组织免疫荧光

免疫染色实验方法和步骤 免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。 1. 样品准备(Sample preparation) 对于贴壁细胞： 可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。 也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。 对于悬浮细胞： 把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，枯燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。 对于冷冻切片： 切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。 对于石蜡切片： 脱蜡：切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟，两次。90%乙醇5分钟，两次，70乙醇5分钟，一次。蒸馏水5分钟，两次。 抗原修复：根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10mM柠檬酸钠，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris, pH10.0，95加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。 2. 固定可以使用适当的固定液固定细胞或切片，例如碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)。固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液(P0106)洗涤两次，每次5分钟。 3. 封闭(Blocking) 参加免疫染色封闭液(P0102)，封闭60分钟。如果背景较高，可以4封闭过夜。 从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，防止样品的枯燥，否那么极易产生较高的背景。 在整个免疫染色过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)，侧向摆动速度比拟缓慢，而且也容易让溶液覆盖样品。如果样品比拟容易脱落，也可以把所有的步骤放置在桌面上静止进行，即封闭、抗体孵育、洗涤等步骤均不需摇动，但静止操作时宜适当延长作用时间或次数。4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液(P0103)稀释一抗。 用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)吸尽封闭液，立即参加稀释好的一抗，室温或4在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4缓慢摇动孵育过夜。 回收一抗。参加免疫染色洗涤液， 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再参加洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 参考二抗的说明书，按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液(P0108)稀释荧光标记的二抗，或者用免疫染色(非荧光)二抗稀释液(P0110)稀释辣根过氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或碱性磷酸酯酶(AP)标记的二抗。辣根过氧化物酶(A0201/A0208/A0216)可向碧云天订购。 用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即参加稀释好的二抗，室温或4在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 回收二抗。参加免疫染色洗涤液， 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再参加洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6. 蛋白检测(Detection of proteins) 对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。 对于非免疫荧光染色可以选用DAB等适当的显色底物，或AB检测体系等进行后续检测。 7. 多重染色(Multiple staining) 如果进行的是免疫荧光染色，通常都可以进行多重染色。对于可以产生有色沉淀物的染色反响，例如DAB染色，一般不适合再进行多重染色。多重荧光染色： 可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。例如用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3(P0193)进行红色荧光染色，随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(P0186)进行绿色荧光染色，在完成上述两种染色后可以使用Hoechst染色试剂盒(C0003)对细胞核进行染色，染色后为蓝色荧光。 用HE染色进行复染： 免疫荧光染色后可以用苏木素伊红(HE)染色试剂盒(C0105)进行HE染色。免疫荧光染色步骤Immunofluorescence MethodFrozen Sections Snap frozen fresh tissues in liquid nitrogen or isopentane pre-cooled in liquid nitrogen, embedded in OCT compound in cryomolds. Store frozen blocks at - 80 C. Cut 4-8 um thick cryostat sections and mount on superfrost plus slides or gelatin coated slides. Store slides at - 80 C until needed. Before staining, warm slides at room temperature for 30 minutes and fix in ice cold acetone for 5 minutes. Air dry for 30 minutes. Wash in PBS Paraffin Sections Procedure for Immunofluorescence Staining 1. Rinse Sections in washing buffer for 2x2 min. 2. Primary Antibody (没有标记一抗): incubate sections in primary antibody at appropriate dilution in primary antibody dilution buffer for 1 hour at room temperature or overnight. Noteo not rinse sections between serum block and primary antibody incubation. 