培养条件决定由戊糖乳杆菌LPS26生产的两种细胞外多糖的..

培养条件决定由戊糖乳杆菌培养条件决定由戊糖乳杆菌LPS26生产的两种细胞外多糖的平衡生产的两种细胞外多糖的平衡Jorge-Ignacio Sanchez,1 Beatriz Martnez,1 Rafael Guillen,2Jorge-Ignacio Sanchez,1 Beatriz Martnez,1 Rafael Guillen,2Rufino Jimenez-Daz,2 and Ana Rodrguez1*Rufino Jimenez-Daz,2 and Ana Rodrguez1*第三学习小组全体成员：第三学习小组全体成员：第三学习小组全体成员：第三学习小组全体成员：刘一辰刘一辰刘一辰刘一辰 田凯田凯田凯田凯 边鑫边鑫边鑫边鑫 陈果陈果陈果陈果 靳慧杰靳慧杰靳慧杰靳慧杰 王向宇王向宇王向宇王向宇 高陆高陆高陆高陆 李宏岳李宏岳李宏岳李宏岳 王乐乐王乐乐王乐乐王乐乐 摘要摘要 从绿橄榄自然发酵物中分离得到的戊糖乳杆菌从绿橄榄自然发酵物中分离得到的戊糖乳杆菌从绿橄榄自然发酵物中分离得到的戊糖乳杆菌从绿橄榄自然发酵物中分离得到的戊糖乳杆菌LPS26LPS26，可，可，可，可以生产一类由两种胞外多糖以生产一类由两种胞外多糖以生产一类由两种胞外多糖以生产一类由两种胞外多糖(EPS)(EPS)组成的荚膜多聚物：组成的荚膜多聚物：组成的荚膜多聚物：组成的荚膜多聚物：EPS AEPS A，一种高分子量胞外多糖，由葡萄糖和鼠李糖（，一种高分子量胞外多糖，由葡萄糖和鼠李糖（，一种高分子量胞外多糖，由葡萄糖和鼠李糖（，一种高分子量胞外多糖，由葡萄糖和鼠李糖（3 3：1 1）组成；）组成；）组成；）组成；EPS BEPS B，一种低分子量胞外多糖，由葡萄糖和甘露糖（，一种低分子量胞外多糖，由葡萄糖和甘露糖（，一种低分子量胞外多糖，由葡萄糖和甘露糖（，一种低分子量胞外多糖，由葡萄糖和甘露糖（3 3：1 1）组成。通过使用不同碳源（葡萄糖、果糖、甘露醇和乳糖）组成。通过使用不同碳源（葡萄糖、果糖、甘露醇和乳糖）组成。通过使用不同碳源（葡萄糖、果糖、甘露醇和乳糖）组成。通过使用不同碳源（葡萄糖、果糖、甘露醇和乳糖）的化学半限定培养基及温度和的化学半限定培养基及温度和的化学半限定培养基及温度和的化学半限定培养基及温度和pHpH影响的分析表明培养基的条影响的分析表明培养基的条影响的分析表明培养基的条影响的分析表明培养基的条件对于由菌株件对于由菌株件对于由菌株件对于由菌株LPS26LPS26生产的生产的生产的生产的EPSEPS的类型和浓度有很明显的影响。的类型和浓度有很明显的影响。的类型和浓度有很明显的影响。的类型和浓度有很明显的影响。这是第一篇关于由戊糖乳杆菌产这是第一篇关于由戊糖乳杆菌产这是第一篇关于由戊糖乳杆菌产这是第一篇关于由戊糖乳杆菌产EPSEPS的报道。的报道。的报道。的报道。前言前言 微生物胞外多糖（微生物胞外多糖（微生物胞外多糖（微生物胞外多糖（EPSEPS）是一类范围广泛的分泌多聚物，）是一类范围广泛的分泌多聚物，）是一类范围广泛的分泌多聚物，）是一类范围广泛的分泌多聚物，既可以紧密连接在细胞表面（荚膜多糖），也可以胞外多粘物既可以紧密连接在细胞表面（荚膜多糖），也可以胞外多粘物既可以紧密连接在细胞表面（荚膜多糖），也可以胞外多粘物既可以紧密连接在细胞表面（荚膜多糖），也可以胞外多粘物质分泌到胞外。这些分子以作为乳化剂、稠度剂、粘度计和稳质分泌到胞外。这些分子以作为乳化剂、稠度剂、粘度计和稳质分泌到胞外。这些分子以作为乳化剂、稠度剂、粘度计和稳质分泌到胞外。这些分子以作为乳化剂、稠度剂、粘度计和稳定剂应用于食品方面。由于乳酸细菌（定剂应用于食品方面。由于乳酸细菌（定剂应用于食品方面。由于乳酸细菌（定剂应用于食品方面。