分子荧光与分子磷光光谱法

1 第十一章 分子荧光与分子磷光光谱法 分子发光分析 Molecular Luminescence Analysis 分子发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光和散射光谱 等。 一、基本原理 分子发光：处于基态的分子吸收能量 （ 电 、 热 、 化学和光能等 ） 被激发至激发态 ， 然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光 子 ， 此种现象称为发光 。 发光分析包括荧光 、 磷光 、 化学发光 、 生物发光等 。 物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光 2 单重态和三重态： 分子中的电子运动包括电子轨道的运动和电子的自旋运动。分子中电子的自旋 状态可用多重态 2S+1 描述（电子激发态的多重度用 M 2S+1表示）， S 为总自 旋量子数（其数值为 0和 1）。若分子中没有未配对的电子，即 S=0, 则 2S+1=1 称为单重态 （ Pauli)；若分子中有两个自旋平行的未配对电子，即 S=1，则 2S+1=3称为三重态，用 T表示。 电子通常的情况下分子的电子处于最低的能级状态（大多数有机物的分子 的基态是处于单重态的）。用 S0表示。若分子受激发，其电子从基态的电子能 级跃迁到较高的电子能级，即激发态，用 S1, S2 表示。 （一）荧光和磷光的产生 处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当分子吸收能量，若 电子在跃迁过程中不发生自旋方向的改变，通常跃迁至第一激发态单重态轨道 上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱选律的。 如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，即跃迁至第一或更高的 激发三重态轨道上，这属于禁阻跃迁。 单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级 （ 处于分立轨道上的非成对电子，平行自旋要比成对自旋更稳定些洪特规 则） 。 3 基态：电子自旋配对 ， 多重度 =2s+1=1， 为单 重态 ， 以 S0表示 。 激发单重态：分子吸收能 量 ， 电子自旋仍然配对 ， 为单重态 ， 称为激发单 重态 ， 以 S1， S2 表示 激发三重态：分子吸收能 量 ， 电子自旋不再配对 ， 为三重态 ， 称为激发三 重态 ， 以 T1， T2 .表示 。 三重态能级低于单重态 （ Hund规则 ） 4 在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁 性，其激发态的平均寿命大约为 10-8s，而三重态分子具有顺磁性， 其激发态的平均寿命为 10-4 1s以上（通常用 S和 T分别表示单重 态和三重态）。 处于激发态的电子，通常以 辐射跃迁方式 或 无辐射跃迁方式 再回到基态。 辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射 ； 无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫 （ VR）、内部转移（ IR）、系间窜跃（ IX）及外部转移（ EC） 等，各种跃迁方式发生的 可能性及程度，与 荧光物质本身的结构 及 激发时的物理和化学环境等因素 有关。 下面结合荧光和磷光的产生过程，进一步说明各种能量传递 方式在其中所起的作用。 设处于基态单重态中的电子吸收波长为 1和 2的辐射光之后， 分别激发至第二单重态 S2及第一单重态 S1。 5 去活化过程 （ Deactivation） 处于激发态分子不稳定 ， 通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程 返回至基态 。 这些过程包括： 振动弛豫 （ Vibrational Relaxation, VR） 它是指 在同一电子能 级 中 ， 电子由高振动能级转至低振动能级 ， 而将多余的能量以 热的形式发出 。 发生振动弛豫的时间为 10-12s数量级 。 S0 S2 S1 T1 吸光 1 吸光 2 振动弛豫 荧光、磷光 能级图 振动弛豫 6 内转换 （ Internal Conversion， IC） 当 两个电子能级 非常靠近以至其振 动能级有 重叠 时，常发生电子由高 能级以 无辐射跃迁方式 转移至低能 级。右图中指出，处于高激发单重 态的电子，通过内转移及振动弛豫， 均跃回到第一激发单重态的最低振 动能级。 S0 S2 S1 T1 吸光 1 吸光 2 内转移 荧光、磷光 能级图 7 荧光发射 处于第一激发单重态中的电子跃回至 基态各振动能级时，将得到最大波长 为 3的荧光。注意： 基态中也有振 动驰豫跃迁 。很明显， 3的波长较 激发波长 1或 2都长，而且不论电 子开始被激发至什么高能级，最终将 只发射出波长 3为的荧光。荧光的 产生在 10-7-10-9s内完成。 S0 S2 S1 T1 吸光 1 吸光 2 荧光 3 荧光 8 S0 S2 S1 T1 吸光 1 吸光 2 荧光 3 系间窜跃 系间窜跃 （ Intersystem Conversion， ISC） 系间跨跃 指 不同多重态间 的 无辐射跃迁 ，例如 S1 T1就是一种系间窜跃。