《端粒与端粒酶》PPT课件.ppt

端粒与端粒酶 早在 30年代，两名遗传学家 Muller和 Mcclintock分别在不同的实验室用不同的 生物做 实验 发现染色体末端结构对保持 染色体的稳定十分重要， Muller将这一 结构命名为 端粒（ telomere） 。 直到 1985 年 Greider等从四膜虫中真正证实了端粒 的结构为极简单的 6个核苷酸 TTAGGG序 列的多次重复后发现了 端粒酶 (telomerase TRAP-eze) 。 端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。 端粒是位于真核细胞染色体末端的核 酸蛋白复合体 ,其功能在于维持染色体的 稳定性和完整性。 端粒酶是一种核酸核蛋白酶 ,能以自身 的 RNA为模板合成端粒的重复序列 ,以维持 端粒长度的稳定性。 许多研究表明 ,端粒、端粒酶的功能失 调将影响细胞的生物学行为，包括细胞周 期的稳定性、细胞增殖、癌变、凋亡、衰 老。 端粒与端粒酶 一、端粒的结构与功能 1972年 James Watson提出了“复制末端问 题”，复制 DNA的 DNA多聚酶并不能将线性染色 体末端的 DNA完全复制。也就是说在线性 DNA复 制时， DNA多聚酶留下染色体末端一段 DNA（ 一 段端粒）不复制。 端粒 DNA复制的特点是在每次 DNA 复制中， 每条染色体的 3端均有一段 DNA无法得到复制， 随着细胞每次分裂，染色体 3一末端将持续丧失 50-200bp的 DNA， 因而细胞分裂具有一定的限度， 即分裂寿命。所以端粒的长度可作为细胞的“分 裂时钟”，反映细胞分裂能力。 真核细胞染色体末端会随着细胞分裂而 缩短，这个缩短的端粒再传给子细胞后， 随细胞的再次分裂进一步缩短。随着每次 细胞分裂，染色体末端逐渐缩短，直至细 胞衰老。人类体细胞遵循这个规则从细胞 出生到衰老，单细胞生物遵循这个规则分 裂后定有其它机制保持单细胞生物传代存 活，生殖细胞亦如此。 细胞分裂 细胞分裂 端粒长短与细胞生命历程密切相关 染色体 端粒 端粒 细胞将停止分裂而趋于老化 端粒 ： 是真核细胞线性染色体末端特殊结构 。 由端粒 DNA和端粒相关蛋白组成 。 端粒 DNA： 为不含功能基因的简单 、 高度重复序列 , 在生物进化过程中具有高度保守性 。 不同物种的端粒 DNA 序列存在差异 。 人类及其它脊椎动物染色体端粒的结构是 5TTAGGG3的重复序列 , 长约 15kb。 体细胞的端粒有 限长度 （ telomere restriction fragments TRFS） 大多数 明显短于生殖细胞 ， 青年人的 TRFs又显著长于年长 者 ， 提示 TRFs随着细胞分裂或衰老 ， 在不断变短 ， 主要是由于 DNA聚合酶不能完成复制成线性 DNA末 端所致 。 端粒 DNA由两条互相配对的 DNA 单链组成 , 其 双链部分通过与端粒结合蛋白质 TRF1和 TRF2 结合 共同组成 t环 (t loops)。 这种 t 环特殊结构可维持染色 体末端的稳定 ,保持染色体及其内部基因的完整性 ,从 而使遗传物质得以完整复制 。 缺少端粒的染色体不 能稳定存在 。 端粒 DNA与结构蛋白形成的复合物如同染色体 的一顶 “ 帽子 ” ， 它既可保护染色体不被降解 ， 又 避免了端粒对端融合 （ end-end fusion） 以及染色体 的丧失 ， 同时端粒能帮助细胞识别完整染色体和受 损染色体 。 在生理情况下 ， 端粒作为细胞 “ 分裂时 钟 ” 能缩短 ， 最终导致细胞脱离细胞周期 。 对外 : 抵御核酸酶等外界 对内 : 染色体 DNA的 因素的袭击 末端复制问题 保护染色体结构和功能的完整性 染色体 端粒的结构特点 GT链的 5 3总是指向染色体的末端。 重复次数不保守。 链区内有缺口即游离的 3-端羟基存在。 DNA的最末端不能进行末端标记，推测 其分子是一个回折结构 。 