由于乳酸细菌（LABLAB）是食品级的，）是食品级的，）是食品级的，）是食品级的，因此它生产的因此它生产的因此它生产的因此它生产的EPSEPS引起了人们越来越多的兴趣。引起了人们越来越多的兴趣。引起了人们越来越多的兴趣。引起了人们越来越多的兴趣。LAB LAB生产的生产的生产的生产的EPSEPS可以由一种糖单体构成（同聚多糖），也可以由一种糖单体构成（同聚多糖），也可以由一种糖单体构成（同聚多糖），也可以由一种糖单体构成（同聚多糖），也可以由几种单体构成（杂多糖）。由不同菌株生产的可以由几种单体构成（杂多糖）。由不同菌株生产的可以由几种单体构成（杂多糖）。由不同菌株生产的可以由几种单体构成（杂多糖）。由不同菌株生产的EPSEPS在糖在糖在糖在糖成分、链长、支化程度以及糖键类型上有所不同。成分、链长、支化程度以及糖键类型上有所不同。成分、链长、支化程度以及糖键类型上有所不同。成分、链长、支化程度以及糖键类型上有所不同。前言前言 迄今为止，这些迄今为止，这些迄今为止，这些迄今为止，这些EPSEPS作为生物组分在食品工业上的使作为生物组分在食品工业上的使作为生物组分在食品工业上的使作为生物组分在食品工业上的使用很大程度上受到了用很大程度上受到了用很大程度上受到了用很大程度上受到了LABLAB低产量（低产量（低产量（低产量（4040到到到到600mg L600mg L-1-1）的限）的限）的限）的限制。因此，高效地由制。因此，高效地由制。因此，高效地由制。因此，高效地由LABLAB生产生产生产生产EPSEPS的条件应该被优化。的条件应该被优化。的条件应该被优化。的条件应该被优化。近年来由乳酸杆菌生产近年来由乳酸杆菌生产近年来由乳酸杆菌生产近年来由乳酸杆菌生产EPSEPS已被报道。但迄今为止还已被报道。但迄今为止还已被报道。但迄今为止还已被报道。但迄今为止还没有关于由戊糖乳杆菌生产没有关于由戊糖乳杆菌生产没有关于由戊糖乳杆菌生产没有关于由戊糖乳杆菌生产EPSEPS的特点的报道。对此，我的特点的报道。对此，我的特点的报道。对此，我的特点的报道。对此，我们研究了由戊糖乳杆菌们研究了由戊糖乳杆菌们研究了由戊糖乳杆菌们研究了由戊糖乳杆菌LPS26LPS26生产的两种不同的生产的两种不同的生产的两种不同的生产的两种不同的EPSEPS。根。根。根。根据我们的结果，两种据我们的结果，两种据我们的结果，两种据我们的结果，两种EPSEPS的比率可以被调节并且产物水平的比率可以被调节并且产物水平的比率可以被调节并且产物水平的比率可以被调节并且产物水平可通过培养条件而被优化。可通过培养条件而被优化。可通过培养条件而被优化。可通过培养条件而被优化。材料和方法材料和方法1.1.菌株和培养基条件菌株和培养基条件菌株和培养基条件菌株和培养基条件2.2.对细胞表面进行化学处理对细胞表面进行化学处理对细胞表面进行化学处理对细胞表面进行化学处理3.3.EPS EPS的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化 4.4.EPS EPS的定量的定量的定量的定量 5.5.单糖的分析单糖的分析单糖的分析单糖的分析 6.6.发酵条件发酵条件发酵条件发酵条件7.7.动力学参数动力学参数动力学参数动力学参数8.8.以牛奶进行培养以牛奶进行培养以牛奶进行培养以牛奶进行培养9.9.