通常，发 生系间窜跃时，电子由 S1的较低振动 能级转移至 T1的较高振动能级处。有 时，通过热激发，有可能发生 T1 S1， 然后由 S1发生荧光。这是产生延迟荧 光的机理。 荧光、磷光 能级图 9 S0 S2 S1 T1 吸光 1 吸光 2 荧光 3 磷光 磷光 荧光、磷光 能级图 磷光发射 电子由基态单重态激发至第一激发三重 态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但 是，由第一激发单重态的最低振动能级， 有可能以系间窜跃方式转至第一激发三 重态，再经过振动驰豫，转至其最低振 动能级，由此激发态跃回至基态时，便 发射磷光，这个跃迁过程（ T1 S0）也 是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为 10-4-10s。因此，这种跃迁所发射的光， 在光照停止后，仍可持续一段时间。 10 外转移 （ External Conversion， EC） 外转换 指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移， 使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为 “熄灭”或 “猝灭”。 荧光与磷光的根本区别： 荧光 是由激发 单重态 最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产 生的；而 磷光 是由 激发三重态 的最低振动能层至基态各振动能 层间跃迁产生的。 11 基态：电子自旋配对 ， 多重度 =2s+1=1， 为单 重态 ， 以 S0表示 。 激发单重态：分子吸收能 量 ， 电子自旋仍然配对 ， 为单重态 ， 称为激发单 重态 ， 以 S1， S2 表示 激发三重态：分子吸收能 量 ， 电子自旋不再配对 ， 为三重态 ， 称为激发三 重态 ， 以 T1， T2 .表示 。 三重态能级低于单重态 （ Hund规则 ） 12 （二）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线 荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根 据它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时，固定测量波 长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测 得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制 激发光谱 曲线 。 应该指出，激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但激发光谱 曲线是 荧光强度与波长的关系曲线 ，吸收曲线则是 吸光度与波长的 关系曲线 ，两者在性质上是不同的。当然， 在激发光谱曲线的最大 波长处，处于激发态的分子数目是最多的，这可说明所吸收的光能 量也是最多的，自然能产生最强的荧光 。 13 如果 固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同 的波长时所发射的荧光或磷光强度 ，即可绘制 荧光或磷 光光谱曲线 。 在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无 辐射跃迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长 波方向移动，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也 相对较弱。 14 荧光发射光谱的普遍特性： （ 1） Stokes位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为 Stokes位移 。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由 于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此， 在激发和发射之间产生了能量损失。 （ 2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关 因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到几个 不同的电子 激发态 ，而具有几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及转动弛 豫回到第一电子激发态的几率较高，远大于由高能激发态直接发射 光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发， 电子都 从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能 层 ，所以荧光发射光谱与激发波长无关。 