《基因工程技术》PPT课件.pptx

1、 反 转 录 PCR(RT-PCR) 2、 反 向 PCR3、 复 合 PCR 4、 不 对 称 PCR 5、 嵌 套 PCR6、 实 时 定 量 PCR 类 似 于 DNA的 体 内 复 制 。 首 先 待 扩 增 DNA模 板加 热 变 性 解 链 ， 随 之 将 反 应 混 合 物 冷 却 至 某一 温 度 ， 这 一 温 度 可 使 引 物 与 它 的 靶 序 列 发生 退 火 ， 再 将 温 度 升 高 使 退 火 引 物 在 DNA聚 合酶 作 用 下 得 以 延 伸 。 这 种 热 变 性 -复 性 -延 伸的 过 程 就 是 一 个 PCR循 环 ， PCR就 是 在 合 适 条件 下 的 这 种 循 环 的 不 断 重 复 。 模 板 DNA的 变 性 ： 模 板 DNA经 加 热 至 93-95 左 右 一 定 时间 后 ,使 模 板 DNA双 链 或 经 PCR扩 增 形 成 的 双 链 DNA解 离 ,使之 成 为 单 链 ,以 便 它 与 引 物 结 合 ,为 下 轮 反 应 作 准 备 ； 模 板 DNA与 引 物 的 退 火 (复 性 )： 模 板 DNA经 加 热 变 性 成 单 链后 ,温 度 降 至 55 左 右 ,引 物 与 模 板 DNA单 链 的 互 补 序 列 配 对结 合 ； 引 物 的 延 伸 ： DNA模 板 -引 物 结 合 物 在 TaqDNA聚 合 酶 的 作 用下 ， 以 dNTP为 反 应 原 料 ， 靶 序 列 为 模 板 ， 按 碱 基 配 对 与 半 保留 复 制 原 理 ， 合 成 一 条 新 的 与 模 板 DNA 链 。注 :每 完 成 一 个 循 环 需 2 4分 钟 ， 2 3小 时 就 能 将 待 扩 目的 基 因 扩 增 放 大 几 百 万 倍 1、 缓 冲 溶 液 Mg2+是 DNA聚 合 酶 的 激 活 剂 2、 耐 热 DNA聚 合 酶3、 脱 氧 核 糖 三 磷 酸 核 苷 酸 (dNTPs)4、 模 板 DNA5、 上 游 引 物 、 下 游 引 物 （ 1 ） 、 PCR反 应 缓 冲 液 Mg2+是 DNA聚 合 酶 的 激 活 剂 。 1.5mmol/L-2.5mmol/L反 应 体 系 。 Mg2+浓 度 过 低 会 使 Taq酶 活 性 丧 失 、 PCR产 量下 降 ； Mg2+过 高 影 响 反 应 特 异 性 。 Mg2+可 与 负 离 子 结 合 ， 所 以 反 应 体 系 中 dNTP、 EDTA等 的 浓 度 影 响 反 应 中 游 离 的 Mg2+浓 度 。 （ 2） Taq DNA聚 合 酶 （ thermus aquaticus) 0.5-5 U/100L 酶 量 增 加 使 反 应 特 异 性 下 降 ;酶 量 过 少 影 响 反 应 产 量 。（ 3） dNTP dNTP浓 度 取 决 于 扩 增 片 段 的 长 度 四 种 dNTP浓 度 应 相 等 ,一 般 为 50-200mol/L 浓 度 过 高 易 产 生 错 误 碱 基 的 掺 入 ， 浓 度 过 低 则 降 低 反 应 产 量 dNTP可 与 Mg 2+结 合 ， 使 游 离 的 Mg2+浓 度 下 降 ， 影 响 DNA聚合 酶 的 活 性 。 （ 4） 模 板 单 、 双 链 DNA均 可 。 不 能 混 有 蛋 白 酶 、 核 酸 酶 、 DNA聚 合 酶 抑 制 剂 、 DNA结 合 蛋 白 类 。 一 般 100ng DNA模 板 /100L。 模 板 浓 度 过 高 会 导 致 反 应 的 非 特 异 性 增 加 。（ 5） 引 物 浓 度 0.1-1mol/L 浓 度 过 高 易 导 致 模 板 与 引 物 错 配 ,反 应 特 异 性 下 降 。 引 物 长 度 一 般 以 15 30bp为 宜 ,过 短 则 降 低 特 异 性 ， 过 长 则 会 引 起 引 物间 退 火 而 影 响 有 效 扩 增 。 避 免 引 物 内 部 出 现 二 级 结 构 ， 避 免 序 列 内 有 较 长 的 回 文 结 构 ， 使 引 物 自身 不 能 形 成 发 夹 结 构 。 