端粒末端回折结构 5 3 重复的 GGGGTT链 重复的 CCCCAA链 5-CCCCAAOHCCCAACCCCAACCCCAAOHCCCAA-3 3-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT- 5 端粒 染色体 DNA 端粒 二、端粒酶的结构与功能 在端粒被发现以前 ， 人们就推测生殖细胞之所 以能世代相传 ， 其中可能存在一种维持端粒长度的 特殊机制 ， 体细胞可能正是由于缺乏这种机制 ， 它 的染色体末端才面临着致死性缺失 （ deletion） 的危 险 。 因 此 在 正 常 人 体 细 胞 间 永 生 化 细 胞 （ immortalized cells） 及肿瘤细胞的转化过程中可 能也存在着与生殖细胞类似的机制 。 这些细胞怎样 保持细胞具有继续分裂或长期分裂的能力呢 ？ 科学 家们发现端粒确实随着每次分裂而缩短 ， 但也会被 新合成的端粒片断再延长 。 科学家们怀疑 ， 可能尚 有末被发现的酶 ， 该酶具有标准的 DNA多聚酶所不 具备的功能 ， 能使已缩短的端粒延长 ， 使科学家们 兴奋的是到 1984年首先在四膜虫中证实了这种能使 端粒延长的酶 端粒酶的存在 。 端粒酶的结构 端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体 ,由 RNA 和 结合的蛋白质组成 ,是 RNA依赖的 DNA 聚合酶。它是一种 特殊的能合成端粒 DNA的酶 ,通过明显的模板依赖方式每 次添加一个核苷酸。 端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶 端粒酶 RNA(hTR) 端粒酶逆转录酶（ TERT） 端粒酶结合蛋白 （ TEP） CAACCCCAA 端粒酶 RNA(hTR) 端粒酶逆转录酶（ TERT ） 端粒酶结合蛋白（ TEP ） 端粒酶 RNA是第一个被克隆的端粒酶 组分。 端粒酶 RNA含有与同源端粒 DNA 序列 TTAGGG的互补序列 ,核糖核酸酶 H 切割此模板区 ,能使体外消除端粒酶 延长端粒的功能。 人类 TERT（ hTERT） 基因为一单拷贝基因 ,定位于 5p15. 33 , 具有 7个保守序列结构域单元和端粒酶特异性结构域单元 T。 破坏 TERT 将消除端粒酶活性并致端粒缩短。 TEP1、 生存动力神经细胞基因 (SMN) 产物 、 hsp90 、 PinX1、 Est1p 和 Est3p 端粒酶是在染色体末端不断合成端粒序 列的酶，它可以维持端粒的长度，维持细胞 增殖潜能。端粒酶以自身 RNA为模板合成端 粒酶重复序列，具有 逆转录酶活性 ，它的活 性不依赖于 DNA聚合酶，对 RNA酶、蛋白酶 和高温均敏感。端粒酶活性表达能稳定端粒 的长度，抑制细胞的衰老，在生殖细胞和干 细胞中可检测到高水平的端粒酶活性。 端粒酶的两个主要功能 一 是端粒酶能自主地对端粒 DNA富含 G 的链进行延长，而富含 G的链又能通过 GC配对使其终端回折形成特殊的发卡结 构，这样 DNA复制时新链 5端缺失就可 以得到补齐，这就为真核生物解决了 DNA末端复制问题。 末端补齐机制 ： 5 GGGGTT （ GGGGTT） n 端粒酶 5 G-C配对回折 3 5 DNA聚合酶 另一功能 是修复断裂的染色体末端， 从而避免了外切酶对染色体 DNA更多的 切割，维护了基因组遗传的稳定性。断 裂染色体末端即使没有完整的端粒重复 序列存在，但如有富含 G、 T的 DNA存在， 它也能被端粒酶作为引物 DNA并为之延 伸端粒序列，从而修复染色体断裂末端。 端粒端粒酶对细胞死亡和细胞永生化的影响 GryfeR等于 1997年提出了关于细胞衰老和永生学说， 认为人的正常体细胞分裂次数达到界限时，染色体端粒长 度缩短到一定程度，有丝分裂便不可逆地被阻断在细胞周 期的 G1期和 G2/M期之间的某个时期，这时的细胞便进入 了老化期，随后死亡 . 如果细胞被 病毒感染 ，或 p53、 RB、 p16INK4、 ATM、 APC等肿瘤抑制基因 发生突变 ，或 K ras等 原癌基因被激活 ， 或 DNA错配修复基因 (如 hMSH2等 )发生突变，或某些基因 DNA序列发生了 高度甲基化 ，或仅发生了低度甲基化，从 而 (在未发生核甘酸突变的情况下 )改变了该基因的表达， 此时细胞便能越过阻断点继续进行有丝分裂。