《药理学第一章》PPT课件

目 录 蛋白质的结构与功能 第 一 章 Structure and Function of Protein 目 录 一、什么是蛋白质 ? 蛋白质 (protein) 是由许多氨基酸 (amino acids)通过肽键 (peptide bond)相连 形成的高分子含氮化合物 。 目 录 二、蛋白质的生物学重要性 1. 蛋白质是生物 体重要组成成分 分布广： 所有器官 、 组织都含有蛋白质； 细胞的各个部分都含有蛋白质 。 含量高： 蛋白质是细胞内最丰富的有机 分子 ， 占人体干重的 45 ， 某些组织含量更 高 ， 例如脾 、 肺及横纹肌等高达 80 。 目 录 1） 作为生物催化剂 （ 酶 ） 2） 代谢调节作用 3） 免疫保护作用 4） 物质的转运和存储 5） 运动与支持作用 6） 参与细胞间信息传递 2. 蛋白质具有重要的生物学功能 3. 氧化供能 目 录 蛋 白 质 的 分 子 组 成 The Molecular Component of Protein 第 一 节 目 录 组成蛋白质的元素 主要有 C、 H、 O、 N和 S。 有些蛋白质含有少量 磷 或金属元素 铁、 铜、锌、锰、钴、钼 ，个别蛋白质还含有 碘 。 目 录 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为 16 。 由于体内的含氮物质以蛋白质为主 ， 因此 ， 只要测定生物样品中的含氮量 ， 就可以根据以 下公式推算出蛋白质的大致含量： 100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数 6.25 100 1/16% 蛋白质元素组成的特点 目 录 一、氨基酸 组成蛋白质的基本单位 存在自然界中的氨基酸有 300余种 ， 但 组成人体蛋白质的氨基酸仅有 20种 ， 且均 属 L-氨基酸 （ 甘氨酸除外 ） 。 目 录 H 甘氨酸 CH3 丙氨酸 L-氨基酸的通式 R C + N H 3 C O O - H 目 录 1. 非极性疏水性氨基酸 2. 极性中性氨基酸 3. 酸性氨基酸 4. 碱性氨基酸 （一）氨基酸的分类 * 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下 : 目 录 甘氨酸 glycine Gly G 5.97 丙氨酸 alanine Ala A 6.00 缬氨酸 valine Val V 5.96 亮氨酸 leucine Leu L 5.98 异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02 苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48 脯氨酸 proline Pro P 6.30 1. 非极性疏水性氨基酸 目 录 目 录 色氨酸 tryptophan Try W 5.89 丝氨酸 serine Ser S 5.68 酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66 半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸 methionine Met M 5.74 天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65 苏氨酸 threonine Thr T 5.60 2. 极性中性氨基酸 目 录 目 录 天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97 谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22 赖氨酸 lysine Lys K 9.74 精氨酸 arginine Arg R 10.76 组氨酸 histidine His H 7.59 3. 酸性氨基酸 4. 碱性氨基酸 目 录 目 录 几种特殊氨基酸 脯氨酸 （亚氨基酸） CH 2 CH COO - NH 2 + CH 2 CH 2 目 录 - OOC - CH - CH 2 - S + NH 3 S - CH 2 - CH - C O O - + NH 3 半胱氨酸 + 胱氨酸 二硫键 -HH - OOC - CH - CH 2 - SH + NH 3 HS - CH 2 - CH - COO - + NH 3 目 录 （二）氨基酸的理化性质 1. 两性解离及等电点 氨基酸是两性电解质，其解离程度取决 于所处溶液的酸碱度。 等电点 (isoelectric point, pI) 在某一 pH的溶液中 ， 氨基酸解离成 阳离子和阴离子的趋势及程度相等 ， 成为 兼性离子 ， 呈电中性 。 此时溶液的 pH值 称为该氨基酸的 等电点 。 目 录 pH=pI +OH- pHpI +H+ +OH- +H+ pHpI 氨基酸的兼性离子 阳离子 阴离子 CH NH 2 C O O HR CH NH 3 + CO O -R CH NH 2 COO -RCH COO HR NH 3 + 目 录 2. 紫外吸收 色氨酸、酪氨酸的 最大吸收峰在 280 nm 附近。 大多数蛋白质含有 这两种氨基酸残基 ， 所 以测定蛋白质溶液 280nm的光吸收值是分 析溶液中蛋白质含量的 快速简便的方法 。 芳香族氨基酸的紫外吸收 目 录 3. 茚三酮反应 氨基酸与茚三酮水合物共热 ， 可生成 蓝紫色 化合物 ， 其最大吸收峰在 570nm处 。 由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比 关系 ， 因此可作为氨基酸定量分析方法 。 目 录 二、肽 * 肽键 (peptide bond)是由一个氨基酸的 - 羧基与另一个氨基酸的 -氨基脱水缩合 而形成的化学键 。 （一）肽 (peptide) 目 录 NH 2 - CH - C H O OH 甘 氨 酸甘 氨 酸 NH - CH - C H OH O H 甘 氨 酸 + -HOH 甘氨酰甘氨酸 肽键 NH 2 - CH - C - N - CH - C O OHHHH O 目 录 * 肽 是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化 合物。 * 两分子氨基酸缩合形成 二肽 ，三分子氨 基酸缩合则形成 三肽 * 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团 不全，被称为 氨基酸残基 (residue)。 * 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为 寡 肽 (oligopeptide)， 由更多的氨基酸相连 形成的肽称 多肽 (polypeptide)。 目 录 N 末端：多肽链中有 自由氨基 的一端 C 末端：多肽链中有 自由羧基 的一端 多肽链有两端 * 多肽链 (polypeptide chain)是指许多氨基 酸之间以肽键连接而成的一种结构 。 目 录 N末端 C末端 牛核糖核酸酶 目 录 （二） 几种生物活性肽 1. 谷胱甘肽 (glutathione, GSH) 目 录 GSH过氧 化物酶 H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶 NADPH+H+ NADP+ 目 录 体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽 (neuropeptide) 2. 多肽类激素及神经肽 目 录 三、蛋白质的分类 * 根据蛋白质组成成分 单纯蛋白质 结合蛋白质 = 蛋白质部分 + 非蛋白质部分 * 根据蛋白质形状 纤维状蛋白质 球状蛋白质 目 录 蛋 白 质 的 分 子 结 构 The Molecular Structure of Protein 第 二 节 目 录 蛋白质的分子结构包括 一级结构 (primary structure) 二级结构 (secondary structure) 三级结构 (tertiary structure) 四级结构 (quaternary structure) 高级 结构 目 录 定义 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列 顺序。 一、蛋白质的一级结构 主要的化学键 肽键 ，有些蛋白质还包括二硫键。 一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学 功能的基础。 目 录 目 录 二、蛋白质的二级结构 蛋白质分子中某一段肽链的局部空间 结构 ， 即该段肽链主链骨架原子的相对空 间位臵 ， 并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。 定义 主要的化学键 ： 氢键 目 录 （一）肽单元 参与肽键的 6个原子 C1、 C、 O、 N、 H、 C2位于同一平 面 ， C1和 C2在平面上所处的 位置为反式 (trans)构型 ， 此同 一平面上的 6个原子构成了所谓 的 肽单元 (peptide unit) 。 目 录 蛋白质二级结构的主要形式 -螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ) （二） -螺旋 目 录 目 录 （三） -折叠 目 录 （四） -转角和无规卷曲 -转角 无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部 分肽链结构。 目 录 （五）模体 在许多蛋白质分子中，可发现二个或 三个具有二级结构的肽段，在空间上相互 接近，形成一个特殊的空间构象，被称为 模体 (motif)。 目 录 钙结合蛋白中结 合钙离子的模体 锌指结构 目 录 （六）氨基酸残基的侧链对二级结构形成 的影响 蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。 一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成 -螺旋 或 -折叠，它就会出现相应的二级结构。 目 录 三、蛋白质的三级结构 疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力等。 主要的化学键 整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位臵。 即肽链中所有原子在三维空间的排布位臵。 （一） 定义 目 录 目 录 肌红蛋白 (Mb) N 端 C 端 目 录 纤连蛋白分子的结构域 （二）结构域 大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或 数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各 行使其功能，称为结构域 (domain) 。 目 录 （三）分子伴侣 分子伴侣 (chaperon)通过提供一个保护环境从 而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。 * 分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随 后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生， 使肽链正确折叠。 * 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚 后，再诱导其正确折叠。 * 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确 形成起了重要的作用。 目 录 亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次 是氢键和离子键。 四、蛋白质的四级结构 蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接 触部位的布局和相互作用，称为 蛋白质的四级 结构 。 有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链， 每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白 质的 亚基 (subunit)。 目 录 血 红 蛋 白 的 四 级 结 构 目 录 蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein 第 三 节 目 录 （一）一级结构是空间构象的基础 一、蛋白质一级结构与功能的关系 牛核糖核酸酶的 一级结构 二 硫 键 目 录 天然状态， 有催化活性 尿素、 -巯基乙醇 去除尿素、 -巯基乙醇 非折叠状态，无活性 目 录 （二）一级结构与功能的关系 例：镰刀形红细胞贫血 N-val his leu thr pro glu glu C(146) HbS 肽链 HbA 肽 链 N-val his leu thr pro val glu C(146) 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病， 称为 “ 分子病 ” 。 