统计学分析统计学分析统计学分析统计学分析1 菌株和培养基条件n n戊糖乳酸杆菌戊糖乳酸杆菌LPS26 LPS26（L.pentosus L.pentosus LPS26LPS26）n n乳酸乳球菌乳酸亚种乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947 IPLA947（Lactococcus lactis Lactococcus lactis subsp.subsp.lactis lactis IPLA947 IPLA947）n n可在优化的半合成培养基可在优化的半合成培养基SDMSDM中培养获得细胞外多糖（中培养获得细胞外多糖（EPSEPS）n n培养基组成：培养基组成：吐温吐温8080（Tween 80 Tween 80）1g/L 1g/L 柠檬酸铵柠檬酸铵 2g/L 2g/L 乙酸钠乙酸钠 5g/L 5g/L MgSO MgSO4 47H7H2 2O 0.1g/L O 0.1g/L MnSO MnSO4 4 0.05g/L 0.05g/L K K2 2HPOHPO4 4 2g/L 2g/L 酵母浸粉酵母浸粉 5g/L 5g/L 蛋白胨蛋白胨 10g/L 10g/L pH 6.0 pH 6.0 为进一步优化培养基成分，添加不同碳源进行实验。为进一步优化培养基成分，添加不同碳源进行实验。2 对细胞表面进行化学处理n n每10ml样品过夜培养后以5ml以下任何一种溶液重悬处理：A.A.30质量分数的十二烷基磺酸钠于45C下处理30minB.B.0.05M NaOH于20C处理30minC.C.蛋白酶K（1.5mg/ml）于50C处理30min3 EPS的分离纯化 在前人方法上进行改进如下：在前人方法上进行改进如下：n n10ml10ml样品以样品以30W 1Hz30W 1Hz超声波处理了超声波处理了10min 10min n n用用1010质量分数的三氯乙酸搅拌处理质量分数的三氯乙酸搅拌处理3030分钟分钟 n n4 410000g10000g离心离心10min10min以去除细胞核蛋白以去除细胞核蛋白 n n以以2 2倍体积的酒精沉淀过夜倍体积的酒精沉淀过夜 ，重溶于，重溶于1ml1ml蒸馏水中蒸馏水中 n n4 4中透析中透析48h48h，期间每，期间每12h12h换水一次换水一次 n n纯净的纯净的EPSEPS被冻干以便于进行进一步定量和成分被冻干以便于进行进一步定量和成分分析分析 4 EPS的定量 对含对含EPSEPS的样品进行高压液相色谱的样品进行高压液相色谱(HPLC)(HPLC)系统进系统进行过滤层析行过滤层析(SEC)(SEC)，组分用一个以，组分用一个以TSK-Gel TSK-Gel precolumnprecolumn柱保护的柱保护的TSK-Gel G5000 PWXLTSK-Gel G5000 PWXL柱收集。柱收集。HPLCHPLC条件如下：条件如下：A.A.流动相是流动相是0.1M0.1M的的NaNONaNO3 3B.B.柱温是柱温是4040C.C.流速是流速是0.6ml/min0.6ml/minD.D.进样量是进样量是50ul50ul5 单糖的分析分析 存在两种存在两种EPS(EPS A and EPS B)EPS(EPS A and EPS B)1.1.分离得到的分离得到的EPSEPS蒸馏水透析蒸馏水透析48h48h以去除来自流动相的以去除来自流动相的NaNO3NaNO3然后将其冻干然后将其冻干2.2.依靠根据依靠根据alditol acetatealditol acetate方法进行的气相色谱来测定多糖成分方法进行的气相色谱来测定多糖成分3.3.样品以丙酮（样品以丙酮（1ul1ul对应每对应每ug EPSug EPS）溶解）溶解4.4.通过与通过与Hewlett-Packard 5972Hewlett-Packard 5972选择性质量检测器连接的选择性质量检测器连接的Series II Series II Hewlett-Packard 5890Hewlett-Packard 5890仪和按流注射模式操作的一根石英毛细仪和按流注射模式操作的一根石英毛细管（管（0.25 mm by 30 m;SPTM 23300.25 mm by 30 m;SPTM 2330）进行分析）进行分析5.5.