度 却 接 近 于 气 体 ，具 有 良 好 的 溶 剂 性 质 。 气 体 萃 取 剂 必 须 具 有 临 界 压 力 低 ， 临界 温 度 接 近 于 室 温 ， 化 学 稳 定 性 好 ， 价 廉易 得 等 特 点 。 主 要 有 二 氧 化 碳 、 氮 气 、 乙烯 、 乙 烷 、 丙 烯 、 丙 烷 等 ， 最 常 用 的 是 二氧 化 碳 。 其 方 法 主 要 有 等 温 法 和 等 压 法 两种 ， 借 助 于 压 力 或 温 度 的 调 节 分 离 萃 取 剂与 被 萃 取 物 。 该 技 术 应 用 于 酶 、 不 饱 和 脂 肪 酸 的提 取 （ 如 鱼 油 和 卵 磷 脂 的 提 取 ） 、 精 制和 回 收 ， 也 可 用 于 生 化 产 品 的 溶 剂 脱 除 。某 些 生 化 产 品 在 生 产 过 程 中 ， 采 用 了 丙酮 和 甲 醇 溶 剂 ， 欲 脱 去 溶 剂 又 要 避 免 产品 的 分 解 ， 需 选 择 超 临 界 气 体 提 取 。 与减 压 干 燥 法 相 比 较 ， 前 者 不 多 消 耗 能 源 ，且 缩 短 脱 溶 时 间 。 四 、 提 取 液 的 分 离 提 取 所 得 到 的 溶 液 ， 需 与 固 体 或 另 一 液 体 分离 。 溶 液 与 固 体 的 分 离 ， 一 般 处 理 方 法 有 三 种 ： 自然 沉 降 、 过 滤 、 离 心 。 自 然 沉 降 是 在 液 体 介 质 中 ， 固 体 自 然 下 沉 而 分离 的 过 程 。 当 混 悬 液 处 理 量 较 大 ， 且 固 体 和 液 体 的比 重 悬 殊 时 ， 可 用 此 法 。 沉 降 分 层 后 ， 可 用 虹 吸 等方 法 将 液 体 部 分 移 去 。 过 滤 系 利 用 多 孔 材 料 阻 留 固 体 ， 而 使 液 体 通过 ， 达 到 固 体 与 液 体 分 离 的 过 程 。 离 心 是 利 用 旋 转 运 动 的 离 心 力 进 行 分 离 物 料的 一 种 操 作 ， 其 中 通 过 过 滤 介 质 分 离 液 体 和 固 体者 为 离 心 过 滤 ； 利 用 液 体 比 重 的 大 小 分 离 出 不 同比 重 的 液 体 者 为 离 心 分 离 ； 利 用 液 固 两 相 比 重 的差 异 进 行 沉 降 分 离 者 为 离 心 沉 降 。 生 化 物 质 的 分 离 纯 化 技 术 生 化 物 质 分 离 纯 化 技 术 包 括 ：生 化 产 品 的 分 离 分 析 和 生 化 产 品 的 制 备 。 前 者 主 要 对 生 物 体 内 各 组 份 加 以 分 离后 进 行 定 性 、 定 量 鉴 定 ， 它 不 一 定 要 把 某组 分 从 混 合 物 中 分 离 提 取 出 来 ； 而 后 者 则主 要 是 为 了 获 得 生 物 体 内 某 一 单 纯 组 分 。 为 了 保 护 目 的 物 的 生 理 活 性 及 结 构 上 的 完 整性 ， 生 物 产 品 的 制 备 中 的 分 离 方 法 多 采 用 温 和 的“ 多 阶 式 ” 方 法 进 行 ， 即 常 说 的 “ 逐 级 分 离 ” 方 法 。 为 了 纯 化 一 种 生 化 物 质 常 常 要 联 合 几 个 ， 甚 至十 几 个 步 骤 ， 并 不 断 变 换 各 种 不 同 类 型 的 分 离 方 法 ，才 能 达 到 目 的 。 因 此 操 作 的 时 间 长 ， 手 续 繁 琐 ， 给制 备 工 作 带 来 众 多 影 响 。 