康为世纪技术讲座-上医WBIF

Western Blot & I01062667528 北京康为世纪生物科技有限公司技术总监 刘雪松 2 内 容背景知识1 WB操作流程2 WB常见问题分析3 IF操作流程4 IF常见问题分析5 生物学反应系统检测原理反应系统：蛋白与蛋白、核酸与核酸指示系统： 酶、荧光素、同位素 直 接 法 间 接 法 背景知识 6(epitope)是指抗原分子上具有决定和控制抗原特异性的特殊化学基团,可与相应抗体相结合的部位。又称为抗原决定簇。 (antigen,Ag)是一类能刺激人或动物机体产生特异性免疫应答，并与免疫应答产物（抗体或效应细胞）结合，发生免疫效应的物质。包括蛋白质，多糖，多肽等。(antibody,Ab)机体在抗原物质刺激下，由B淋巴细胞分化形成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。 单克隆抗体和多克隆抗体 7 多克隆抗体： 多株B细胞针对多个抗原决定簇产生的抗体。多克隆抗体单克隆抗体 单克隆抗体： 由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的,只识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。 制备单克隆抗体的流程 抗原的种类 一 颗粒性抗原 细胞，细菌二 可溶性抗原 表达蛋白 合成多肽 细菌或病毒的某种蛋白 抗原的要求1 抗原量的要求，蛋白2mg,多肽 56mg2 纯度要求，蛋白纯度要90%以上，SDS-PAGE要一条带，多肽纯度要85%以上。3 蛋白背景，是否带有标签蛋白？与其他蛋白的同源性 康为提供的服务1 蛋白表达，制备抗体2 客户提供蛋白序列，我们提供蛋白表位预测、多肽合成，多肽与载体交联，制备抗体 3 抗体制备后的后续服务， 抗体的纯化，蛋白A/G，抗原或多肽的特异性亲和纯化 抗体的标记，HRP，FITC 抗体识别不同表位的测定 ELISA 配对抗体的筛选 IHC、WB 的应用 12 一抗和二抗 13 一抗：针对抗原的抗体 二抗：针对一抗的抗体 单克隆抗体多克隆抗体带标记的抗体（生物素、HRP、AP） 应 用v 研究检测样品中特异性蛋白质的存在v 细胞中特异蛋白质的半定量分析v 蛋白质分子的相互作用研究 14 抗体的化学结构及其模式图 15 免疫球蛋白根据重链结构命名： IgG(), IgA()，IgD(), IgE()， IgM() 抗体的化学结构及其模式图 16 五种免疫球蛋白只有两种类型的轻链： Kappa()和Lambda() 每个抗体分子的轻链必须相同；某一单独的抗体分子决不可能既有链又有链。这一点在免疫组化的淋巴瘤诊断中十分重要。 17 内容背景知识1 WB操作流程2 WB常见问题分析3 IF操作流程4 IF常见问题分析5 免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。 22 SDS-PAGE 转移方法v半干转v湿转 25 注意：对于大分子量的蛋白建议使用湿转 HRP（ 辣 根 过 氧 化 酶 ) AP（ 碱 性 磷 酸 酶 ）大 小 40Kd 140Kd最 佳 酶 活 性 PH： 5 7 PH： 8 10酶 活 和 二 抗 特 异 性 好 于 AP抑 制 剂 氰 化 物硫 化 物叠 氮 钠 氰 化 物砷 酸 盐 ， 有 机 磷二 价 阳 离 子 螯 合 剂稳 定 性 零 度 以 下 稳 定 零 度 以 下 不 稳 定底 物 很 多 部 分动 力 学 特 性 快 速 慢 价 格 便 宜 昂 贵发 光 底 物 ECL显 色 底 物 TMB， CN， DAB NBT， BCIP， NBT/BCIP 32 u 样品丰度u 检测灵敏度 34 内容背景知识1 WB操作流程2 WB常见问题分析3 IHC操作流程4 IHC常见问题分析5 信 号 弱 或 者 无 信 号 A 1：5000 B 1：10000 C 1:5000 D 1:10000 抗血清检测结果 推荐u 对照设置 内参照 beta-actin /beta-tubulin/GAPDH 阳性对照 检测一抗是否正常 阴性对照 检测一抗特异性 空白对照 不加一抗，光加二抗，检测二抗是否发生交叉反应 45 u 优化条件 46打 造 完 美 的 实 验 结 果 45K 45K35KBeta-actin 漂 洗 GAPDH 内容背景知识1 WB操作流程2 WB常见问题分析3 IF操作流程4 IF常见问题分析5 52 免疫荧光概念免疫荧光（Immunofluorescence）技术是利用抗原抗体特异性结合的原理，用经荧光染料标记的抗体对细胞或组织内的蛋白质进行定性或定量研究的方法。