用于美容护肤的干细胞分泌因子的制备方法

公开CN101461772 A 号发布申请类型专 申请 CN 200910067634号公开20096 月 24 日日申请20091月7日日期优先20091月7日权日200910067634.8, CN 101461772 A, CN 101461772A, CN 200910067634,公开CN-A-101461772, CN101461772 A, CN101461772A, CN200910067634,号CN200910067634.8发明文忠 , 欧夹者申请天津欧瑞生物科技有限公司人导出 BiBTeX, EndNote, RefMan引丨文被以下专引丨用 ，分类(2),法事件 (3)外部链接：中国国家知识产权局,欧洲专数据库(Espacenet)用于美容护肤的干细胞分因子的制备方法CN 101461772 A摘要本发明涉及一种可用于美容、护肤的干细胞分 因子的制备方法。包括细胞分离、 干细胞的扩增、干细胞因子体系的获取和浓缩、贮存得到含有干细胞活性因子体 系。该体系包括目前已鉴定的各型干细胞所分的活性因子。 本发明所得的干细 胞活性因子体系中含外夹的培养液成分，也含有死细胞解成分。 并可以长 期保存而维持组织和细胞修复活性。使干细胞美容真正从想走向现实。 在生 物医学的深对传统美学观进提升。同时该发明简单， 适宜于大规模生产，为干细胞服务于美丽事业提供一条捷径。权要求(6)1、一种用于美容护肤的干细胞分因子的制备方法，其特征在于包括的步骤：1) 分离干细胞：从人或哺乳动物相应组织中分离出干细胞；2)干细胞的扩增，用 相应干细胞的常规培养方法，包括a-MEM培养基，加入10%的胎牛血清，5%C02， 37c条件下培养，定期换液，传代，进而得到所需数的干细胞；3)干细胞因子 体系的获取：在干细胞分最旺盛的时期，弃去正常培养基，用PBS缓冲液(磷酸缓冲液，pH = 7.4左右)清洗1-3次，然后加入PBS或生盐水，细胞培养箱 中培养4-24 小时，收集上清液，即可得到富含干细胞生长因子体系的溶液；4) 浓缩、贮存：所得液体离心，除去散细胞，浓缩，按 1x106个细胞/毫升的浓 进浓缩，得产品，可于-20C长期保存，以备使用。2、 根据权要求 1所述的方法，其特征在于所述的夹源于干细胞所分的干细 胞 因子体系，该体系包括该体系包括干细胞因子、内皮细胞生长因子、表皮细 胞生长因子、肿瘤坏死因子肝细胞生长因子、经生长因子、纤维母细胞生长 因子、胰岛素 样成长因子、细胞集激因子、白细胞介素；此外，干细胞 分 因子中还含各型胶原蛋白，包括I、 II、 III、 IV型胶原蛋白，以及各 种溶菌酶。3、根据 权要求 1所述的方法，其特征在于所述的千细胞因子体系是菊：夹 源于人或哺乳动物胚胎干细胞、脐血干细胞、骨髓千细胞、表皮干细胞、内皮 干细胞、外周 血干细胞、脂肪干细胞，也 可泛扌指所有的干 细胞。4、 根据权要求 1所述的方法，其特征在于所得的产品作为活性成分配以医学 上 接受的溶解液构成组合物的产品，直接用于美容、护肤，包括、美容、祛斑、 修复疤痕。5、 根据权要求 1所述的方法，其特征在于所得的产品作为活性成分可以添加 到 各种制剂的美容护肤产品中，包括除皱、美容、祛斑、修复疤痕。6、根据权要求 1所述的方法，其特征在于所得的产品用于美容、护肤产品中 的针剂、面霜、乳液、水液制剂，包括清洁霜、清洁乳、清洁皂、面膜、化妆 水、按摩膏、乳液、营养霜、关容霜、粉底或粉饼。说明用于美容护肤的干细胞分因子的制备方法技术领域本发明涉及一种可用于美容、护肤的干细胞分 因子的制备方法。