目 录 （一）肌红蛋白与血红蛋白的结构 二、蛋白质空间结构与功能的关系 目 录 目 录 Hb与 Mb一样能可逆地与 O2结合 ， Hb与 O2结合后称为 氧合 Hb。 氧合 Hb占总 Hb的百 分数 （ 称 百分饱和度 ） 随 O2浓度变化而改变 。 （二）血红蛋白的构象变化与结合氧 目 录 肌红蛋白 (Mb)和血红蛋白 (Hb)的氧解离曲线 目 录 * 协同效应 (cooperativity) 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合 后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能 力的现象，称为 协同效应 。 如果是促进作用则称为 正协同效应 (positive cooperativity) 如果是抑制作用则称为 负协同效应 (negative cooperativity) 目 录 目 录 O2 血红素与氧结 合后 ， 铁原子半径 变小 ， 就能进入卟 啉环的小孔中 ， 继 而引起肽链位臵的 变动 。 目 录 变构效应 (allosteric effect) 蛋白质空间结构的改变伴随其功 能的变化 ， 称为 变构效应 。 目 录 （三）蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象疾病 ：若蛋白质的折叠发生 错误 ， 尽管其一级结构不变 ， 但蛋白质的构 象发生改变 ， 仍可影响其功能 ， 严重时可导 致疾病发生 。 目 录 蛋白质构象改变导致疾病的机理 ：有些蛋 白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解 酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现 为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。 这类疾病包括 ：人纹状体脊髓变性病、老 年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。 目 录 疯牛病中的蛋白质构象改变 疯牛病是由朊病毒蛋白 (prion protein, PrP) 引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的 PrP富含 -螺旋，称为 PrPc。 PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全 为 -折叠的 PrPsc，从而致病。 PrPc -螺旋 PrPsc -折叠 正常 疯牛病 目 录 第四节 蛋白质的理化性质与分离纯化 The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein 目 录 （一）蛋白质的两性电离 一、理化性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外 ， 氨基酸残基侧链中某些基团 ， 在一定的溶液 pH条 件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团 。 * 蛋白质的等电点 ( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一 pH时 ， 蛋白质解离成 正 、 负离子的趋势相等 ， 即成为兼性离子 ， 净电 荷为零 ， 此时溶液的 pH称为 蛋白质的等电点 。 目 录 （二）蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一 ， 分子量可自 1万至 100万之巨 ， 其分子的直径可达 1 100nm， 为胶粒范围之内 。 * 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜 目 录 + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 水化膜 + + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒 酸 碱 酸 碱 酸 碱 脱水作用 脱水作用 脱水作用 溶液中蛋白质的聚沉 目 录 （三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 * 蛋白质的变性 (denaturation) 在某些物理和化学因素作用下，其特定的 空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无 序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生 物活性的丧失。 目 录 造成变性的因素 如 加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、 重金属离子及生物碱试剂等 。 变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白 质的一级结构。 目 录 应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及 灭菌。 此外 , 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质 制剂（如疫苗等）的必要条件。 目 录 若蛋白质变性程度较轻 ， 去除变性因素 后 ， 蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构 象和功能 ， 称为 复性 (renaturation) 。 目 录 天然状态， 有催化活性 尿素、 -巯基乙醇 去除尿素、 -巯基乙醇 非折叠状态，无活性 目 录 * 蛋白质沉淀 在一定条件下 ， 蛋白疏水侧链暴露在外 ， 肽 链融会相互缠绕继而聚集 ， 因而从溶液中析出 。 变性的蛋白质易于沉淀 ， 有时蛋白质发生沉 淀 ， 但并不变性 。 * 蛋白质的凝固作用 (protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固 的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 目 录 （四）蛋白质的紫外吸收 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸 和色氨酸 ， 因此在 280nm波长处有特征性吸收 峰 。 