亲 和 层 析 法 具 有 从 复 杂 生 物 组成 中 专 一 的 “ 钓 出 ” 特 异 生 化 成 分的 特 点 ， 目 前 已 在 生 物 大 分 子 ， 如酶 、 蛋 白 、 抗 体 和 核 酸 等 的 纯 化 中得 到 广 泛 应 用 。 （ 一 ） 分 离 纯 化 原 理 （ 1） 根 据 分 子 形 状 和 大 小 不 同 进 行 分 离 。 如差 速 离 心 与 超 离 心 ， 膜 分 离 （ 透 析 、 电 渗 析 ） 与超 滤 法 ， 凝 胶 过 滤 法 。 （ 2） 根 据 分 子 电 离 性 质 （ 带 电 性 ） 的 差 异 进 行分 离 。 如 离 子 交 换 法 ， 电 泳 法 ， 等 电 聚 焦 法 。 （ 3） 根 据 分 子 极 性 大 小 及 溶 解 度 不 同 进 行 分 离 。如 溶 剂 提 取 法 ， 逆 流 分 配 法 ， 分 配 层 析 法 ， 盐 析法 ， 等 电 点 沉 淀 法 及 有 机 溶 剂 分 级 沉 淀 法 。（ 4） 根 据 物 质 吸 附 性 质 的 不 同 进 行 分 离 。 如 选择 性 吸 附 与 吸 附 层 析 法 。 （ 5） 根 据 配 体 特 异 性 进 行 分 离 亲 和 层 析 法 。 （ 二 ） 分 离 纯 化 的 程 序 和 生 产 设 计（ 1） 确 定 制 备 物 的 研 究 目 的 及 建 立 相 应 的 分 析鉴 定 方 法 ；（ 2） 制 备 物 的 理 化 性 质 稳 定 性 的 预 备 试 验 ；（ 3） 材 料 处 理 及 抽 提 方 法 的 选 择 ；（ 4） 分 离 纯 化 方 法 的 摸 索 ；（ 5） 产 物 的 均 一 性 测 定 。 1 分 离 纯 化 初 期 使 用 方 法 的 选 择 早 期 分 离 纯 化 用 萃 取 ， 沉 淀 ， 吸 附 等一 些 分 辨 力 低 的 方 法 较 为 有 利 ， 这 些 方 法负 荷 能 力 大 ， 分 离 量 多 兼 有 分 离 提 纯 和 浓缩 作 用 ， 为 进 一 步 分 离 纯 化 创 造 良 好 的 基础 。 早 期 分 离 方 法 的 选 择 原 则 是 从 低 分 辨 能 力 到 高分 辨 能 力 ， 而 且 负 荷 量 较 大 者 为 合 适 ， 但 随 着 许 多新 技 术 的 建 立 ， 一 个 特 异 性 方 法 的 分 辨 力 愈 高 ， 便意 味 着 提 纯 步 骤 愈 简 化 ， 收 率 愈 高 ， 生 化 物 质 的 变性 危 险 愈 少 ， 因 此 亲 和 层 析 法 ， 纤 维 素 离 子 交 换 层析 法 、 连 续 流 动 电 泳 、 连 续 流 动 等 电 聚 焦 等 在 一 定条 件 下 ， 也 用 于 从 粗 提 取 液 中 分 离 制 备 小 量 目 的 物 。 2 各 种 分 离 纯 化 方 法 的 使 用 程 序 生 化 物 质 的 分 离 都 是 在 液 相 中 进 行 ， 故 分 离方 法 主 要 根 据 物 质 的 分 配 系 数 ， 分 子 量 大 小 ， 离子 电 荷 性 质 及 数 量 和 外 加 环 境 条 件 的 差 别 等 因 素为 基 础 。 例 如 纯 化 其 一 两 性 物 质 时 ， 前 一 步 已 利 用 该物 质 的 阴 离 子 性 质 ， 使 用 了 阴 离 子 交 换 层 析 法 ，下 一 步 提 纯 时 再 应 用 其 阳 离 子 性 质 作 层 析 或 电 泳分 离 便 会 取 得 较 好 分 离 效 果 。 