该干细胞分 的复合因子，可被应用于美容化妆品、保健品、护肤品。背景技术干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，根据夹源的同可以分为胚胎干细胞和 成 体干细胞。胚胎干细胞可以分化为身体的任何一种细胞，所以也叫全能干细 胞。成体干细胞是指那些具有组织或器官特异性的干细胞，能在适宜的环境中 分化成与其定位相宜的细胞系，又称为多能干细胞。干细胞在特定的环境中可 以定向分化，从而达到修复组织 和细胞损伤的作用。本发明者研究表明（Bcl-2 engineered MSCs inhibited apoptosis and improved heart function, Stem Cells, 2007 Aug;25（8）:2118- 27.）干细胞可以通过分化为特 定的细胞夹修复 组织，而旁分作用在组织的修复中发挥大的作用。也 就是说，在千细胞治疗组织损伤的时候，干细胞分 的细胞因子发挥极为重要的作用。 该体系包 括干细胞因子（SCF）、内皮细胞生长因子（VEGF）、表皮细胞生长因子（EGF ）、 肿瘤坏 死刮子（TNF）肝细胞生长因子（HGF ）、经生长冈子（NGF）、纤维母 细胞生长因子（F;F）、胰岛素样成长因子（IGF）、细胞集激因子（G-CSF）、白细胞介素（IL）等20余种。其中干细胞因子（Stem Cell Factor, SCF）仅 是维持生命活动所需要的，而且在抵扌抗电离辐射寸机体的作有及修复辐射所致 损伤中是必可少的。此外，干细 胞分因子中还含各型胶原蛋白（如 i、ii、m、V型胶原蛋白）以及各种溶 菌酶等。表皮千细胞是皮肤新的种子细胞。 每天有大的表皮细胞死亡脱，也会有相 应数的新生细胞加以补充。随着人们龄的增加，皮肤出现斑点，皱纹也 逐渐增多，表皮失去往昔的光彩，这一皆源于表皮干细胞再生能的减退， 如何使表皮干细胞保持旺盛的新陈代谢能，将是保持皮肤健康美丽的关键所 在0基于人们对美丽的需求，干细胞美容技术及其相关产品的丌发R受到业界的重 视。目前市场上出现很多所谓的干细胞产品，从技术角上并具备实施的可 性 o 中国专 CN1817339A、N1872025A和CN1817339A专涉及产品的内容使 用活性干细胞和 中药组分，首先如何在护肤品种保持干细胞的活性？其次如 何避免干细胞坏死后产生毒 素对人体的损害？这些是直得探讨且很难以解决 的问题。CN1872025A采用细胞破碎技 术，以及正常状态下的细胞培养技术夹获 取干细胞活性组分。这种获取干细胞活性组分 的方法缺乏依据。就如你砍碎 苹果树你并会得到苹果？粉碎细胞只是得到细胞片断。常规夹讲在正常生长状态下，所获取的细胞培养上清液，上清液中包含多的是 代谢废物，同 时采用a-MEN（其中添加有激素如地米松） 培养基，如何有效除去其中的激 素， 是其所面临的问题。3目前市场上也有在芙容护肤产品中添加生长因子如bFGF和EGF的，而细胞的 新是 一个系统的过程，单一生长因子的添加在某种程上虽可以激细胞的 代谢，但也容 造成依赖性。综上可以看出，基于干细胞的美容疗法具有广阔的前景，但如何科学、有效地用 干细胞的独特性能，开发出真正意义上的干细胞美容护肤产品，仍让是一个 崭新的课题。发明内容本发明的目的在于提供一种用于关容护肤的干细胞分因子的制备方法，干细胞分因子可用于关容护肤的产品。本发明提供的用于关容护肤的千细胞分因子的制备方法包括的歩骤：1）采用常规的细胞分离方法，从人或哺乳动物相应组织中分离出干细胞。