3. Rinse in washing buffer for 3x2 min. 4 Secondary Antibody: incubate sections in biotinylated secondary antibody (生物素标记的二抗) (1:500, Vector Labs) in secondary antibody dilution buffer for 30 minutes at room temperature. 5. Rinse in washing buffer for 3x2 min. 6. Detection: incubate sections in FITC-Avidin D (1:500, Vector Labs) in PBS for 30 minutes at room temperature. Protecting slides from light starting from this step to the end by covering slides with aluminum foil or black box. 7. Rinse in washing buffer for 3x2 min. 8. Counterstain with PI or DAPI if desired for 20-30 minutes at room temperature. 9. Rinse in washing buffer for 3x2 min. 10. Coverslip with Vector aqueous Anti-fade fluorescent mounting medium and seal with nail polish. 11. Store slides in dark at 4 C.石蜡切片免疫组化染色步骤1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留2030秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留12分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温枯燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、枯燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜枯燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。2、常用酶消化：2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%0.1%，消化时间为37、1040分钟，主要用于细胞内抗原的显示。2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37、30180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin层粘蛋白，Collagen IVIV型胶原等。g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。m2.3 皂素Saponin：一般使用浓度为2103、抗原热修复：可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液pH6.0效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液粉剂配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液工作液的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在9298之间并持续1015分钟注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求。取出容器，室温冷却1020分钟注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml3000ml的枸橼酸盐缓冲液工作液注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时约加热56分钟后，计时12分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，翻开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟3，下接免疫组化染色步骤。3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液工作液的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达9298起开始计时1520分钟，然后端离电炉，室温冷却2030分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。4、免疫组化染色步骤：以美国ZYMED公司SP试剂盒为例4.1石蜡切片脱蜡至水。4.2 3%H2O2室温孵育510分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。4.4 510正常山羊血清PBS稀释封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37孵育12小时或4过夜。4.5 PBS冲洗，5分钟3次。4.6滴加适当比例稀释的生物素标记二抗1%BSA-PBS稀释，37孵育1030分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37或室温孵育1030分钟。4.7 PBS冲洗，5分钟3次。4.8滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素PBS稀释，37孵育1030分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37或室温孵育1030分钟。4.9 PBS冲洗，5分钟3次。4.10显色剂显色DAB或AEC。4.11自来水充分冲洗，复染，封片。冰冻切片免疫组化染色步骤冰冻切片48mm，室温放置30分钟后，入4丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟3。用3过氧化氢孵育510分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟2。下接免疫组化染色操作步骤。 细胞内抗原的检测-间接免疫荧光法 细胞内抗原的检测过程与细胞外表抗原检测过程根本一致，只是在与一抗孵育前，需要预先对细胞用非离子去污剂进行透化处理。【操作方法】1取已固定好的细胞爬片或甩片或经过预处理的组织切片石蜡或冰冻切片；2用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的细胞2min室温，有些标本可能需要长达15min，时间视抗原而定；3余下步骤接上述“细胞外表抗原的检测-间接免疫荧光法步骤2；【考前须知】1在使用前，一抗二抗均应测试其适宜的稀释度。2多聚甲醛的固定是不稳定的，标本经多聚甲醛固定后，应再用去污剂处理，如果标本在水溶液中浸泡的时间过长，那么会使交联结构解体。因此，应防止固定后的标本在水溶液中浸泡的时间过长。3信号微弱的解决方法：提高一抗和二抗的浓度以增强敏感性 ，这必须测试各种浓度抗体的滴度；延长一抗和二抗的孵育时间。由于细胞染色时抗原吸附在固相载体上，抗原抗体结合时间较在溶液中长。孵育时间可因实验设计作适当调整，但少于20min抗体和抗原几乎不能有效结合。