实验二显微镜油镜的使用及细菌的简单染色法

实 验 二 显 微 镜 油 镜 的 使 用 及 细 菌 的 简 单 染 色 法 一 、 实 验 目 的 ：1.学 习 并 掌 握 普 通 光 学 显 微 镜 油 镜 的 使 用 技 术 ；2.学 习 微 生 物 制 片 、 染 色 的 基 本 技 术 ， 掌 握 细 菌 的 简 单 染 色 法 及 无 菌 操 作 技 术 ； 3.观 察 细 菌 的 基 本 形 态 。 二、实验原理：1、 染 色 原 理 ： 用 于 生 物 染 色 的 染 料 主 要 有 碱 性 染 料 、 酸 性 染 料 和 中 性 染 料 三 大 类 。 碱 性 染 料 的 离 子 带 正 电 荷 ， 能 和 带 负 电 荷 的 物 质 结 合 。 因 细 菌 蛋 白 质 等 电 点 较 低 ， 当 它 生 长 于 中 性 、 碱 性 或 弱 酸 性 的 溶 液 中 时 常 带 负 电 荷 ， 所 以 通 常 采 用 碱 性 染 料 （ 如 美 蓝 、 结 晶 紫 、 碱 性 复 红 或 孔 雀 绿 等 ） 使 其 着 色 。 酸 性 染 料 的 离 子 带 负 电 荷 ， 能 与 带 正 电 荷 的 物 质 结 合 。 当 细 菌 分 解 糖 类 产 酸 使 培 养 基 pH下 降 时 ， 细 菌 所 带 正 电 荷 增 加 ， 因 此 易 被 伊 红 、 酸 性 复 红 或 刚 果 红 等 酸 性 染 料 着 色 。 中 性 染 料 是 前 两 者 的 结 合 物 又 称 复 合 染 料 ， 如 伊 红 美 蓝 、 伊 红 天 青 等 。 简 单 染 色 法 :是 只 用 一 种 染 料 使 细 菌 着 色 以 显 示 其 形 态 的 染 色 法 ， 简 单 染 色 不 能 辨 别 细 菌 细 胞 的 构 造 。 2、 显 微 镜 油 镜 工 作 原 理 ： 利 用 油 镜 不 但 能 增 加 照 明 度 ， 更 主 要 是 能 增 加 数 值 口 径 ， 因 为 显 微 镜 的 放 大 效 能 是 由 其 数 值 口 径 决 定 的 。 所 谓 数 值 口 径 ， 即 光 线 投 射 到 物 镜 上 的 最 大 角 度 （ 称 为 镜 口 角 ） 的 一 半 正 弦 ， 乘 上 玻 片 与 物 镜 间 介 质 的 折 射 率 所 得 的 乘 积 ， 可 用 下 列 公 式 表 示 ： NA=nsin NA:数 值 孔 径 n:介 质 折 射 率 ： 镜 口 角 的 半 数 显 微 镜 的 分 辨 率 是 指 显 微 镜 能 够 辨 别两 点 之 间 最 小 距 离 的 能 力 。 它 与 接 物 镜 的数 值 口 径 成 正 比 ， 与 光 波 长 度 成 反 比 ， 因此 接 物 镜 的 数 值 口 径 愈 大 ， 光 波 波 长 愈 短 ，则 显 微 镜 的 分 辨 力 愈 大 ， 被 检 物 体 的 细 微结 构 也 愈 能 明 显 地 区 别 出 来 。 能 辨 别 两 点 之 间 最 小 距 离 = 1/2光 波 长 度 数 值 口 径 = 1/2 NA 三 、实验器材1、 活 材 料 ： 培 养 18-24h的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (S.aureus) 和 枯 草 芽 孢 杆 菌 （ B.subtilis） 。2、 染 色 液 和 试 剂 ： 复 红 、 美 兰 、 二 甲 苯 、 香 柏 油 。3、 器 材 ： 载 玻 片 、 接 种 杯 、 酒 精 灯 、 擦 镜 纸 、 显 微 镜 。 四、实验步骤：1、 涂 片 ： 取 干 净 载 玻 片 一 块 ， 在 载 玻 片 的 左 、 右 各 加 一 滴 蒸 馏水 ， 按 无 菌 操 作 法 取 菌 涂 片 ， 左 边 涂 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ， 右边 涂 芽 孢 杆 菌 ， 做 成 薄 的 涂 面 ， 注 意 取 菌 不 要 太 多 。 