蛋白质的 OD280与其浓度呈正比关系 ， 因 此可作蛋白质定量测定 。 目 录 （五）蛋白质的呈色反应 茚三酮反应 (ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚 三酮反应。 双缩脲反应 (biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与 硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为 双 缩脲反应 ，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解 程度。 目 录 二、蛋白质的分离和纯化 （一）透析及超滤法 * 透析 (dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分 开的方法。 * 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留 分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。 目 录 （二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使用 丙酮沉淀 时 ， 必须在 0 4 低温下进行 ， 丙酮用量一般 10倍于蛋白质溶液体积 。 蛋白 质被丙酮沉淀后 ， 应立即分离 。 除了丙酮以 外 ， 也可用乙醇沉淀 。 *盐析 (salt precipitation)是将硫酸铵 、 硫酸钠 或氯化钠等加入蛋白质溶液 ， 使蛋白质表面 电荷被中和以及水化膜被破坏 ， 导致蛋白质 沉淀 。 目 录 * 免疫沉淀法： 将某一纯化蛋白质免疫动物 可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗 体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体 复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分 离获得抗原蛋白。 目 录 （三）电泳 蛋白质在高于或低于其 pI的溶液中为带电 的颗粒 ， 在电场中能向正极或负极移动 。 这种 通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白 质的技术 , 称为 电泳 (elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同 ， 可分为薄膜电泳 、 凝 胶电泳等 。 目 录 几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ，常用于蛋白质 分子量的测定。 *等电聚焦电泳 ，通过蛋白质等电点的差异 而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳 是蛋白质组学研究的重要技 术。 目 录 （四）层析 层析 (chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固 态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋 白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分 离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同 速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。 目 录 蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析： 利用各蛋白质的电荷量及性 质不同进行分离。 * 凝胶过滤 (gel filtration)又称分子筛层析， 利 用 各 蛋白质分子大小不同分离。 目 录 目 录 目 录 （五）超速离心 * 超速离心法 (ultracentrifugation)既可以用 来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白 质的分子量 。 *蛋白质在离心场中的行为用 沉降系数 (sedimentation coefficient, S)表示 ,沉降系 数与蛋白质的密度和形状相关 。 目 录 因为沉降系数 S大体上和分子量成正比 关系 ， 故可应用超速离心法测定蛋白质分子 量 ， 但对分子形状的高度不对称的大多数纤 维状蛋白质不适用 。 目 录 三、多肽链中氨基酸序列分析 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用 Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸 顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨 基酸顺序的结果。 目 录 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定 DNA序列 排列出 mRNA序列 目 录 四、蛋白质空间结构测定 * 二级结构测定 通常采用 圆二色光谱 (circular dichroism， CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量 。 -螺旋的 CD峰有 222nm处的负峰 、 208nm处的 负峰和 198 nm处的正峰三个成分；而 -折叠的 CD谱不很固定 。 目 录 * 三级结构测定 X射线衍射法 (X-ray diffraction)和核磁共 振技术 (nuclear magnetic resonance, NMR)是 研究蛋白质三维空间结构最准确的方法 。 目 录 * 用分子力学 、 分子动力学的方法 ， 根据物理化 学的基本原理 ， 从理论上计算蛋白质分子的 空间结构 。 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构 * 通过对已知空间结构的蛋白质进行分析 ， 找 出一级结构与空间结构的关系 ， 总结出规律 ， 用于新的蛋白质空间结构的预测 。