该技术与荧光显微镜观察相结合，可对特定的蛋白质进行细胞或组织内的精确定位。 53 常 用 的 荧 光 染 料显示绿色荧光：Fluorescein isothocyancie(FITC), Alexa-488显示红色荧光：Rhodamine B, Texas Red, Alexa-546,568,594显示蓝色荧光：Alexa350 54 直接法间接法 55 免疫荧光操作过程第二步 第三步第一步待测样本的准备爬片固定 封闭取材冰冻切片 免疫荧光染色 一抗结合 二抗结合 衬 染细胞爬片冰冻切片 染色 后处理 封片 56 v待测样品的准备 57 取材和固定v细胞爬片的制备v固定目 的： 通过物理和化学方法使细胞内蛋白质凝固，终止或减少外 源性和内源性细胞内分解酶的反应，防止细胞自溶 常用方法： 甲醇、多聚甲醛或丙酮 ，室温，一般为10-20min。 透化和封闭v透化：0.2Triton X100 （丙酮固定法不用透化处理 ）v封闭：二抗相同宿主的血清封闭 一抗及二抗孵育 60 v一抗4度湿盒内过夜，或37 1-2小时v二抗室温2小时（避光），或者37度1个半小时vPBS洗三遍 衬 染 61 伊文氏蓝，红色荧光。 DAPI染核，蓝色荧光。 封 片 95甘油封片 抗淬灭剂 62 v特异性荧光强度： 63 （-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（+）荧光明亮；（+ -+）荧光闪亮。 镜下观察 64Indirect immunofluorescence of iron-regulated cell wall mannoprotein FIT1 of S. cerevisiae 镜下观察 65Confocal image to detect phosphorylated AKT (green) in cardiomyocytes infected with adenovirus 66 内容背景知识1 WB操作流程2 WB常见问题分析3 IF操作流程4 IF常见问题分析5 67 IF常见问题分析1.设立实验对照2.出现背景3.信号微弱 68 设立实验对照阳性对照：没有阳性对照就无法做出真正的阴性结果判断。 阴性对照：没有阴性对照就无法做出真正的阳性结果判断。找到合适的阳性对照和阴 性对照是正确判断实验结果的保障荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 69 结果判断标准 1.设立好对照是前提2.阳性信号必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性 3.阴性结果不能视为抗原不表达 4.避免假阳性和假阴性的发生 不在特定部位，不视为阳性即使1个细胞阳性，也视为阳性 Barrier Filters 70 出现背景的几种原因 1.正常动物血清使用不合理 ：如二抗为羊抗兔IgG，应该用羊的正常血清。 3.缓冲液洗涤不够干净 ：增加清洗次数并延长时间，减少残液，缓冲液每次更换。 4.抗体稀释不合理，浓度太高2.缓冲液及洗涤液中加入2%吐温-20 71 如何最大限度减低背景 1.合适的一抗浓度 ：检测推荐稀释度上下两个梯度。 2.实验组织 ：及时固定新鲜的细胞3.优先选择单抗 ：多抗有非特异性着色。 4.PBS冲洗充分：冲洗不充分有非特异性着色。 6.避免细胞过于干燥 ：否则无法补救。 5.缓冲液及洗涤液中加入2%吐温-20 72 荧光减弱荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱提高一抗和二抗的浓度延长一抗和二抗的孵育时间 改变检测方法，用共聚焦显微镜观察，可提高敏感性 73 北京康为世纪生物科技有限公司 74 010-62667528 75 76 77 THANK YOU 01062667528