尼群地平包合物的制备与性质

尼群地平-B -环糊精包合物的制备与性质李星，王建华*重庆大学生物工程学院，重庆 400044摘要：目的研究尼群地平-B -环糊精包合物最佳制备工艺，并研究其包合物性质。方法采 用研磨法、饱和水溶液法、超声波法，通过正交实验设计，确定最佳制备方法及工艺。采用 显微观察、x-衍射法、紫外分光光度法来鉴定及研究包合物性质。结果 超声波法制备的 包合收率大于其余两法，其最佳包合工艺为超声功率为40KW； B -CD：尼群地平为4:1 (摩 尔比)；超声温度为20C；超声时间为70min。经鉴定形成了尼群地平另-环糊精包合物。结论 使用超声波法包合后，包合物比原料药的溶解性增强了 10.5倍，光稳定性增强3.7 倍。 其包合产物性质的改善，有助于其制剂生物利用度的提高。关键词：尼群地平；超声波法；包合制备；正交分析Study on Characterization of the Inclusion Complexes of Nitrendipine with -CyclodextrinLI xing, WANG Jian-huaBioengineering College of Chongqing University, Chongqing 400044ABSTRACT: OBJECTIVE To select the optimum preparation process of the inclusioncomplex of nitrendipine-|3-cyclodextrin and study the property of the complex. METHODS The nitrendipine-卩-cyclodextrin inclusion complexes were prepared through solid method, saturation solution method and ultrasonic method and the function of inclusion complexes were studied on physical and chemical characterizations. RESULTS The ultrasonic method is the best one in three methods. The optimum entrapment conditions were as follows: The ultrasonic power was 40KW,the ratio of3-CD to nitrendipine was 4:1, temperature was 20C, reaction time was 70 min.The formation of compound nitrendipine -卩-CD was confirmed and studied by microscope observation , x-Ray powder diffractometry and UV method. CONCLUSIONSInclusion complex not only can enhance 3.7 times the stability to light, but also can gain 10.5 times the solubility of guest molecule. Its improvement could increase the value in body use.KEY WORD: nitrendipine; ultrasonic method; preparation of inclusion complex; orthogonal design尼群地平(nitrendipine, NTD)为二氢吡啶类钙拮抗剂，主要抑制血管平滑肌和心肌的 跨膜钙离子内流，降低舒张压，持久扩张冠状血管，降低心肌耗氧量，可用于治疗各种类型 的高血压，也可用于充血性心力衰竭。但该药物在水中几乎不溶，口服生物利用度差，且其 光稳定性差，因此一定程度上影响了其制剂的开发11|3 -环糊精(B -Cyclodextrin, 3 -CD ) 由7个葡萄糖分子通过糖苷键结合而呈环状中空圆筒型，筒型空腔内径为0.70.8nm，空基金项目：教育部留学回国人员科研启动基金(2006)331；重庆市应用基础研究项目 2006BB5017作者简介：李星，(1982-)，女，硕士，研究方向：环糊精修饰与应用；TEL：65102507 E-mail： kinsin1王建华，(1962-)男，安徽，博士，教授，研究方向：药物化学，通讯联系人。腔有疏水性，可把许多大小合适的分子容纳在空腔中形成包合物。B -环糊精作为一种高效、 低毒、安全有效的药用辅料，可以促进药物的溶解度和溶出度、提高药物的稳定性、改变 药物状态便于制剂、掩盖药物的不良气味和降低刺激性、促进药物的吸收，还具透皮促进 作用。