15 （ 3）镜像规则 通常 荧光发射光谱 和它的 吸收光谱 呈镜像对称关系。 吸收光谱 是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振 动能层形成的。其形状决定于 第一电子激发态 中各 振动能层的 分布情况 。 荧光光谱 是激发分子从第一电子激发态的最低振动能层回 到基态中各不同能层形成的。所以 荧光光谱的形状 决定于 基态 中各振动能层的分布情况 。 基态中振动能层的分布和第一电子激发态中振动能层的分 布情况是类似的。 因此荧光光谱的形状和吸收光谱的形状极为 相似。 16 荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系 。 17 由基态最低振动能层跃迁到 第一电子激发态各个振动能 层的吸收过程中，振动能层越高 ，两个能层之间的能量 差越大，即激发所需的能量越高，所以吸收峰的波长越 短。反之，由 第一电子激发态的最低振动能层降落到基 态各个振动能层的荧光发射过程中，基态振动能层越高 ， 两个能层之间的能量差越小，荧光峰的波长越长。 另外，也可以从位能曲线解释镜像规则。由于光吸 收在大约 10-15的短时间内发生，原子核没有发生明显的 位移，即电子与核之间的位移没有发生变化。假如在吸 收过程中，基态的零振动能层与激发态的第二振动能层 之间的 跃迁几率 最大，那么，在荧光发射过程中，其相 反 跃迁的几率 也应该最大。也就是说，吸收和发射的能 量都最大。 18 （三）荧光和分子结构的关系 分子产生荧光必须具备两个条件： 分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才 能吸收激发光； 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有 一定的荧光量子产率。 1. 量子产率 荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，它 表示物质发射荧光的 能力 ，通常用下式表示 = 发射荧光分子数 / 激发分子总数 或 = 发射荧光量子数 / 吸收光量子数 在产生荧光的过程中，涉及到许多 辐射 和 无辐射跃迁 过程，如荧 光发射、内转移，系间窜跃和外转移等。很明显，荧光的量子产 率，将与上述每一个过程的速率常数有关。 19 若用数学式来表达这些关系，得到 = kf /（ kf+ki） 式中 kf为荧光发射过程的速率常数， ki为 其它有关过程的速率 常数的总和 。 凡是能使 kf 值升高而使其它 ki值降低的因素，都可增强荧光。 实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下 接近 1，说明 ki很小，可以忽略不计。一般来说， kf主要取决于化 学结构，而 ki则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。 磷光的量子产率与此类似。 20 2. 荧光与有机化合物的结构 （ 1）跃迁类型 实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历 或 n（非键电 子轨道） 激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再 发生 或 n跃迁而得到荧光。在这两种跃迁类型中， 跃迁常能发出较强的荧光 （较大的量子产率）。这是由 于 跃迁具有较大的摩尔吸光系数（一般比 n大 100- 1000倍），其次， 跃迁的寿命约为 10-7 10-9s，比 n 跃迁的寿命 10-5 10-7s要短。在各种跃迁过程的竞争中，它是 有利于发射荧光的。此外，在 跃迁过程中，通过系间窜 跃至三重态的速率常数也较小（ S1T!能级差较大），这也有 利于荧光的发射，总之， 跃迁是产生荧光的主要跃迁类 型。 21 （ 2）共轭效应 实验证明，容易实现 激发 的芳香族化合物容易发生荧 光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少（仅少数高度 共轭体系化合物除外）。此外， 增加体系的共轭度 ， 荧光效 率一般也将增大 。例如，在多烯结构中， ph（ CH=CH） 3 ph 和 ph（ CH=CH） 2 ph在苯中的荧光效率分别为 0.68和 0.28。 共轭效应使荧光增强的原因 ： 主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生 更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。 (3) 刚性平面结构 实验发现，多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧 光。 因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其 它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。 22 （ 4）取代基效应 芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧 光光谱有很大的影响。 给电子基团，如 -OH、 -OR、 -CN、 -NH2 、 -NR2等，使荧 光增强。