G /C和 A/T碱 基 均 匀 分 布 ， G /C含 量 在 45 55%之 间 ， 引 物 碱 基 序 列 尽可 能 选 择 碱 基 随 机 分 布 ， 避 免 出 现 嘌 呤 或 嘧 啶 连 续 排 列 。 要 避 免 两 个 引 物 间 特 别 是 3末 端 碱 基 序 列 互 补 以 及 同 一 引 物 自 身 3末 端碱 基 序 列 互 补 的 ， 使 它 们 不 能 形 成 引 物 二 聚 体 或 发 卡 结 构 。 引 物 3末 端 碱 基 一 般 应 与 模 板 DNA严 格 配 对 ， 并 且 3末 端 为 G 、 C或 T时引 发 效 率 较 高 。 引 物 5末 端 碱 基 可 不 与 模 板 DNA匹 配 ， 可 添 加 与 模 板 无 关 的 序 列 (如 限制 性 核 酸 内 切 酶 的 识 别 序 列 、 ATG 起 始 密 码 子 或 启 动 子 序 列 等 )， 便 于 克 隆 和 表 达 ， 但 其 保 护 碱 基 有 一 定 的 要 求 。 引 物 的 碱 基 顺 序 不 能 与 非 扩 增 区 有 同 源 性 。 （ 1） 变 性 使 双 链 DNA解 链 为 单 链 ,95 3 5分 钟 (2) 退 火 温 度 由 引 物 长 度 和 G C含 量 决 定 , 适 宜 的 退 火 温 度 大 约 低 于 引 物Tm值 45-55 ， 介 于 45-55 。 增 加 温 度 能 减 少 引 物 与 模 板 的 非 特异 性 结 合 ;降 低 温 度 可 增 加 反 应 的 灵 敏 性 。（ 3） 延 伸 72 ， 延 伸 时 间 由 扩 增 片 段 长 度 决 定（ 4） 循 环 次 数 主 要 取 决 于 模 版 DNA的 浓 度 一 般 为 25-35次 次 数 过 多 ： 扩 增 效 率 降 低 错 误 掺 入 率 增 加 标 准 的 PCR反 应 条 件10 缓 冲 液 10 L4种 dNTP混 合 物 各 200umol/L引 物 各 10 100pmol模 板 DNA 0.1 2gTaq DNA聚 合 酶 2.5UMg2+ 1.5mmol/L （ 一 ） 防 止 污 染试 剂 小 量 分 装吸 头 及 EP管 一 次 性 使 用器 皿 及 工 作 区 域 要 分 开 ，无 菌 操 作（ 二 ） 设 立 对 照阳 性 对 照 ： 阳 性 模 板阴 性 对 照 ： 阴 性 模 板试 剂 对 照 ： 除 模 板 外的 所 有 组 分 灵 敏 度 高1.皮 克 (pg=10-12)量 级 扩 增 到 微 克 (ug=10-6)水平2.能 从 100万 个 细 胞 中 检 出 一 个 靶 细 胞3.病 毒 检 测 的 灵 敏 度 可 达 3个 RFU4.细 菌 检 测 的 最 小 检 出 率 为 3个 细 菌简 便 、 快 速1.一 次 性 加 好 反 应 液 ， 2 4 h完 成 扩 增2.扩 增 产 物 一 般 用 电 泳 分 析对 标 本 的 纯 度 要 求 低u血 液 、 体 腔 液 、 洗 嗽 液 、 毛 发 、 细 胞 、 活 组织 等 组 织 的 粗 提 DNA 1. 基 础 研 究 基 因 或 cDNA 克 隆 ： 从 基 因 数 据 库 中 获 得 某 一 基 因 或 cDNA 核 苷 酸 序 列 ,用 PCR 方 法 扩 增 并 克 隆 该 基 因 或 cDNA。 基 因 表 达 ： 用 RT-PCR检 测 某 一 特 定 基 因 在 转 录 水 平 的 表 达 。2. 医 学 感 染 性 疾 病 病 原 体 的 诊 断 ： H IV、 结 核 杆 菌 、 乙 肝 病 毒 等 。 遗 传 病 相 关 基 因 检 测 ： 镰 刀 型 细 胞 贫 血 、 血 友 病 。 恶 性 肿 瘤 的 诊 断 。3. 法 医 学 中 的 基 因 和 亲 子 鉴 定4. 考 古 学 中 生 物 种 类 间 的 亲 缘 关 系 、 进 化 途 径 判 定5. 基 因 动 、 植 物 的 检 测 转 基 因 动 物 的 检 测 ： 检 测 某 一 基 因 的 遗 传 稳 定 性 。 转 基 因 植 物 的 检 测 ： 玉 米 、 大 豆 等 。