因此，为提高改善尼群地平的生物利用度，丁燕飞2和管清香3等曾采用饱和水溶液 法对其包合工艺和包合物性质进行了研究，但对其它包合方法并未做深入的比较和优选。 为拓展不同包合工艺的研究和应用，本文采用物理研磨法、水饱和溶液法和超声波法等三 种不同包合方法，系统研究了尼群地平与B -环糊精的包合作用，并对包合物进行了定性和 定量化研究，为今后优化尼群地平制剂的制备工艺，改善尼群地平的水溶性，提供理论依 据。1 实验部分1.1 药品试剂与仪器药品试剂：尼群地平（石家庄中诺药业，批号：200512030）； B -环糊精（中国医药集 团上海化学试剂公司，批号： 20021015）；蒸馏水；其余试剂均为分析纯。仪器：752S型紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）；KQ-50B型超声波清洗 器（昆山市超声仪器有限公司）； PHILIPS TYPE 943001800101-PW-1800 X-ray 衍射仪；磁力 搅拌器（郑州市上街区仪器厂）；光学显微镜（OLYMPUS TH4-200）；日光灯光照箱； 精密电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）；水浴恒温器（重庆实验设备厂）。1.2 包合物制备Q研磨法 精密称取B -CD5.0g,置研钵中，加入50mL水，另精密称尼群地平0.446g,用少量丙酮使之全部溶解，边研磨边缓缓加入用丙酮稀释的尼群地平溶液，研磨 70min 后 取出，放冷至室温。然后置冰箱中冷藏12h，抽滤，用少量丙酮浸泡后快速洗去未包合的尼 群地平，滤渣于60C的烘箱中干燥，研细即得。水饱和溶液法 称取7.2gB -CD置于三颈瓶中，加蒸馏水，在70C下制成饱和溶液,恒温。另取2.5gNTD溶于适量丙酮中，在不断搅拌下缓慢滴加到B -CD饱和溶液中，持续搅 拌30min,然后，蒸发挥散丙酮，在搅拌下冷却到室温，敞口搅拌4h。置常温4C冰箱中冷 藏12h,析晶，抽滤，用少量丙酮快速洗涤，在60C下干燥即得。超声波法 称取适量卩-CD制成饱和溶液置于锥形瓶内，置于超声波器中的震荡，另取对应适量的NTD溶于少量的丙酮中，滴加入有卩-CD饱和溶液的锥形瓶。超声制备一定 时间后，挥发丙酮，冷却，置常温4C冰箱内冷藏12h，析晶，抽滤，用少量丙酮快速洗涤, 在60C下干燥即得。1.3 超声波包合最佳制备工艺的选择选择超声功率（KW）、投料比（NTD与B -CD的摩尔比）、包合温度（C）、包合时间（min） 等四种对实验结果影响较大的因素作为考察对象，每个因素各选取4个水平,（即）采用L （45） 16 正交表设计进行试验。见表 1表 1 超声法制备包合物的因素水平表Tab 1 Table of factors and levels of ultrasonic preparationFactorLevelABCD超声功率/KWB -CD： NTD/mol 温 度/C时 间/min1201:120202302:140403403:160604504:18080以所得包合物的收率、药物的包封率和溶出度为考察指标，确定最佳制备工艺。1.4 含量测定精密称取NTD和0CD适量，分别溶于15%乙醇，制成一定浓度的溶液，在200400nm 波长范围进行扫描（图略），结果显示，其在239nm处有最强吸收峰，B -CD在此波长处无 吸收，故确定239nm波长为NTD的测定波长。以15%乙醇溶液作为溶剂，配置浓度分别为 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0卩g/ml的NTD溶液，在波长239nm处测其吸光度。得标准曲线方 程 A=0.0993C+0.0015（线性范围 2.0-8卩g/mL,卫=0.9969）。1.5显微镜及X-衍射仪鉴定分析将NTD原料药及B -CD辅料、物理混合物、超声包合物样品的晶体，进行显微鉴定。并 将以上四种样品粉末于模具中制成饼状，在X-衍射仪中分析，读出其强度I值，面间距d 值和20值。根据所得衍射图数据，进行定性分析。根据K值法进行X-衍射的定量分析：假如待测试样中含有n个相，要测定其中j相的含量，用其中的S相为内标物质。用W 和jW分别代表复合试样中待测相和S相的重量分数，待测相含量W = W旳-W ）。Sj j sX-衍射定量分析原理是：物相衍射强度与其参加衍射的体积成正比，由此得到衍射强 度公式，并推出多相试样中任一相衍射强度与其含量关系的普适公式。WI = CKj j 2pW （卩）jj m jj=11）测定KSj值。将B -CD作为待测相，NTD作为内标相，制备待测相与内标相质量比 为1： 1的两相混合物样品，混合均匀后制成试样。对此情况，W/WS=1由普适式可得jSKSj=I./IS。在混合试样的衍射峰中分别选择合适的待测相和内标物衍射峰各一个，精确测量 它们的积分强度I.