昆虫线粒体基因组研究方法

昆虫线粒体基因组研究方法 一 . 昆虫线粒体基因组的研究意义 （一） 适合做进化生物学研究。被广泛用 于研究基因组结构和功能、群体遗传结构， 谱系地理学和各种分类学水平上的系统发 育关系研究。 （二）功能基因的研究 二 . 研究方法 （一）获取待研究昆虫的线粒体基因组 （二）对线粒体基因组结构进行分析 （三）与其他昆虫线粒体基因组进行比对 （四）进行系统发育分析 具体步骤 1. 采集标本并冷冻 2. 提取 DNA 3. 扩增线粒体基因组上的经典片段 4. 设计引物，扩增其他片段 5. 将所有片段拼接成完整的线粒体组（环形） 6. 校对数据，利用软件、比对等方法，标出 tRNA、 16S、 12S及 13个蛋白质基因的位置，上传线粒 体基因组数据至 Genbank。 7. 对 tRNA进行结构预测 8. 对 12S及 16S进行结构预测 9. 对该昆虫线粒体基因组上特殊位置进行讨论 10. 系统发育分析 1. 采集标本及冷冻 利用高压汞灯及黑光灯诱集，然后将标 本低温冷冻致死，取一侧后足泡入无水乙 醇，置于 -20度冰箱保存，供提取 DNA。标 本展翅并保存，以待进一步形态鉴定。 2. DNA提取 总 DNA提取试剂盒为德国默克公司 QIAGEN DNeasy Tissue kit。 PCR试剂使 用 TIANGEN天根生化科技有限公司生产的 PCR MasterMix。 将浸泡于无水乙醇中的足取出，晾干， 分成 2-3段，放在 1.5ul的离心管中。按照 QIAGEN DNeasy Tissue kit使用手册的说 明进行总 DNA提取。抽提的 DNA溶于 200- 300ul的 AE缓冲液，并置于在 -20 冰箱保 存备用。 3. PCR扩增和测序 先扩增线粒体基因组上的经典片段，如 CO 、 CO 、 CO 、 Cob等。 例：扩增 COI基因片段 扩增引物为通用引物 LCOI490（ 5 - GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3）和 HCO2198（ 5 - TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3）（ Folmer et al , 1994）。反应体系为 25l，其中上下游引物各 0.5l， PCR MasterMix 12.5l ， DNA模板 3l， ddH2O 8.5l。 扩增反应条件：预变性 94 2分钟，变性 94 1分钟，退 火 50 1分钟，延伸 72 1分钟 , 进行 35个循环。取 3l PCR扩增产物使用 1%的琼脂糖胶电泳检验。 PCR产物测 序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。 4. 设计引物，扩增其他片段 利用软件 Primer5.0 设计引物，扩增其他片段。最 难扩增的片段是控制区（ A+T-rich）。因为引物 很难设计，所以需要花费一些时间及精力。 5. 将所有片段拼接成完整的线粒体组（环形） 利用软件 DNAstar对扩增好的各个片段进行 拼接。用 Bioedit软件查看测序原始峰图， 校对各个碱基。将校对好的数据上传至 Genbank。获取 Genbank的 accession number。 6. 寻找 tRNA及预测 tRNA结构 用 tRNAscan-SE Search Server 在线软 件，寻找 tRNA，一次 可找出 17-19个。其余 与其他昆虫线粒体进 行比对找出。 用 DNAsis预测 tRNA结 构，对于较为特殊的 tRNASer(AGN)，需手 工画出。 7. 预测 12S及 16S结构 用软件 XRNA进行预测。 预测不到的，用手工 画出。 8. 对特殊结构进行分析讨论 例：控制区的结构分析 在线软件 Mfold Web Server (Zuker, 2003; http:/mfold.rna.albany.edu/?q =mfold) 9. 系统发育分析 用软件 MEGA5.0， RAxML,Paup4.0,mrba yes等软件进行分析