烤箱的温度保持在烤箱的温度保持在2202206 发酵条件n n所有的发酵实验都是在一个所有的发酵实验都是在一个750ml750ml的含葡萄糖（的含葡萄糖（20g/L20g/L）的的SDMSDM培培养基中进行的养基中进行的 n n以以30C30C过夜培养的培养物按过夜培养的培养物按2 2体积分数接种体积分数接种 n n通过一个通过一个InPro 3000/225InPro 3000/225探针进行测量后自动补加探针进行测量后自动补加5.7N5.7N的的NHNH4 4OHOH来控制来控制pHpHn n转速为转速为150rpm 150rpm n n当菌体达到指数生长期时，补加新鲜的培养基使之开始从最低稀当菌体达到指数生长期时，补加新鲜的培养基使之开始从最低稀释度下进行发酵释度下进行发酵n n分别对多种碳源（葡萄糖、乳糖、果糖和甘露醇），不同糖浓度分别对多种碳源（葡萄糖、乳糖、果糖和甘露醇），不同糖浓度（5 5，2020，3030和和40g/L40g/L），不同温度（），不同温度（2020，2525和和30C30C）以及不同）以及不同pHpH水平（水平（6.06.0，5.05.0和不进行控制）进行了实验和不进行控制）进行了实验 n n对细菌的生长情况（以对细菌的生长情况（以CUF/mlCUF/ml表示），表示），pHpH（未控制（未控制pHpH培养物）培养物）和产物和产物EPSEPS的量进行了测定，的量进行了测定，HPLCHPLC对糖和有机酸进行检测对糖和有机酸进行检测7 动力学参数n n最大生长率最大生长率maxmaxln ln（X1-X0X1-X0）/（t1 t1t0 t0），），其中其中X1X1和和X0X0是是CFU/mlCFU/ml的数，的数，t0 t0和和t1 t1是对数生长期起是对数生长期起止时间止时间n nEPSEPS产率产率(YEPS)(YEPS)以每克糖产生的以每克糖产生的EPSEPS毫克数表示毫克数表示n n单位体积产率单位体积产率(Pv)(Pv)以每小时每升培养液中产生的以每小时每升培养液中产生的EPSEPS毫克数表示毫克数表示 8 以牛奶进行培养n n在商品在商品UHTUHT培养基添加了培养基添加了2 2的脱脂乳糖粉末作为的脱脂乳糖粉末作为两种菌的培养基两种菌的培养基n n两种菌分别在两种菌分别在MRSMRS和和M17M17培养基上过夜培养，以培养基上过夜培养，以它们作为接种体在它们作为接种体在25C25C下培养下培养7272小时后每毫升戊小时后每毫升戊糖乳酸杆菌糖乳酸杆菌LPS26LPS26长出了长出了2102107 7个菌落，乳酸乳球个菌落，乳酸乳球菌乳酸亚种菌乳酸亚种IPLA947IPLA947则长出了则长出了7.5107.5106 6个个 9 统计学分析n n数据依靠电脑软件进行了差异分析和最小差异意义监测分析验证（P0.01）材料和方法材料和方法 乳酸乳球菌乳酸亚种乳酸乳球菌乳酸亚种乳酸乳球菌乳酸亚种乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947 IPLA947（Lactococcus lactis Lactococcus lactis subsp.subsp.Lactis Lactis IPLA947 IPLA947）1.