如 有 些 杂 质 在 各 种 条 件 下 带 电 荷 性 质 可 能 与目 的 物 相 似 ， 其 分 子 形 状 与 大 小 与 目 的 物 相 差 较大 ， 而 另 一 些 杂 质 的 分 子 形 状 与 大 小 可 能 与 目 的物 相 似 ， 但 在 某 条 件 下 与 目 的 物 的 电 荷 性 质 不 同 ，在 这 种 情 况 下 ， 先 用 分 子 筛 ， 用 离 心 或 膜 过 滤 法除 去 分 子 量 相 差 较 大 的 杂 质 ， 然 后 在 一 定 pH值 和离 子 强 度 范 围 下 ， 使 目 的 物 变 成 有 利 的 离 子 状 态 ，便 能 有 效 地 进 行 层 析 分 离 。 在 安 排 纯 化 方 法 顺 序 时 ， 还 要 考 虑到 有 利 于 减 少 工 序 ， 提 高 效 率 ， 如 在 盐析 后 采 取 吸 附 法 ， 必 然 会 因 离 子 过 多 而影 响 吸 附 效 果 ， 如 增 加 透 析 除 盐 ， 则 使操 作 大 大 复 杂 化 。 如 倒 过 来 进 行 ， 先 吸附 ， 后 盐 析 就 比 较 合 理 。 3 分 离 后 期 的 保 护 性 措 施 在 分 离 操 作 的 后 期 必 须 注 意 避 免 产 品 的 损 失 ，主 要 损 失 途 径 是 器 皿 的 吸 附 ， 操 作 过 程 样 品 液 体 的残 留 ， 空 气 的 氧 化 和 某 些 事 先 无 法 了 解 的 因 素 。 为了 取 得 足 够 量 的 样 品 ， 常 常 需 要 加 大 原 材 料 的 用 量 ，并 在 后 期 纯 化 工 序 中 注 意 保 持 样 品 溶 液 有 较 高 的 浓度 ， 以 防 制 备 物 在 稀 溶 液 中 的 变 性 ， 有 时 常 加 入 一些 电 解 质 以 保 护 生 化 物 质 的 活 性 ， 减 少 样 品 溶 液 在器 皿 中 的 残 留 量 。 （ 三 ） 分 离 纯 化 方 法 的 评 估 每 一 个 分 离 纯 化 步 骤 的 好 坏 ， 除 了 从 分 辨 能力 和 重 现 性 两 方 面 考 虑 外 ， 还 要 注 意 方 法 本 身 的回 收 率 ， 特 别 是 制 备 某 些 含 量 很 少 的 物 质 时 ， 回收 率 的 高 低 十 分 重 要 。 一 般 经 过 5 6步 提 纯 后 ，活 力 回 收 在 25 以 上 。 但 不 同 物 质 的 稳 定 性 不 同 、分 离 难 易 不 同 ， 回 收 率 也 不 同 。 对 每 一 步 骤 方 法 的 优 劣 的 记 录 ， 体 现 在 所 得产 品 重 量 及 活 性 平 衡 关 系 上 。 这 一 关 系 ， 可 通 过每 一 步 骤 的 分 析 鉴 定 求 出 。 例 如 酶 的 分 离 纯 化 ，每 一 步 骤 产 物 重 量 与 活 性 关 系 ， 通 过 测 定 酶 的 比活 力 及 溶 液 中 蛋 白 质 浓 度 的 比 例 。 其 他 活 性 物 质也 可 通 过 测 定 总 活 性 的 变 化 与 样 品 重 量 或 体 积 与测 出 的 活 力 列 表 进 行 对 比 分 析 ， 算 出 每 步 的 提 纯倍 数 及 回 收 率 。 （ 四 ） 生 化 产 品 纯 度 的 鉴 定 一 个 制 备 物 是 否 纯 ， 常 以 “ 均 一 性 ” 表 示 。