随着有丝分 裂进行，端粒长度不断缩短，缩短到一定程度时，染色体 发生结构畸变，大部分细胞便死亡，少部分细胞激活了 端 粒酶 活性，不断合成端粒 DNA补充端粒的长度，端粒不再 缩短，细胞便获得无限分裂增生能力而成为永生化细胞。 这说是 端粒 -端粒酶 假说。 “ 端粒端粒酶假说 ” 认为端粒酶的激活与细胞永 生化和恶性肿瘤的发生、发展密切相关。染色体末端的 端粒 DNA进行性的缩短是限制人细胞寿命的先决条件。 相对地 ,端粒酶的激活 ,合成端粒的 DNA被认为是细胞永 生化和癌症发展必需的一步。目前的资料证实 ,端粒酶 对长期成活的组织和长期进行有丝分裂的细胞是必需的。 细胞的死亡过程分为两个阶段 , 当端粒缩短至一 关键性长度 2kb-4kb 时 ,染色体的稳定性就会遭到破坏 , 细胞开始衰老进入 M1期 （ mortality stage1 M1）。在 M1 期细胞对生长因子等失去反应，产生 DNA合成蛋白抑 制因子，细胞周期检查点（ cell cycle checkpoints） 发 送周期停止信号， DNA合成停止， DNA 断裂 ,导致细 胞 G1期生长停滞 ,最终走向死亡 。如果这一过程中一些 癌基因 SV40T抗原、 PRB ,p53 ,p16 等抑癌基因失活 , 丧失正常功能 , 均能使 M1期的机制被抑制使细胞逃逸 M1期，继续生长获得额外的增殖能力，此时端粒酶仍 为阴性，端粒继续缩短，经过 20-30次分裂后，最终到 达 M2期 。细胞由于端粒过短 ,基因不稳定 ,绝大多数细 胞死亡 ,只有极少数细胞由于端粒酶活性的上调或重新 激活 ,端粒的功能得到恢复 ,基因重获稳定 ,使细胞超越 M2期 ,成为永生化细胞。 端粒酶被抑制 正常人体细胞 端粒丢失 M1期阻滞 SV40T抗原 细胞分裂停止 Rb、 P53与病毒蛋白结合 、 突变 M1 M2期间隔 永生化 双着丝粒形成 M2期退化 染色体失稳 端粒酶被激活 细胞凋亡 端粒酶在人体细胞永生性转化 中 在年老患者中有一个过早的端粒缩短， 进而缩短的端粒允许染色体融合，这些现 象与年老患者的细胞中或培养的老化细胞 中染色体组型衰老异常的高发生率密切相 关。既然端粒酶活性表达能稳定端粒的长 度，使端粒在细胞复制过程中不会丢失， 细胞衰老的进程也能被阻止，从而寿命延 长 这正是人们研究的端粒酶与抗衰老 关系的新热点。 端粒酶延长端粒长度以减慢细胞衰老最早 的证据来自 Bodnar等的研究 ， 1998年其在 Science上刊文报道：将人的端粒酶基因导入 端粒酶阴性的正常人体细胞中激活其表达并培 养细胞 ， 然后与未导入该基因的细胞比较 ， 发 现前者端粒明显增长 ， 细胞分裂旺盛 ， 细胞寿 命比后者大大延长 ， 更令人关注的是细胞并无 肿瘤样改变 。 端粒酶活化是肿瘤的显著特征 尽管有研究认为端粒长度维持还可以借助于非 端粒酶依赖模式，即端粒替代延长（ altematire Lengthening of telomere ALT） 机制，但其存在 上并不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。自 从 1994年 Kim等创立 TRAP法检测端粒酶活性以来， 越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数人类原发 性肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到。美国 学者在 400多例来源于 12 种不同组织的原发肿瘤病 例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达 84.8，而肿 瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为 4.4。 