菌株和培养基条件菌株和培养基条件 戊糖乳酸杆菌戊糖乳酸杆菌戊糖乳酸杆菌戊糖乳酸杆菌LPS26 LPS26（L.pentosus L.pentosus LPS26LPS26）材料和方法材料和方法这两种菌株可在优化的半合成培养基这两种菌株可在优化的半合成培养基这两种菌株可在优化的半合成培养基这两种菌株可在优化的半合成培养基SDMSDM中培养获得细胞外中培养获得细胞外中培养获得细胞外中培养获得细胞外多糖（多糖（多糖（多糖（EPSEPS）培养基组成：培养基组成：培养基组成：培养基组成：吐温吐温吐温吐温8080（Tween 80 Tween 80）1g/L 1g/L 柠檬酸铵柠檬酸铵柠檬酸铵柠檬酸铵 2g/L 2g/L 乙酸钠乙酸钠乙酸钠乙酸钠 5g/L 5g/L MgSO MgSO4 47H7H2 2O 0.1g/L O 0.1g/L MnSO MnSO4 4 0.05g/L 0.05g/L K2HPO K2HPO4 4 2g/L 2g/L 酵母浸粉酵母浸粉酵母浸粉酵母浸粉 5g/L 5g/L 蛋白胨蛋白胨蛋白胨蛋白胨 10g/L 10g/L pH 6.0 pH 6.0 为进一步优化培养基成分，添加不同碳源进行实验。为进一步优化培养基成分，添加不同碳源进行实验。为进一步优化培养基成分，添加不同碳源进行实验。为进一步优化培养基成分，添加不同碳源进行实验。1.菌株和培养基条件菌株和培养基条件材料和方法材料和方法2.对细胞表面进行化学处理对细胞表面进行化学处理每每每每10ml10ml样品过夜培养后以样品过夜培养后以样品过夜培养后以样品过夜培养后以5ml5ml以下任何一种溶液重悬处理：以下任何一种溶液重悬处理：以下任何一种溶液重悬处理：以下任何一种溶液重悬处理：uu3030质量分数的十二烷基磺酸钠于质量分数的十二烷基磺酸钠于质量分数的十二烷基磺酸钠于质量分数的十二烷基磺酸钠于45C45C下处理下处理下处理下处理30min30minuu0.05M NaOH0.05M NaOH于于于于20C20C处理处理处理处理30min30minuu蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶KK（1.5mg/ml1.5mg/ml）于）于）于）于50C50C处理处理处理处理30min30min材料和方法材料和方法3.EPS的分离纯化的分离纯化在前人方法上进行改进如下：在前人方法上进行改进如下：在前人方法上进行改进如下：在前人方法上进行改进如下：10ml10ml样品以样品以样品以样品以30W 1Hz30W 1Hz超声波处理了超声波处理了超声波处理了超声波处理了10min 10min 用用用用1010质量分数的三氯乙酸搅拌处理质量分数的三氯乙酸搅拌处理质量分数的三氯乙酸搅拌处理质量分数的三氯乙酸搅拌处理3030分钟分钟分钟分钟 4 410000g10000g离心离心离心离心10min10min以去除细胞核蛋白以去除细胞核蛋白以去除细胞核蛋白以去除细胞核蛋白 以以以以2 2倍体积的酒精沉淀过夜倍体积的酒精沉淀过夜倍体积的酒精沉淀过夜倍体积的酒精沉淀过夜 ，重溶于，重溶于，重溶于，重溶于1ml1ml蒸馏水中蒸馏水中蒸馏水中蒸馏水中 4 4中透析中透析中透析中透析48h48h，期间每，期间每，期间每，期间每12h12h换水一次换水一次换水一次换水一次 纯净的纯净的纯净的纯净的EPSEPS被冻干以便于进行进一步定量和成分分析被冻干以便于进行进一步定量和成分分析被冻干以便于进行进一步定量和成分分析被冻干以便于进行进一步定量和成分分析 材料和方法材料和方法4.EPS的定量的定量 对含对含对含对含EPSEPS的样品进行高压液相色谱的样品进行高压液相色谱的样品进行高压液相色谱的样品进行高压液相色谱(HPLC)(HPLC)系统进行过滤系统进行过滤系统进行过滤系统进行过滤层析层析层析层析(SEC)(SEC)，组分用一个以，组分用一个以，组分用一个以，组分用一个以TSK-Gel precolumnTSK-Gel precolumn柱保护的柱保护的柱保护的柱保护的TSK-Gel G5000 PWXLTSK-Gel G5000 PWXL柱收集。柱收集。柱收集。柱收集。HPLCHPLC条件如下：条件如下：条件如下：条件如下：uu流动相是流动相是流动相是流动相是0.1M0.1M的的的的NaNO3NaNO3uu柱温是柱温是柱温是柱温是4040uu流速是流速是流速是流速是0.6ml/min0.6ml/minuu进样量是进样量是进样量是进样量是50ul50ul材料和方法材料和方法5.