均 一 性 是 指 所 获 得 的 制 备 物 只 具 有 一 种 完 全 相 同的 成 分 ， 均 一 性 的 评 价 常 须 经 过 数 种 方 法 的 验 证才 能 肯 定 。 有 时 某 一 种 测 定 方 法 认 为 该 物 质 是 均一 的 ， 但 另 一 种 测 定 方 法 却 可 把 它 分 成 两 个 甚 至更 多 的 组 分 ， 这 就 说 明 前 一 种 鉴 定 方 法 所 得 的 结果 是 片 面 的 。 如 果 某 物 质 所 具 有 的 物 理 、 化 学 等 方 面 性 质经 过 几 种 高 灵 敏 度 方 法 的 鉴 定 都 是 均 一 的 ， 那 么大 致 可 以 认 为 它 是 均 一 的 。 当 然 ， 随 着 更 好 的 鉴定 方 法 的 出 现 。 还 可 能 发 现 它 不 是 均 一 的 。 绝 对的 标 准 只 有 把 制 备 物 的 全 部 结 构 搞 清 楚 ， 并 经 过人 工 合 成 证 明 具 有 相 同 生 理 活 性 时 ， 才 能 肯 定 制备 物 是 绝 对 纯 净 的 。 生 物 分 子 纯 度 的 鉴 定 方 法 很 多 ， 常用 的 有 溶 解 度 法 ， 化 学 组 成 分 析 法 ， 电泳 法 ， 免 疫 学 方 法 ， 离 心 沉 降 分 析 法 ，各 种 色 谱 法 ， 生 物 功 能 测 定 法 ， 以 及 质谱 法 等 。 实 验 内 容 简 介 猪 血 清 -球 蛋 白 分 离纯 化 及 鉴 定实 验 一 、 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 是 研 究 蛋 白 质 化 学 及 其生 物 功 能 的 重 要 手 段 。 不 同 的 蛋 白 质 的 分 子 量 、溶 解 度 、 以 及 在 一 定 条 件 下 带 电 的 情 况 有 所 不同 ， 可 以 更 据 这 些 性 质 的 差 别 ， 分 离 及 提 纯 各种 蛋 白 质 。 1.1 内 容 提 要 免 疫 球 蛋 白 (immunoglobulin,Ig） 是 人 体 接 受抗 原 刺 激 后 ， 由 浆 细 胞 所 产 生 的 一 类 具 有 免 疫 功 能的 球 状 蛋 白 质 ， 是 直 接 参 与 免 疫 反 应 的 抗 体 蛋 白 的总 称 。 各 种 免 疫 球 蛋 白 能 特 异 地 与 相 应 的 抗 原 结 合形 成 抗 原 -抗 体 复 合 物 （ 免 疫 复 合 物 ） ， 从 而 阻 断 抗原 对 人 体 的 有 害 作 用 ， 对 细 菌 等 抗 原 的 杀 伤 最 后 由补 体 去 完 成 。 l -球 蛋 白 也 称 为 丙 种 球 蛋 白 ， 相 对 分 子 量 为 15-16万 ， 沉 降 系 数 为 7S； 是 一 组 在 结 构 与 功 能 上 有密 切 关 系 蛋 白 质 。 杨 据 Ig的 免 疫 化 学 特 性 ， 可 分为 五 大 类 ： IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE， 其分 子 不 论 哪 一 类 ， 都 由 四 链 组 成 ， 即 由 两 条 相 同的 长 多 肽 链 称 H链 （ 又 称 重 链 ） 及 两 条 相 同 的 短肽 链 称 L链 （ 又 称 轻 链 ） 组 成 。l 机 体 大 部 分 免 疫 功 能 力 都 依 赖 于 IgG类 免 疫 球 蛋白 ， 它 约 占 免 疫 球 蛋 白 总 量 的 70-90%。 