2）干细胞的扩增，用相应干细胞的常规培养方法，包括a-MEM培养基，加入10% 的胎牛血清，5%C02，37C条件下培养，定期换液，传代，进而得到所需数 的干细胞。3）干细胞因子体系的获取：在干细胞分最旺盛的时期，弃去正常培养基，用PBS缓冲液（磷酸缓冲液，p t7.4左右）清洗1-3次，然后加入PBS或生盐 水,细胞培 养箱中培养4-24 小时。收集上清液，即可得到富含干细胞生长因子 体系的溶液。4）浓缩、贮存：所得液体离心，除去散细胞，浓缩，按 1X1（）个细胞/ml的 浓浓 缩，得产品，于-2（TC长期保存，以备使用。本发明所述的夹源于干细胞所分的干细胞因子体系，该体系包括干细胞因子 （SCF）、内皮细胞生长因子（VEGF）、表皮细胞生长因子（EGF ）、肿瘤坏死因子（TNF）肝细胞生长因子（HGF ）、经生长因子（NGF ）、纤维母细胞生长因子 （FGF ）、胰 岛素样成长因子（K;F ）、细胞集激因子（G-CSF）、白细胞介素（IL）等。此外，干细胞分 因子中还含各型胶原蛋白（如I、II、III、 iV型胶原蛋白）以及各种溶菌酶等。本发明所述的干细胞因子体系是菊：夹源于人或哺乳动物胚胎干细胞、脐血干细 胞、骨髓干细胞、表皮干细胞、内皮干细胞、外周血干细胞、脂肪干细胞等， 也可泛扌指所有的干细胞。本发明所得的产品作为活性成分配以医学上接受的溶解液构成组合物的产品，直 接用于美容、护肤方面的用途，包括除皱、美容、祛斑、修复疤痕等。本发明所得的产品作为活性成分可以添加到各种制剂的美容护肤产品中。用于美 容、护肤方面的用途，包括除皱、芙容、祛斑、修复疤痕等。本发明所得产品可以用于美容、护肤产品中的针剂、面霜、乳液、水液或常用化 妆 品中的各种制剂，以及按照用途分类的护肤及关容的各类产品，包括但限 于清洁霜、清洁乳、清洁皂、面膜、化妆水、按摩膏、乳液、营养霜、美容霜、 粉底或粉饼等。本发明所得的干细胞活性因子体系中含外夹的培养液成分，也含有死细胞 解成分。并可以长期保存而维持组织和细胞修复活性。本发明用干细胞多向分 化和强大 的自我复制能，体外大扩增干细胞。依据干细胞复合因子体系具 有促进表皮干细胞 增殖、促进皮肤新陈代谢，增强皮肤细胞的活，促进细胞 物质成分交换的作用，夹增 强皮肤对其他营养物质的吸收，以及机体内代谢废 物的排放。采用干细胞在无血清条件下的分效应，得到含细胞培养基和细胞组分的干细胞因子复合体系。由于本发明 含外夹培养基和细胞组分，从而 避免外夹添加剂和细胞解毒素对皮肤造成的伤害。使干细胞美容真正从想走向现实。在生物医学的深对传统美学观进提升。同时该发明简单，适宜于大规模生产，为干细胞细胞服务于美丽事业提供一条捷径。具体实施方式实施 l小鼠胚胎干细胞：夹源于南丌大学生物中心ES细胞的培养与扩增：取lml胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES），细胞浓 约 为1X10个细胞A），注射器或吸管吹打数次，以保证为单细胞悬液，将细 胞铺于有原代 小鼠胚胎成纤维细胞（M t:F）的培养瓶中，ES维持培养基（天津 联呈生物技术有限公司）10inl培养，过夜培养后换培养液，2-3天后，消化、 传代，再培养。反复以上操作，以 得到足够数的 ES。干细胞活牲因子的制备：在ES细胞生长最旺盛时（约长满培养瓶70-80%面积）， 弃去培养基，用PBS （或生盐水）清洗 2-3次，然后加入10mlPBS，继续培养 24小时。取上 清，离心，得富含干细胞因子体系。