单糖的分析单糖的分析存在两种存在两种存在两种存在两种EPS(EPS A and EPS B)EPS(EPS A and EPS B)分离得到的分离得到的分离得到的分离得到的EPSEPS蒸馏水透析蒸馏水透析蒸馏水透析蒸馏水透析48h48h以去除来自流动相的以去除来自流动相的以去除来自流动相的以去除来自流动相的NaNO3NaNO3然后将其冻干然后将其冻干然后将其冻干然后将其冻干依靠根据依靠根据依靠根据依靠根据alditol acetatealditol acetate方法进行的气相色谱来测定多糖成分方法进行的气相色谱来测定多糖成分方法进行的气相色谱来测定多糖成分方法进行的气相色谱来测定多糖成分样品以丙酮（样品以丙酮（样品以丙酮（样品以丙酮（1ul1ul对应每对应每对应每对应每ug EPSug EPS）溶解）溶解）溶解）溶解通过与通过与通过与通过与Hewlett-Packard 5972Hewlett-Packard 5972选择性质量检测器连接的选择性质量检测器连接的选择性质量检测器连接的选择性质量检测器连接的Series II Hewlett-Series II Hewlett-Packard 5890Packard 5890仪和按流注射模式操作的一根石英毛细管（仪和按流注射模式操作的一根石英毛细管（仪和按流注射模式操作的一根石英毛细管（仪和按流注射模式操作的一根石英毛细管（0.25 mm by 30 0.25 mm by 30 m;SPTM 2330m;SPTM 2330）进行分析）进行分析）进行分析）进行分析烤箱的温度保持在烤箱的温度保持在烤箱的温度保持在烤箱的温度保持在220220材料和方法材料和方法6.发酵条件发酵条件uu所有的发酵实验都是在一个所有的发酵实验都是在一个所有的发酵实验都是在一个所有的发酵实验都是在一个750ml750ml的含葡萄糖（的含葡萄糖（的含葡萄糖（的含葡萄糖（20g/L20g/L）的的的的SDMSDM培养培养培养培养基中进行的基中进行的基中进行的基中进行的 uu以以以以30C30C过夜培养的培养物按过夜培养的培养物按过夜培养的培养物按过夜培养的培养物按2 2体积分数接种体积分数接种体积分数接种体积分数接种 uu通过一个通过一个通过一个通过一个InPro 3000/225InPro 3000/225探针进行测量后自动补加探针进行测量后自动补加探针进行测量后自动补加探针进行测量后自动补加5.7N5.7N的的的的NH4OHNH4OH来控来控来控来控制制制制pHpHuu转速为转速为转速为转速为150rpm 150rpm uu连续发酵连续发酵连续发酵连续发酵：当菌体达到指数生长期时，补加新鲜的培养基使之开始从：当菌体达到指数生长期时，补加新鲜的培养基使之开始从：当菌体达到指数生长期时，补加新鲜的培养基使之开始从：当菌体达到指数生长期时，补加新鲜的培养基使之开始从最低稀释度下进行发酵最低稀释度下进行发酵最低稀释度下进行发酵最低稀释度下进行发酵uu分别对分别对分别对分别对多种碳源多种碳源多种碳源多种碳源（葡萄糖、乳糖、果糖和甘露醇），（葡萄糖、乳糖、果糖和甘露醇），（葡萄糖、乳糖、果糖和甘露醇），（葡萄糖、乳糖、果糖和甘露醇），不同糖浓度不同糖浓度不同糖浓度不同糖浓度（5 5，2020，3030和和和和40g/L40g/L），），），），不同温度不同温度不同温度不同温度（2020，2525和和和和30C30C）以及）以及）以及）以及不同不同不同不同pHpH水平（水平（水平（水平（6.06.0，5.05.0和不进行控制）进行了实验和不进行控制）进行了实验和不进行控制）进行了实验和不进行控制）进行了实验 uu对细菌的生长情况（以对细菌的生长情况（以对细菌的生长情况（以对细菌的生长情况（以CUF/mlCUF/ml表示），表示），表示），表示），pHpH（未控制（未控制（未控制（未控制pHpH培养物）和产培养物）和产培养物）和产培养物）和产物物物物EPSEPS的量进行了测定，的量进行了测定，的量进行了测定，的量进行了测定，HPLCHPLC对糖和有机酸进行检测对糖和有机酸进行检测对糖和有机酸进行检测对糖和有机酸进行检测材料和方法材料和方法7.