因为产生了 p-共轭作用，增强了 电子共轭程度，使 最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。 吸电子基团，如 -COOH、 -NO、 -C O、卤素等，会减弱 甚至会 猝 灭荧光。 卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。这可能是由所谓 “重原子效应”使系间跨越速率增加所致。在重原子中，能级 之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道的相互作用， 增加了由单重态转化为三重态的速率。 取代基的空间障碍对荧光也有影响。 立体异构现象对荧光强度有显著的影响。 23 3. 金属螯合物的荧光 除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类 金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。但是， 在某些情况下，金属螯合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金 属元素分析。 （ 1）螯合物中配位体的发光 不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处 于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯 合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。 如 8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的 荧光。 （ 2）螯合物中金属离子的特征荧光 这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的 跃迁激发，接 着配位体把能量转给金属离子，导致 dd跃迁和 ff跃迁，最终 发射的是 dd跃迁和 ff跃迁光谱 24 （四）溶液的荧光（或磷光）强度 1. 荧光强度与溶液浓度的关系 荧光强度 If正比于吸收的光量 Ia与荧光量子产率 。 If = Ia 式中 为荧光量子效率，又根据 Beer定律 Ia = I0 - It = I0(1- 10 - l C) I0和 It分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得 If = I0(1- 10 - l c) = I0(1- e -2.3 l c) 整理得： If =2.3 I0 lc 当入射光强度 I0 和 l一定时 ，上式为： If = K c 即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比，但这种线性关系只有在极 稀的溶液中， 当 lc0.05时才成立 。对于较浓溶液，由于猝灭现象 和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。 25 2. 影响荧光强度的因素 溶剂 对荧光强度的影响 。 溶剂的影响可分为 一般溶剂效应 和 特殊溶剂效应 。 一般溶剂效应 指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。 特殊溶剂效应 指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用，如氢键的生成和化合 作用。 一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于溶剂和荧光体的化学结构。 特殊溶剂效应所引起荧光光谱的移动值，往往大于一般溶剂效应所引起的影响。 由于溶质分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光 谱可能会有显著不同。有的情况，增大溶剂的极性，将使 n跃迁的能量增大， 跃迁的能量减小，而导致荧光增强，荧光峰红移。但也有相反的情况，例 如，苯胺奈磺酸类化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇中，随着醇的极性增 大，荧光强度减小，荧光峰蓝移。因此荧光光谱的位置和强度与溶剂极性之间的 关系，应根据荧光物质与溶剂的不同而异。 如果溶剂和荧光物质形成了化合物，或溶剂使荧光物质的电离状态改变，则 荧光峰位和强度都会发生较大的变化。 26 温度对荧光强度的影响 温度上升使荧光强度下降。其中一个原因是 分子的内部能量转化作 用 。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振 动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。另一个原因是 碰撞频 率增加 ，使外转换的去活几率增加。 溶液 pH值对荧光强度的影响 带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的 pH 有关。不同的 pH值，化合物所处状态不同，不同的化合物或化合 物的分子与其离子在电子构型上有所不同，因此，它们的荧光强度 和荧光光谱就有一定的差别。 