细胞消化、计数：用磷酸缓冲溶液（PBS）轻轻冲洗培养瓶中细胞1 一 2次，添加3ral消化液（025%胰蛋白酶、002%RDTA），37 C保温2-3分钟，显微镜下观 察细胞己经分离，加入含血清DMEM培养基，吹散细胞，1500转/分钟离心5分 钟，弃上清，加入5mlPBS，充分吹散细胞，进细胞计数， 按lml 上清液/lX10 个细胞的浓浓缩上清液。干细胞复合活性因子的保存：将以上浓缩后的上清液（一次或多次合并）置-2（TC 冰箱，可长期保存，备用。实施 2本实施实提供骨髓来源的干细胞因子体系的制备过程，具体如下：1. 原代骨髓干细胞的获取：取健康人骨髓10ml， PBS稀释至20ml，通过Ficoll密 梯离心获得骨髓单核细胞，根据 MSCs具有倾向于粘附在聚苯乙烯表面上的特 性，使MSCs与造血细胞分离。培养3天以后开始出现小的细胞集。约 7-9天 后细胞达到饱和，此时进传代。传代 3h后细胞即完全贴壁，2天后，细胞呈 现典型的成纤维细胞样形态，均匀分布在培养瓶内。3 4天后细胞密即达 到80 90%。2.细胞的扩增：细胞密达到 80 90%时，用磷酸缓冲溶液（PBS） 轻轻冲洗培养 瓶中细胞1 一 2次 添加3ml消化液（025%胰蛋白酶、02%RDTA）， 37 C保温2-3分钟，显微镜下观察细胞已经分离，加入含血清a-MEM培养基， 吹散细胞，按1瓶细胞传代3瓶的比进传代，2天后欢培养液，再细胞密达到 80_90%时，反复以上操作，以得到足够数的骨髓干细胞。3. 干细胞活性因子的制备：在骨髓间充质干细胞生长最旺盛时（约长满培养瓶 70-80%面积），弃去培养基，PBS或生盐水清洗 2-3次，然后加入10mlPBS， 继续培养24小时。取上清，离心，得富含千细胞因子体系。消化细胞，进细 胞计数，按lml上清液/1 X 10个细胞的浓浓缩上清液。4. 干细胞复合活性因子的保存：将以上浓缩后的上清液（一次或多次合并）， 置-20 C冰箱，可长期保存，备用。实施 3本实施提供表皮干细胞活性因子体系的制备过程，具体如下：细胞夹源：夹源于健康人的皮片（或新生儿包皮）。细胞的分离培养方法：按常规方法进培养，具体可参照（参见张卓然主编的r培 养细胞学与细胞培养技术）。干细胞活性因子的制备：在表皮干细胞生长最旺盛时（约长满培养瓶70-80%面 积），弃去培养基，PBS或生盐水清洗 2-3次，然后加入10m:lPBS，继续培 养24小时。取上清，离心，得富含干细胞因子的上清液。消化细胞，进细胞 计数，按lml上清液/lXl（T个 细胞的浓浓缩上清液。干细胞复合活性因子的保存：将以上浓缩后的上清液（一次或多次合并）置-2（TC 冰箱，可长期保存，备用。实施4实施4、干细胞分因子在化妆品中 的应用，将干细胞因子体系浓缩液，以1-10:100（干细胞因子体系：化妆品原液）的比加入到化妆品的配方中，均质处，制得富 含干细胞因子体系的化妆品。该类含有干细胞因子体系的化妆品具有美容、抗衰、修 复细胞损伤、增强皮肤弹性的功能，使皮肤变得柔嫩、靓丽、富有弹性。被以下专引用引用专申*请日期公开日申请人专名广州赛荚生人胎盘干细胞提取物冻2012320135CN102600057B物科技有限公干粉及其制备方法与应月16卩月1卩司用分类国际分类号 A61K8/98, A61K8/96法事件事件代日期码2011日4 月 6 Deemed withdrawal of patent application after C02publication20098 月 19C10 Request of examination as to substance日20096 月 24C06 Publication日