和IS。即可得到所需的Kj值。2）制备含B -CD及其包合物的复合试样。选用超声法制备的包合物，经丙酮洗涤，完 全洗脱原料药，再掺入NTD，其含量不限，本复合试样中NTD与包合试样质量比为0.1； 将其混合均匀后制成复合试样。3）测量复合试样。精确测量其中选定的待测物和内标物衍射峰积分强度I.和IS，所选.S 择的衍射峰及其测量条件应与测定KS.值时完全相同。4）通过KS.值求得B -CD的含量。计算由待测相复合试样测得的I./IS比值，利用预先 测定的Kj值，通过式（3-10）计算待测相复合试样中B -CD的含量W ，然后再由关系式SjW = WM W）计算得到待测相的含量W.0jj SJ5）计算复合试样中包合物相的含量，由于通过超声法制备的包合物，经丙酮洗涤后， 只存在B -CD和包合物两相，所以包合物相的含量WN=1-W.o1.6 精密度试验以15%乙醇为溶剂，分别配制3.0卩g/ml, 6.0卩g/m 1,和9.0卩g/ml三种高，中，低浓度的 NTD 溶液。三个浓度都在标准曲线线性范围内，用紫外分光光度计测定其吸光度，根据所 得的标准曲线计算其实际浓度。同日内测定日内误差，连续3天测定日间误差。1.7 加样回收率试验，包封率及包合物含主药（尼群地平）量的测定精密称取NTD5mg,制成15%乙醇为溶剂的尼群地平溶液10ml。分别取0.3ml, 0.6ml， 0.9ml，置于50ml的容量瓶中。另取适量卩-CD加入15%乙醇得饱和卩-CD溶液，各取10ml 置于3个容量瓶中，以15%乙醇定容，摇匀，在239nm处用紫外分光光度法测定，按标准 曲线计算其实际浓度。精密称取包合物4mg,加入15%乙醇，制成50ml的包合物溶液。吸取上述溶液5ml 于50ml的容量瓶中，用15%乙醇稀释至刻度，摇匀。以15%乙醇为空白溶液，在239nm 处测定吸收度，代入标准曲线方程，计算包合物中药物含量和药物包封率4。样品收得率=（包合物的量/总投入物质量）X100% 包合物含药量=（样品中尼群地平的质量/包合物样品质量）X100% 尼群地平包封率=（样品中尼群地平的含量/尼群地平投入量）X100%。1.8 溶解度及累计溶出度的测定精密称取NTD15mg以及含有相同NTD量的包合物，分别加入10ml蒸馏水，室温（25C） 放置，放置过程中，每天定时摇匀2次，至48小时，取上清液用0.45p m微孔滤膜过滤，吸 取续滤液8.5ml置10ml容量瓶中，加无水乙醇至刻度，于239nm波长处测其吸光度A,由 标准曲线方程计算溶解度。精密称取NTD10mg，相当含量的包合物及物理混合物，由于NTD在水中不溶，故选 择以15%乙醇溶液900ml为溶出介质，采用转篮法，在温度（370.5） C,转速100r/min, 分别在15、30、45、60min时吸取介质10ml （同时补加同温介质10ml）,经0.45p m微孔 滤膜过滤，取澄清滤液测其A值，计算累计溶出度。1.9 光稳定性考察分别取NTD及相当量的包合物，物理混合物，在照度为4500500lx的强光照射30d 后，测定样品中NTD含量并计算光照前后含量下降率。含量下降率（）=（光照前含量-光照后含量）/光照前含量X100%2 结果2.1 正交试验结果及分析 见表 2。表2尼群地平-卩-环糊精包合物制备正交实验结果表Tab 2 The experimental results of orthogonal design of nitrendipine-3-CD preparation实验号超声功率A卩-CD： NTDB温度C超声时间D包封率（）1111118.612122217.103133313.344144425.815212337.486221427.447234122.468243235.729313425.9910324349.2311331220.201234216.6813414213.951442315.6515432414.6216441358.50匕74.8696.03124.7553.4K2123.199.4275.8886.97G=WK3102.170.6280.7158.55CT=G2/16K492.72126.71111.4593.84Q= K 2 /4nR48.2456.0948.87105.15SS =Q-CTQ9944.7610037.1810063.4811089.85SS302.5394.92421.221447.59表 3 包合物制备正交结果分析 Tab 3 Analysis of orthogonal resultsDependent Variable:包封率SourceType III Sum ofSquaresMeanSig.dfSquareFCorrected