对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物，一方面 pH会影 响鏊合物的形成，另一方面还会影响鏊合物的组成，因而影响它们 的荧光性质。 27 内滤光作用和自吸收现象 溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射光能的物质，就会 使荧光减弱，这种现象称为 “内滤光作用”。 内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光发射光的短波 长的一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠。 在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，产生 “自吸收”现象而降低了溶液的荧光强度。 28 3.溶液荧光猝灭 荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度 降低的现象称为 荧光猝灭 。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。 导致荧光猝灭的主要类型： 碰撞猝灭 碰撞猝灭 是指处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞， 使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态，产生猝灭 作用。 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光的配合物而产 生的。此过程往往还会引起溶液吸收光谱的改变。 29 转入三重态的猝灭 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重态。转入三重 态的分子在常温下不发光，它们在与其它分子的碰撞中消耗能量而 使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效应是由于三重 态基态的氧分子和单重激发态的荧光物质分子碰撞，形成了单重激 发态的氧分子和三重态的荧光物质分子，使荧光猝灭。 发生电子转移反应的猝灭 某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，发生了电子转移 反应，因而引起荧光猝灭。 荧光物质的自猝灭 在浓度较高的荧光物质溶液中，单重激发态的分子在发生荧光 之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭。有些荧光物质 分子在溶液浓度较高时会形成二聚体或多聚体，使它们的吸收光谱 发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。 30 二、荧光分析仪 用于测量荧光的仪器由激发光源、样品池、用于选择激发光波 长和荧光波长的单色器以及检测器四部分组成。 目前常用的国内外荧光光谱仪 Jasco 日本分光 FP-6500 31 荧光分光光度计 RF-5301PC 分子荧光光谱 (FS)-仪器 930A荧光光度计 32 Fluoscence荧光分光光度计 (Cary Eclipse) 澳大利亚 33 F95/96荧光分光光度计中国上海 34 第一单色器 或滤光片 记录仪 第二单色器 或滤光片 荧光 光源 激发 样品池 测定原理：由光源发射的光经第一单色器得到所需的激发光波长， 通过样品池后，一部分光能被荧光物质所吸收，荧光物质被激发 后，发射荧光。 为了消除入射光和散射光的影响，荧光的测量通 常在与激发光成直角的方向上进行 。为消除可能共存的其它光线 的干扰，如由激发所产生的反射光、 Raman光以及为将溶液中杂 质滤去，以获得所需的荧光，在样品池和检测器之间设置了 第二 单色器 。荧光作用于检测器上，得到响应的电信号。 （荧光分析仪器基本部件示意图） 35 （ 1）激发光源 在紫外 -可见区范围，通常的光源是氙灯和高压汞灯。 （ 3）单色器 光栅 （ 4）检测器 由光电管和光电倍曾管作检测器，并与激发光成直角。 （ 2）样品池 荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通常用石英， 形状以方形和长方形为宜。 三、分子荧光分析法及其应用 1.荧光分析方法的特点 （ 1）灵敏度高 （ 2）选择性强 （ 3）试样量少和方法简单 （ 4）提供比较多的物理参数 36 荧光分析法的弱点是它的应用范围小。因为本身能发荧光的 物质相对较少，用加入某种试剂的方法将非荧光物质转化为荧 光物质进行分析，其数量也不多；另一方面，由于荧光分析的 灵敏度高，测定对环境因素敏感，干扰因素较多。 2. 定量分析方法 （ 1）校准曲线法 （ 2）比较法 3. 应用 （ 1）元素的荧光测定 （ 2）有机化合物的荧光测定。 37 2. 定性分析 任何荧 （ 磷 ） 光都具有两种特征光谱：激发光谱与发 射光谱 。 它们是荧 （ 磷 ） 光定性分析的基础 。 1） 激发光谱 改变激发波长 ， 测量在最强荧 （ 磷 ） 光发射波长处的强 度变化 ， 以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱 。 