l IgG是 人 和 动 物 血 浆 蛋 白 的 重 要 组 分 之 一 ，制 备 -球 蛋 白 的 原 料 通 常 用 动 物 血 液 ，其 次 还 有 动 物 胎 盘 和 初 乳 乳 清 。 制 备 方法 有 低 温 乙 醇 法 、 利 凡 诺 法 、 盐 析 法 、离 子 交 换 法 等 。 1.2 实 验 目 标 掌 握 免 疫 球 蛋 白 （ IgG ） 的 原 理 和 方 法 掌 握 利 用 紫 外 法 、 单 向 免 疫 扩 散 法 等 测定 IgG含 量 的 方 法 掌 握 SDS-PAGE电 泳 法 鉴 定 蛋 白 质 纯 度 及测 定 分 子 量 方 法掌 握 层 析 、 透 析 、 膜 分 离 、 电 泳 等 生 化分 离 鉴 定 技 术 的 应 用 及 操 作 1.3 实 验 要 求 掌 握 的 技 术柱 层 析 分 离 技 术 Sephadex G-25 分 子 筛 层 析 DEAE-Cellulose 离 子 交 换 层 析 蛋 白 质 提 取 技 术 硫 酸 铵 盐 析 、 透 析 、 膜 分 离 技术 等蛋 白 质 含 量 测 定 消 光 系 数 法 、 FOLin酚 法 测 定 IgG蛋 白 质 含 量蛋 白 质 分 子 量 、 纯 度 、 活 性 测 定 SDS-PAG E 电 泳 法 检 测 、 单 向 免 疫 扩 散 法 猪 脾 脏 DNA提 取 及 含 量鉴 定实 验 二 、 2.1内 容 提 要 为 了 研 究 DNA分 子 在 生 命 代 谢 中 的 作 用 ， 常 常需 要 从 不 同 的 生 物 材 料 中 提 取 DNA.由 于 DNA分 子 在生 物 体 内 的 分 布 及 含 量 不 同 ， 要 选 择 适 当 的 材 料提 取 DNA。 动 植 物 中 ， 小 牛 胸 腺 、 动 物 肝 脏 、 鱼 类 精 子 ，植 物 种 子 的 胚 中 都 含 有 丰 富 的 DNA。 微 生 物 中 ， 谷氨 酸 菌 体 含 7% 10%， 面 包 酵 母 含 4%， 啤 酒 酵 母 含6%， 大 肠 肝 菌 含 9% 10%。 从 各 种 材 料 中 提 取 DNA方 法 不 同 ， 分 离 提 取的 难 易 程 度 也 不 同 。 对 于 低 等 生 物 。 如 从 病 毒 中 提 取 DNA 比 较 容易 ， 多 数 病 毒 DNA 分 子 量 较 小 ， 提 取 时 易 保 持 其结 构 完 整 性 。 从 细 菌 及 高 等 动 植 物 中 提 取 DNA难 度 大 一 些 。细 菌 DNA 分 子 量 较 大 ， 一 般 达 2 10 道 尔 顿 。 因此 易 被 机 械 张 力 剪 断 。 细 菌 DNA， 除 核 DNA 外 ，还 有 质 粒 DNA 等 。 小 牛 胸 腺 肝 脏 鱼 类 精 子种 子 胚 胎 谷 氨 酸 菌 体（ 7%10%） 面 包 酵 母 （ 4%） 啤 酒 酵 母 （ 6%） 大 肠 肝 菌 （ 9%10%）来 源 动 物 植 物 微 生 物 2.1.1 DNA的 基 本 功 能 生 物 遗 传 信 息 复 制 的 模 板 和 基 因 转 录 的 模 板 ； 是 生 命 遗 传 繁 殖 的 物 质 基 础 ， 也 是 个 体 生 命活 动 的 基 础 ； 作 为 DNA分 子 中 的 某 一 区 段 ， 有 复 制 、 转 录和 翻 译 等 主 要 功 能 称 为 基 因 。 