在以上两点中，应摸索出一个最正确条件以产生有效信号且保持良好的背景。这就需要反复试验，因为每组抗体和抗原的情况会有所不同；改变检测方法，用共聚焦显微镜观察，可提高敏感性。4背景不好的解决方法 细胞样本进行荧光染色时，背景问题主要来自两个方面，即非特异性染色和特异性交叉反响。 非特异性吸附：非特异性吸附背景问题的产生与抗原抗体的特异性结合无关。即一抗或二抗与样品相互作用而发生吸附，而不是与抗原发生特异性结合。 *将所有抗体溶液或含蛋白的检测试剂用100，000g离心30min以去除蛋白聚合物。 *滴定一抗和所用的检测试剂，以确定能够产生适宜信号的最低浓度。 *固定后，用饱和量并不被检测试剂结合的非特异性抗体封闭样品，有效的封闭液包括5%的与标记二抗来源相同的同种血清、3%的BSA和3%的脱脂奶粉。 *用上述封闭液稀释抗体和检测试剂。 *固定后，在所有的缓冲液及洗涤液中参加2%吐温-20。 *缩短一抗或标记试剂的孵育时间。 *充分洗涤延长洗涤时间，重复次数。 *改变检测方法。 特异性背景：造成特异性背景问题的原因有三种因素，即污染抗体所致假阳性、交叉反响和样品中含有能与Ig结合的蛋白质。 *如用多克隆抗体，应滴定抗体假阳性。 *如用多克隆抗体，亲和纯化特异性抗体假阳性。 *如用多克隆抗体，用适当的丙酮肝脏粉吸收以阻抑假阳性。*换用其他抗体交叉反响及假阳性。 细胞外表抗原的检测-间接免疫荧光法【试剂】1一抗和荧光标记的二抗2固定液：如4%多聚甲醛、乙醇等。3洗涤液及抗体稀释液(pH 7.4 PBS-Tween 20)【操作方法】1取已固定好的细胞爬片或甩片或经过预处理的组织切片石蜡或冰冻切片；2参加25ml一抗，完全盖住盖玻片，室温孵育60min；注意不可使盖玻片接触培养板孔边缘。每个检测应包括3组对照：与一抗同一种属、类型的无关抗体组，以检测染色的特异性；未加一抗的对照组，以检测二抗染色的背景；如果可能，用阳性样品作为阳性对照组。3参加标记FITC标记的抗抗体二抗25ml，室温孵育20min；标记二抗在使用前，应预试其适宜的稀释度；4用洗涤液洗3次，各5min；5在一干净和作好标记的载玻片上滴一滴封固液约50ml。用一尖头镊子将盖玻片取出。将盖玻片边缘置于一干净纸巾上蘸干液体。翻转盖玻片，使细胞面朝下，置于封固液上，慢慢放下盖玻片，与载玻片相邻与封固液的一端接触，然后使盖玻片置于封固液上，这样可赶出气泡。在观察前空气枯燥30min；6在荧光显微镜下观察、拍照。 经典的荧光抗体技术根本原理(1)直接法直接法是荧光抗体技术最简单、最根本的方法。它通过标记抗体直接与相应抗原待检抗原标本结合，来鉴定未知抗原。其优点为：由于在反响中只有两种因子参与，结果判断较简单；特异性强，与其他抗原交叉染色较少；操作步骤少，方法简便、省时。其缺点有；敏感性较差；一种标记抗体只能鉴定一种抗原；不能用于鉴定未知抗体。(2)间接法间接法是目前最常用的方法。首先用未标记的抗体第一抗体与待检抗原反响或用未知抗体与抗原反响，反响一定时间后，洗去未结合的抗体，再与标记的抗免疫球蛋白抗体二抗反响。在第一步反响中，假设抗原抗体发生了反响，那么抗体被固定在标本上，那么第二步反响中标记的抗体二抗必然与第一步反响形成的抗原抗体复合物中的抗体发生反响，这样就可以通过二抗的示踪，对标本中未知抗原或抗体进行鉴定。其优点为；敏感性较高，是直接法的5-10倍；用一种标记的抗体，就能与一种以上的相应的抗体或抗原配合鉴定多种未知的抗原或抗体；既能鉴定未知抗原，又能鉴定未知抗体。其缺点有在反响中有多种因子参与，容易产生非特异性染色，结果判断有时较困难；操作步骤多，费时。(3)双标记法 双标记法是用两种荧光素常用FITC和PE分别标记特异性不同的抗体，用于检测同一标本中的不同抗原。此法常用于细胞外表抗原和受体的研究。 荧光抗体的质量鉴定与保存 荧光抗体的质量通常用抗体效价和结合比率F/P比值来表示。1、抗体效价：一般用琼脂双向扩散法测定。中央孔内加抗原1 mg/ml，抗体稀释度在1:16-1:32呈阳性者较为理想。2、荧光素F与蛋白质P结合比率F/P比值法 F/P比值系指荧光素与抗体蛋白的克分子比值，是标记抗体质量鉴定的重要指标之一。该比值以1-2抗球蛋白荧光抗体或略高于2抗菌荧光抗体为宜，否那么非特异性染色增强。假设荧光素为TRITC，F/P比值在2.1-9.4之间均可用，但以数值较低者为佳。【试剂】10.01mol/L pH7.2 PBS 2牛血清白蛋白BSA30.025mol/L pH9.0 CB【方法】1将FITC用少量CB溶解后，再用0.01mol/L pH7.2 PBS 稀释至100ml，作为原液；2用PBS配成0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0 10.0mg/ml，于490nm测定吸光度；3将BSA用凯氏定氮法测得蛋白含量，分别用0.01mol/L pH7.2 PBS配成0.1、0.2、0.31.5mg/ml，于280 nm测定吸光度；4以横坐标示FITC量mg/ml或BSA含量mg/ml，纵坐标示相应的吸光度，分别绘制FITC和BSA蛋白含量的标准曲线；5于490nm或280nm分别测定标记抗体的吸光度。查标准曲线即可得出标记物中荧光素量和抗体蛋白质量；6计算F/P比值：OD495nmF/P比值=2.87 OD280nm-0.35OD495nm 如用TRITC标记抗体，那么按下式计算：OD515nmF/P比值= OD280nm荧光抗体的保存 经鉴定合格的荧光抗体，可参加0.01%硫柳汞或0.1%NaN3防腐，小量分装0.5ml/支，置0-4可保存1年；-20可保存2-3年，但取出后应快速融化，防止反复冻融；冷冻枯燥后可保存较长时间。 免疫荧光标记技术 免疫标记技术immunolabelling techniques是使用荧光素、酶、放射性核素、铁蛋白、胶体金及化学或生物发光剂等作为示踪物，对抗原或抗体标记后进行的抗原抗体反响；并借助于荧光显微镜、酶标检测仪、射线测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞及分子水平上，对抗原抗体反响进行定性或定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性以及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。 根据实验中所用标记物和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术放射免疫分析、免疫酶技术、发光免疫分析技术和免疫电镜技术。 免疫荧光标记技术immunofluorescence technique始创于20世纪40年代初，1942年Coons等首次报道用异氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。当时由于异氰酸荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。直至1958年Riggs等合成了性能较为优良的异硫氰酸荧光黄fluorescein isothiocyanate，FITC。Marshall等又对荧光抗体标记的方法进行了改良，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。半个多世纪以来，经过许多学者不断改良和开展，使此项技术成为微生物学、免疫学、病理学及免疫组织化学中常用的一种免疫学实验方法。 免疫荧光技术的根本原理是将抗原抗体反响的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与的抗体或抗原，但较少用结合，但不影响起免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。