激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似 ， 经校正后二者 完全相同 ！ 这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激发过程 。 激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时 ， 用于选择最 适宜的激发波长 。 38 2） 发射光谱 发射光谱即荧光光谱 。 一定波长 和强度的激发波长辐照荧光物质 ， 产生不同波长的强度的荧光 ， 以 荧光强度对其波长作图可得荧光 发射光谱 。 由于不同物质具不同的 特征发射峰 ， 因而使用荧光发射 光谱可用于鉴别荧光物质 。 如右图所示 。 39 四、磷光分析法 分子磷光与分子荧光光谱的主要差别是磷光是第一激发单重态的 最低能层，经 系间跨越 跃迁到第一激发三重态，并经 振动弛豫 至 最低振动能层，然后跃迁回到基态发生的。与荧光相比，磷光具 有如下三个特点： （ 1）磷光辐射的波长比荧光长 分子的 T1态能量比 S1态低。 （ 2）磷光的寿命比荧光长 由于荧光是 S1 S0跃迁产生的，这种跃迁是自旋许可的跃迁， 因而 S1态的辐射寿命通常在 10-7 10-9s，磷光是 T1 S0跃迁产生的， 这种跃迁属自旋禁阻的跃迁，其速率常数要小，因而辐射寿命要 长，大约为 10-4 10s， 40 （ 3）磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离子敏感。 低温磷光分析中， 液氮 是最常用的合适的冷却剂。因此要求所 使用的溶剂，在液氮温度（ 77K）下应具有足够的 粘度 并能 形 成透明的刚性玻璃体 ，对所分析的试样应具有 良好的溶解特性 。 试样的刚性可减少荧光的碰撞猝灭。溶剂应易于提纯，以除去 芳香族和杂环化合物等杂质。溶剂应在所研究的光谱区域内没 有很强的吸收和发射。最常用的溶剂是 EPA，它由乙醇、异戊 烷和二乙醚按体积比为 2： 5： 5混合而成。使用 含有重原子的 混合溶剂 IEPA（由 EPA：碘甲烷 =10： 1组成），有利于系间跨 越跃迁，可以增加磷光效应。 1. 低温磷光 由于激发三重态的寿命长，使激发态分子发生 T1 S0这种分 子内部的内转化非辐射去活化过程以及激发态分子与周围的溶剂 分子间发生碰撞和能量转移过程，或发生某些光化学反应的几率 增大，这些都将使磷光强度减弱，甚至完全消失。为减少这些去 活化过程的影响，通常应在低温下测量磷光。 41 含重原子的溶剂，由于重原子的高核电荷引起或增强了溶质分 子的自旋 -轨函耦合作用，从而增大了 S0 T1吸收跃迁和 S1T1系间跨越跃迁的几率，有利于磷光的发生和增大磷光的 量子产率。这种作用称为 外部重原子效应 。当分子中引入重原 子取代基，例如，当芳烃分子中引入杂原子或重原子取代基时， 也会发生内部重原子效应，导致磷光量子效率的提高。 42 2.室温磷光 由于低温磷光需要低温实验装置，溶剂选择的限制等因素，从而 发展了多种室温磷光法（ RTP）。 （ 1）固体基质室温磷光法（ SS-RTP） 此法基于测量室温下 吸附于固体基质上 的有机化合物所发射的 磷光。所用的载体种类较多，有 纤维素载体 （如滤纸、玻璃纤维）、 无机载体 （如硅胶、氧化铝）以及 有机载体 （如乙酸钠、聚合物、 纤维素膜）等。 理想的载体是既能将分析物质牢固地束缚在表面或 基质中以增加其刚性，并能减小三重态的碰撞猝灭等非辐射去活化 过程，而本身又不产生磷光背景 。 43 （ 2）胶束增稳的溶液室温磷光法（ MS-RTP） 当溶液中表面活性剂的浓度达到临界胶束浓度后，便相互 聚集形成胶束。由于这种胶束的多相性，改变了磷光团的微环境 和定向的约束力，从而强烈影响了磷光团的物理性质， 减小了内 转化和碰撞能量损失 等非辐射去活化过程的趋势，明显增加了三 重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测量室温磷光。 利用胶束 稳定的因素，结合重原子效应，并对溶液除氧，是 MS-RTP 的三 个要素。 （ 3）敏化溶液室温磷光法（ SS-RTP） 该法在 没有表面活性剂存在 的情况下获得溶液的室温磷光。 分析物质被激发后并不发射荧光 ，而是经过 系间跨越 过程衰减变 至最低激发三重态。当有某种合适的能量受体存在时，发生了由 分析物质到受体 的三重态能量 转移 ，最后通过测量 受体所发射的 室温磷光强度 而间接测定该分析物质。在这种方法中，分析物质 本身并不发磷光，而是引发受体发磷光。 44 3. 磷光仪器 在荧光仪 样品池上增加磷 光配件：低温杜 瓦瓶和斩光片 。 如右图所示 。 斩波片的 作用是利用其分 子受激所产生的 荧光与磷光的寿 命不同获取磷光 辐射 。 转筒式磷光镜 转盘式磷光镜 45 4. 应用 磷光分析主要用于测定有机化合物，如石油产品、多环芳烃、农药、 药物等方面。（一些有机化合物的磷光分析实例） 第六章 分子荧光光谱法学习要求 1、掌握分子荧光和磷光光谱产生的机理 2、掌握分子产生荧光的条件 3、掌握荧光与有机物分子结构的关系 4、了解分子荧光产生的过程 5、了解荧光光谱与吸收光谱之间的关系 6、了解影响荧光强度的因素 7、了解荧光猝灭的原因 8、了解荧光仪器的构造与其它光谱仪的区别 9、了解磷光产生的原因和种类 10、了解磷光仪器