核 酸 （ Nucleic acid） 是 以 核 苷 酸 为 基 本 组 成 生物 大 分 子 。 天 然 存 在 的 核 酸 有 两 类 ， 一 类 为 脱 氧 核 糖核 酸 Deoxyribonucleic acid， DNA)， 另 一 类 为 核 糖核 酸 (Ribonucleic acid， RNA)。 DNA存 在 于 细 胞 核 和线 粒 体 中 ， 携 带 遗 传 信 息 。 RNA存 在 于 细 胞 质 和 细 胞核 内 ， 参 与 细 胞 内 DNA遗 传 信 息 的 表 达 。2.1.2 核 酸 的 结 构 与 功 能 2.1.3 DNA存 在 形 式 2.1.4 l RNA和 核 苷 酸 的 纯 品 都 呈 白 色 粉 末 或 结 晶 ， DNA则 为白 色 类 似 石 棉 样 的 纤 维 状 物 。 除 肌 苷 酸 、 鸟 苷 酸 具有 鲜 味 外 ， 核 酸 和 核 苷 酸 大 都 呈 酸 味 。 l DNA、 RNA和 核 苷 酸 都 是 极 性 化 合 物 ， 一 般 都 溶 于 水 ，不 溶 于 乙 醇 、 氯 仿 等 有 机 溶 剂 ， 它 们 的 钠 盐 比 游 离酸 易 溶 于 水 ， RNA钠 盐 在 水 中 溶 解 度 可 达 40g/L。 DNA在 水 中 为 10g/L， 呈 黏 性 胶 体 溶 液 。 酸 性 溶 液 中 ，DNA、 RNA易 水 解 ， 中 性 或 弱 碱 性 溶 液 中 较 稳 定 。 天 然 状 态 的 DNA 是 以 脱 氧 核 糖 核 蛋 白 (DNP)形式 存 在 于 细 胞 核 中 。 要 从 细 胞 中 提 取 DNA 时 ，先 把 DNP抽 提 出 来 ， 再 把 P除 去 ， 再 除 去 细 胞中 的 糖 ， RNA 及 无 机 离 子 等 ， 从 中 分 离 DNA 。 DNP和 RNP在 盐 溶 液 中 的 溶 解 度 受 盐 浓 度 的 影响 而 不 同 。 DNP在 低 浓 度 盐 溶 液 中 ， 几 乎 不 溶解 ， 如 在 0.14 mol/L的 氯 化 钠 溶 解 度 最 低 ，仅 为 在 水 中 溶 解 度 的 1%， 随 着 盐 浓 度 的 增 加溶 解 度 也 增 加 ， 至 1mol/L氯 化 钠 中 的 溶 解 度很 大 ， 比 纯 水 高 2倍 。 RNP在 盐 溶 液 中 的 溶 解 度 受 盐 浓 度 的影 响 较 小 ， 在 0.14mol/L氯 化 钠 中 溶解 度 较 大 。 因 此 ， 在 提 取 时 ， 常 用此 法 分 离 这 两 种 核 蛋 白 。 2.1.5 细 胞 的 破 碎细 菌 有 坚 硬 的 细 胞 壁 ， 首 先 要 破 碎 细 胞 。方 法 有 三 种 ： 机 械 方 法 ： 超 声 波 处 理 法 、 研 磨 法 、 匀 浆 法 ； 化 学 试 剂 法 ： 用 SDS处 理 细 胞 ； 酶 解 法 ： 加 入 溶 菌 酶 或 蜗 牛 酶 ， 都 可 使 细 胞 壁 破 碎 。 l 由 于 高 等 动 物 DNA 主 要 存 在 于 细 胞 核 与 线 粒 体 中 ，所 以 提 取 时 有 两 个 困 难 （ 高 等 植 物 与 此 类 似 ） ： 破 碎 细 胞 难 ； 从 处 死 动 物 分 离 组 织 器 宫 到 破 碎 细胞 费 时 长 。 在 此 时 期 间 DNA可 能 会 被 DNase降 解 ， 而动 物 组 织 ： 特 别 是 肌 肉 组 织 很 难 破 碎 ,即 使 是 较 易破 碎 的 肝 肾 等 组 织 也 往 往 使 用 组 织 匀 浆 器 ， 易 造成 DNA断 裂 。 