附表 人体组织中端粒酶活性 肿瘤部位 /类型 与肿瘤邻近正常组织 / 良性病变 肿瘤组织（ %） 肺 3/68（ 4.4%） 109/136（ 80.1%） 乳腺 2/28（ 7.1%） 19/24（ 79.6%） 前列腺 1/18（ 5.6%） 23/27（ 85.1%） 结肠 0/45（ 0） 22/23（ 95.6%） 肝 1/1（ 100%） 卵巢 0/8（ 0） 7/7（ 100%） 肾 0/55（ 0） 40/55（ 72.7%） 神经母细胞瘤 0/17（ 0） 94/100（ 94%） 血液（淋巴瘤， CLL ALL ） 21/23（ 91.3%） 脑 6/8（ 75%） 其它（头顶部， Wilms瘤） 8/93（ 8.6%） 24/26 (92.3) 合计 14/332 （ 4.2%） 365/430 (84.8) 以端粒酶为靶标的抗癌药物研究 在 85%以上的肿瘤细胞和组织中高度表达端粒酶， 因此端粒酶是一个较理想的抗肿瘤药物靶标。 (1)使用端粒酶抑制剂后 ,肿瘤细胞端粒缩短直至足 以对增殖产生负面效应； (2)端粒酶抑制剂对人表达端粒酶的体细胞可能有作 用 ,例如造血干细胞、生殖细胞、表皮基层细胞和肠 腺管细胞 ,但这种作用可能很小 ,因为新生组织的干 细胞比肿瘤细胞的端粒要长得多。在细胞静止期 ,端 粒不缩短 ,端粒酶几乎没有活性。 端粒酶抑制剂对肿 瘤细胞和端粒酶阳性的正常细胞的作用是不同的 :肿 瘤细胞对端粒酶抑制剂很敏感 ,作用一定时间后细胞 出现生长抑制或凋亡 ;生殖细胞在端粒酶抑制剂的作 用下 ,端粒长度稍有缩短 ,然后继续生长 ,端粒不再缩 短。 端粒酶抑制剂的研究进展 一、以粒酶酶 RNA为靶标 通过阻断端粒酶 RNA的模板作用对端粒酶活性的抑 制 1、反义寡核苷酸是端粒酶抑制剂研究领域中的 热点 ,它是与靶 RNA 配对的一段短链 DNA。 按碱基 配对原理与靶 RNA 形成杂合体 ,被动和主动地抑制 RNA 的逆转录。 2、核酶对端粒酶活性的抑制，核酶是具有特 殊核酸内切酶活性的小分子 RNA， 通过催化中心的 反义序列识别靶位。核酶有望成为广谱，低毒，高 效的抗癌新药。 二、抑制端粒酶逆转录酶活性 1、 hTERT 突变 在体内和体外实验中 ,hTERT 突变后端粒酶活性 均明显被抑制。 2、逆转录酶抑制剂 ( reverse transcriptase inhibitors ,RTI) 由于端粒酶是 RNA 依赖的 DNA聚合酶 ,所以 RTI可以成为肿瘤治 疗药物。其中对于齐多夫定的研究最多。 3、靶向 hTERT mRNA的 ASODN 针对 hTERTmRNA 设计的 ASODN 能选择性地与靶基 因杂交 ,阻断靶基因的表达。 三、 G四联体的稳定 端粒 3端突出链富含鸟苷 ,在体外可形成四链 DNA 结构 ,称为 G四联体。形成 G四联体后端粒酶 活性受到抑制。因此 ,能稳定 G四联体的药物就可 能是有效的端粒酶抑制剂。已发现很多此类化合 物 ,这些药物可以抑制端粒酶 ,但尚无缩短端粒的报 道。 四、小分子抑制剂 通过分子结构模拟软件进行拟合分析，或通 过其他高通量模式快速筛选端粒酶的小分子抑制 剂是近年来发展较快的一个领域 ,此方法是基于化 学结构的生物信息学策略去搜寻先导化合物 ,用这 一策略已发现了几个端粒酶抑制剂 (例如 FJ5002) ,但其作用机制尚不清楚。 问题与展望 一、问题 1、检测方法在临床的可操作性及稳定性； 2、缺乏灵敏度和特异性高的定量准确的检测方法； 3、端粒和端粒酶新组分的克隆和鉴定； 4、肿瘤细胞的端粒维持及调控机制； 5、端粒酶动力学、端粒酶作用及调控的确切机制。 二、研究展望 大量实验表明，端粒酶可有效地调控端粒的 长度，而端粒的长度直接对细胞的增殖或凋亡起作 用，从而决定人体寿命的长短。随着对端粒、端粒 酶结构和端粒酶激活及调节机制的深入研究 ,端粒 酶与人类衰老和肿瘤发生、发展的关系将进一步明 确 ; 如何将端粒酶检测作为肿瘤诊断标记仍是今后 研究的方向。 同时进一步探讨端粒、端粒酶和衰老因素、长 寿因素之间的关系，以及开展克隆人端粒基因等科 研课题对于研究人体衰老与抗衰老有着十分重要的 意义。 烦请各位智者慧者 耐心指教！