整 个 过 程 中 要 注 意 无 菌 操 作 。 （ 示 范 无 菌 操 作 技 术 ） 2、 干 燥 ： 让 涂 片 自 然 晾 干 或 者 在 酒 精 灯 火 焰 上 方 文 火 烘 干 。 3、 固 定 ： 手 执 玻 片 一 端 ， 让 菌 膜 朝 上 ， 通 过 火 焰 2-3次 固 定 （ 以 不 烫 手 为 宜 ） 。 4、 染 色 ： 将 固 定 过 的 涂 片 加 复 红 或 美 兰 染 色 1-2min。5、 水 洗 ： 用 水 洗 去 涂 片 上 的 染 色 液 。6、 干 燥 ： 将 洗 过 的 涂 片 放 在 空 气 中 晾 干 或 用 吸 水 纸 吸 干 。7、 镜 检 ： 先 低 倍 观 察 ， 再 高 倍 观 察 ， 并 找 出 适 当 的 视 野 后 ， 将 高 倍 镜 转 出 ， 在 涂 片 上 加 香 柏 油 一 滴 ， 将 油 镜 头 浸 入 油 滴 中 仔 细 调 焦 观 察 细 菌 的 形 态 。8、 绘 图 ： 9、 实 验 完 毕 后 的 处 理 ： 将 浸 过 油 的 镜 头 按 下 述 方 法 擦 拭 干 净 ： a.先 用 擦 镜 纸 将 油 镜 头 上 的 油 擦 去 。 b.用 擦 镜 纸 沾 少 许 二 甲 苯 将 镜 头 擦 23次 。 c.再 用 干 净 的 擦 镜 纸 将 镜 头 擦 23次 。 注 意 擦 镜 头 时 向 一 个 方 向 擦 拭 。 看 后 的 染 色 玻 片 用 废 纸 将 香 柏 油 擦 干 净 ， 再 用 洗 衣 粉 清 洗 。 五、结 果 与 思 考 题1、 油 镜 与 普 通 物 镜 在 使 用 方 法 上 有 何 不 同 ？ 应 注 意 些 什 么 ？ 2、 按 比 例 绘 出 你 所 观 察 到 的 细 菌 的 形 态 ， 并 显 示 两 菌 的 排 列 方 式 。 六、注意事项1、 油 浸 物 镜 的 工 作 距 离 （ 指 物 镜 前 透 镜 的 表 面 到 被 检 物 体 之 间 的 距 离 ） 很 短 ， 一 般 在 0.2mm以 内 ， 再 加 上 一 般 光 学 显 微 镜 的 油 浸 物 镜 没 有 “ 弹 簧 装 置 ” ， 因 此 使 用 油 浸物 镜 时 要 特 别 细 心 ， 避 免 由 于 “ 调 焦 ” 不 慎 而 压 碎 标 本 片 并使 物 镜 受 损 。2、 染 色 过 程 中 勿 使 染 色 液 干 涸 。 用 水 冲 洗 后 ， 应 吸 去 玻 片 上 的 残 水 ， 以 免 染 色 液 被 稀 释 而 影 响 染 色 效 果 。 实 验 报 告 的 撰 写 要 求 实 验 报 告 必 须 以 实 事 求 是 、 严 肃 认 真 的 科 学 态 度 ， 按 照 指导 书 的 要 求 按 时 完 成 。 实 验 报 告 应 该 简 明 扼 要 、 叙 述 准 确 、 数据 完 整 、 绘 图 清 晰 且 写 实 ， 应 有 讨 论 、 有 分 析 ， 结 论 明 确 。 一般 应 包 括 以 下 一 些 内 容 ： 1 实 验 项 目 名 称 ； 2 实 验 目 的 ； 3 实 验 原 理 ；4. 实 验 材 料 ； 5 实 验 步 骤 ； 6 实 验 结 果 与 讨 论 。 简 单 染 色 实 验 步 骤涂 片 干 燥 固 定 染 色 水 洗 干 燥 镜 检结 果 与 思 考 题 ：1、 油 镜 与 普 通 物 镜 在 使 用 方 法 上 有 何 不 同 ？ 应 注 意 些 什 么 ？2、 按 比 例 绘 出 你 所 观 察 到 的 细 菌 的 形 态 ， 并 显 示 两 菌 的 排 列 方 式 。 复 红 或 美 蓝1-2min