Model2567.172(a)12213.9311.026.563Intercept9642.25819642.25846.227.007超声功率302.5013100.834.483.717投料比394.9183131.639.631.643超声温度421.2243140.408.673.624超声时间1448.5283482.8432.315.254Error625.7533208.584Total12835.18316Corrected Total3192.92515R Squared = 0.804 (Adjusted R Squared =0 .020) 表 4 单因素统计分析Tab 4 Estimated marginal meansMean超声功率投料比超声温度超声时间118.71524.00831.18813.350230.77524.85518.97021.743325.52517.65520.17539.638423.18031.67827.86323.465方差分析结果见表3、表 4。结果表明，超声时间对主药包封率的影响最大，其次为主 客分子的摩尔比和超声温度，而超声强度在所测范围内对包封率没有产生显著性影响，四个 因素对包封率的影响顺序为DBCA。由单因素统计分析表可以得出，因素A选取水 平 2；因素 B 应取水平 4；因素 C 应取水平 1；因素 D 应取水平 3因此，包合物制备的最 佳工艺条件为A3B4C1D3.即超声功率为40KW；卩-CD:尼群地平为4:1 （摩尔比）；超声温度为20C ；超声时间为70min。2.2 包合方法比较采用超声波法最佳工艺制备包合物，由紫外分光光度法测试，得到 表 5 三种包合物制备方法的比较Tab 5 The comparison of three kinds of preparation methods方法收得率/%包合物含药率/%包封率/%饱和水溶液法62.089.1211.58超声法63.l6l6.274.68研磨法69.887.654.6%以包封率为指标，超声波法的包封率明显优于研磨法和饱和水溶液法；研磨法的收率 较优，推测原因是研磨法中蒸馏水的用量较少，包合物和原料药在抽滤和洗涤的过程中损失 的较少。由于包封率指标为方法考察上的主要标准，因此判断超声波法来制备较优，且超声 法操作更加简便，可用于制剂生产。2.3 包合物的物相鉴定2.3.1 显微鉴定分别取NTD、卩-CD、NTD与卩-CD物理混合物、超声包合物，重结晶后，置于光学 显微镜下，放大40倍观察。卩-CD晶体为矩形状结晶体；NTD晶体呈长的薄片状；NTD与 卩-CD物理混合物其形态与各自原本形态无变化，可见纯物理混合不能形成满意的包合物； NTD-P-CD包合物形态与之前发生变化，呈不规则颗粒状结晶。（图略）2.3.2 X-射线衍射鉴定与定量分析X-射线衍射法扫描图特征峰数值，见X-衍射数据表6。从上述图表所得结果可知，与NTD和卩-CD的各自三大特征峰相比，物理混合物的三 大特征峰，均来自NTD和卩-CD的各自特征峰的累加，但是强度均有所降低，这是由于混 合物中各个物质的量相对于纯物质都有所减少而导致。在包合物的三大特征峰中，第二特征 峰U2来自于卩-CD中的第一特征峰C1，表明包合物中仍有未形成包合的卩-CD；由于超声 作用使卩-CD的微粒变小或量的减少，使得其衍射峰的强度有所降低。第一和第三特征峰 （Ul、U3）都是区别于NTD和卩-CD的新峰，因此证明已有一种新的物相包合物产生。 表6 X-衍射数据表Tab 6 Table of X- diffraction data测定物三大特征峰20角度面间距（d）强度N124.3283.656100尼群地平N210.0548.79162N327.3823.25458C112.4447.107100卩-环糊精C219.4824.55379C320.7434.27980M124.3283.656100物理混合物M212.4447.10736M327.3823.25463U118.7514.728100超声包合物U212.4447.10779U334.6852.58452定量分析结果如下：1）从对尼群地平和B -环糊精分别进行的衍射测定结果中，找出强度最大（相对强度为 100）的峰，其面间距d值和20值为：尼群地平： d=3.65620 =24.328B -环糊精：d=7.107 20 =12.4442）对待测相B -环糊精j）与内标相尼群地平（s）的X衍射测定，在混合试样的衍射峰中 分别选择d值为3.565和7.107的衍射峰，其积分强度1 =5632 , I =1614。于是SjK j= I/ I=0.287S j S3）对待测复合试样中选定的待测物B -环糊精进行X衍射测定，在复合试样的衍射峰中 分别选择 d 值为 3.656 和 7.107 的衍射峰，其积分强度 I =2008， I =2822。通过公式：SjI S WSS其中 W=0.1， K j=0.287SS所以，复合试样中B -环糊精含量W - =0.248j再通过公式：W = W- W）计算得出15号包合物试样中B -环糊精的含量为27.56%。 