分 子 量 大 ， 一 般 比 细 菌 的 大 2 3个 数 量 级 ， 比 病毒 的 大 4 5个 数 量 。 对 不 同 生 物 材 料 ， 要 根 据 具 体情 况 选 择 适 当 的 分 离 提 取 方 法 。 l 学 习 和 掌 握 从 动 物 组 织 提 取 核 酸 的 原 理 和操 作 技 术 ； l 练 习 从 动 物 组 织 提 取 纯 化 DNA操 作 ； l 学 习 水 平 式 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 及 紫 外 检 测 ，确 定 DNA的 纯 度 、 含 量 与 分 子 量 。 2.3 实 验 要 求 掌 握 的 技 术l 动 物 组 织 中 DNA提 取 分 离 纯 化 技 术l DNA含 量 检 测 :如 二 苯 胺 法 ， 紫 外 法l DNA纯 度 检 测 及 分 子 量 测 定 :平 板 凝 胶 电泳 法 1. 实 验 结 果 记 录2.完 成 课 程 小 论 文 3.1实 验 数 据 3.1.1 IgG 产 率 (mg/100ml血 清 ) 3.1.2 IgG 粗 制 品 蛋 白 质 含 量 3.1.3 IgG 回 收 率 3.1.4 IgG 纯 品 含 量 及 蛋 白 质 含 量 3.1.5 IgG 分 子 量 3.1.6 猪 脾 DNA产 品 得 率 （ mg/100g) 3.1.7 DNA 产 品 纯 度 及 分 子 量3.2实 验 图 表 3.2.1Sephadex G -25（ 50） 层 析 曲 线 3.2.2Cellulose 层 析 曲 线 3.2.3电 泳 图 谱 3.2.4各 标 准 曲 线 3.2.5 琼 扩 图 谱 课 后 讨 论 题 l 1.血 清 和 血 浆 有 什 么 区 别 ？l 2.IgG的 主 要 功 能 是 什 么 ？l 3.分 级 盐 析 法 分 离 纤 维 蛋 白 、 球 蛋 白 和 清 蛋 白 的 依 据是 什 么 ？l 4.离 子 交 换 法 纯 化 IgG的 理 论 基 础 是 什 么 ？ 为 了 提 高IgG制 品 活 性 ， 在 分 离 纯 化 过 程 中 应 注 意 控 制 哪 些 条件 ？l 5.SDS-PAGE电 泳 时 样 品 溶 解 液 中 的 SDS、 甘 油 、 巯 基乙 醇 、 溴 酚 蓝 成 分 、 各 自 有 何 作 用 ？l 6.简 述 SDS-PAGE测 定 蛋 白 质 相 对 分 子 质 量 的 原 理 。l 7.为 什 么 不 连 续 系 统 PAGE比 连 续 系 PAGE的 分 辨 率 高 ？ l 1.为 什 么 在 低 温 下 进 行 ？l 2.分 别 加 柠 檬 酸 钠 和 EDTA的 作 用 是 什 么 ?l 3.加 SDS的 作 用 ？l 4.加 NaCL的 作 用 ， 为 什 么 要 加 到 1mol/L?l 5.加 入 异 戊 醇 有 什 么 作 用 ？l 6.结 合 本 人 实 验 操 作 的 体 会 ,试 述 在 提 取 过 程 中应 如 何 避 免 大 分 子 DNA的 降 解 和 断 裂 ?l 7.DNA制 品 都 可 以 用 哪 几 种 方 法 测 定 其 含 量 ?试 从它 们 原 理 、 准 确 性 等 方 面 加 以 比 较 。l 8.DNA溴 乙 锭 染 色 法 具 有 什 么 优 点 ？ 操 作 中 应 注意 什 么 ？