j j s所以由超声法制备的包合物试样中，纯包合物的含量为： 72.44%。纯包合物含量=（样品中包合物的质量/包合物样品质量）X100% 假设NTD与B -环糊精以1:1的形式包合，则将实验数据代入上式及包合物含药量的公式可 得：包合物含药量为 19.01%，与此前的实验值 16.2%相近。2.4 精密度实验精密度实验的浓度计算结果为：标准曲线上高、中、低3 种浓度的尼群地平溶液的日内 变异系数（RSD%）平均为1.19%和日间变异系数（RSD%）平均为2.54%。说明NTD在介质 中是稳定的。2.5 加样回收率试验根据公式：加样回收率=实测浓度/理论浓度。计算得其平均回收率为99.91%， RSD 为 0.83%，符合中国药典规定的2%的变化范围。表明NTD在15%乙醇及B -环糊精溶液中的 回收率较好。2.6 含药量试验结果超声波最优条件下制备的包合物其原料药包封率为 75.9977.48%，含药率为 9.83 10.02%。2.7 溶解度及累计溶出度测定结果根据吸光度计算溶解度值，得到尼群地平、超声包合物的溶解度分别为（0.810.02）mg/l 和（8.480.07）mg/l。可见，尼群地平、包合物溶解度有显著提高，约为原料药的10.5倍。运用转篮法得到三种样品在 15、 30、 45、 60 分钟时的溶出度值。Time(min)4 3 2 1 0 )%(etar devolossiD图 1 不同时间的药物累计溶出度(%)Fig 1 Dissolution profile of nitrendipine with different treatmentl-NTD-CD inclusion; 2-mixture of drug and 卩-CD; 3-material drug由上图可知，制备出的包合物溶出情况较好。在 60min 时，包合物的累积溶出百分率 约为NTD的2.14倍，而相同配比的物理混合物此时与NTD的溶出率相近。可见包合物能 明显增强难溶性的 NTD 的溶出速率。2.8 光稳定性考察由于NTD的畏光性，故选择光照因素考察比较形成包合物后NTD的光照稳定性。在 长期强光照射后， NTD 颜色明显变深，混合物跟包合物颜色变化不大。经紫外分光光度法 测试计算后， NTD 在原料药中的降解率为 15.5%，物理混合物中降解率为 9.6%，包合物中 降解率则为4.2%，远低于前面两项，证明NTD形成包合物后光稳定性增强。3 讨论31通过对比尼群地平与B -CD不同工艺的包合制备结果，以及包合物与原料药NTD的测 定结果对照，试验结果表明：饱和水溶液法的收率虽然较高，但是含药率低，最佳条件下超 声波法制备包合物平均包封率为 74.68%，平均含药量为 16.2%，综合而言，优于饱和水溶 液法跟研磨法。3.2从结构大小看，B -CD分子空洞内径深度均0.7-0.8nm，在物理作用下可容纳NTD分 子。包合后的新物质形成了特定的内部晶体结构，可以根据其衍射花样与原料药辅药的衍射 花样比较进行成分鉴定。再以混入试样中的纯原料药的衍射线作为参考，代入K值法公式 求解，得到包合后样品中包合物的纯含量为72.44，含药量理论值为19.01%，与实验值相 近。3.3 超声波法制备时，超声振动加强，令分子热运动加剧，促进NTD分子向B -CD疏水 空腔运动，可提咼包合率。原料药见光后易被氧化，被包合后，其不稳定部分被包合在B -CD 的空穴中，一定程度上切断外界的影响，使光稳定性提高，也证明了NTD-B -CD包合物的 形成。PEFERENCES1 G.Antolic， F.Kozjek， S.Primozic.The relevance of nitrendipine erythrocyte partitioning for the variability of its bioavailability parametersJ.International Journal of Pharmaceutics,2001 ， 215:147-152.2 Ding YF,Yao YZhou YB.Study on inclusion complex of nitrendipine-卩-cyclodextrinJ.Chin Hosp Pharm J,2003,Vol 23(8):461-463.3 Guan QQ,Lin TM,Ding ZY, Jing XQ,Wang ES.Preparation of inclusion complex of nitrendipine-卩-cyclodextrinJ.Journalof Jilin University(Medicine Edition),2005,V0131(5):811-813.4 Tong LH.Cyclodextrin ChemistryM.Beijing:Science 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