动力学参数动力学参数uu最大生长率最大生长率最大生长率最大生长率maxmaxlnln（X1-X0X1-X0）/（t1t1t0t0），其中，其中，其中，其中X1X1和和和和X0X0是是是是CFU/mlCFU/ml的数，的数，的数，的数，t0t0和和和和t1t1是对数生长期起止时间是对数生长期起止时间是对数生长期起止时间是对数生长期起止时间uuEPSEPS产率产率产率产率(YEPS)(YEPS)以每克糖产生的以每克糖产生的以每克糖产生的以每克糖产生的EPSEPS毫克数表示毫克数表示毫克数表示毫克数表示uu单位体积产率单位体积产率单位体积产率单位体积产率(Pv)(Pv)以每小时每升培养液中产生的以每小时每升培养液中产生的以每小时每升培养液中产生的以每小时每升培养液中产生的EPSEPS毫毫毫毫克数表示克数表示克数表示克数表示材料和方法材料和方法8.以牛奶进行培养以牛奶进行培养uu在商品在商品在商品在商品UHTUHT培养基添加了培养基添加了培养基添加了培养基添加了2 2的脱脂牛奶粉末作为两种菌的脱脂牛奶粉末作为两种菌的脱脂牛奶粉末作为两种菌的脱脂牛奶粉末作为两种菌的培养基的培养基的培养基的培养基uu两种菌分别在两种菌分别在两种菌分别在两种菌分别在MRSMRS和和和和M17M17培养基上过夜培养，以它们作培养基上过夜培养，以它们作培养基上过夜培养，以它们作培养基上过夜培养，以它们作为接种体。在为接种体。在为接种体。在为接种体。在25C25C下培养下培养下培养下培养7272小时后每毫升戊糖乳酸杆菌小时后每毫升戊糖乳酸杆菌小时后每毫升戊糖乳酸杆菌小时后每毫升戊糖乳酸杆菌LPS26LPS26长出了长出了长出了长出了2102107 7个菌落，乳酸乳球菌乳酸亚种个菌落，乳酸乳球菌乳酸亚种个菌落，乳酸乳球菌乳酸亚种个菌落，乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947IPLA947则长出了则长出了则长出了则长出了7.5107.5106 6个个个个 材料和方法材料和方法9.9.统计学分析统计学分析统计学分析统计学分析uu数据依靠电脑软件进行了差异分析和最小差异意义监测数据依靠电脑软件进行了差异分析和最小差异意义监测数据依靠电脑软件进行了差异分析和最小差异意义监测数据依靠电脑软件进行了差异分析和最小差异意义监测分析验证分析验证分析验证分析验证,结论为极为显著（结论为极为显著（结论为极为显著（结论为极为显著（P0.01P0.01）图图1.1.高压液相色谱分析高压液相色谱分析L.pentosusL.pentosus LPS26 LPS26产生的产生的EPSEPSn n分析显示存在分别对应两个峰的两种多聚物，一种大分子分析显示存在分别对应两个峰的两种多聚物，一种大分子分析显示存在分别对应两个峰的两种多聚物，一种大分子分析显示存在分别对应两个峰的两种多聚物，一种大分子量（量（量（量（high-Mwhigh-Mw）多聚物（）多聚物（）多聚物（）多聚物（EPS AEPS A），分子量），分子量），分子量），分子量1.9101.9106 6 Da Da，另，另，另，另一种小分子量多聚物（一种小分子量多聚物（一种小分子量多聚物（一种小分子量多聚物（EPS B)EPS B)，分子量，分子量，分子量，分子量3.3103.3104 4DaDa。实验结果实验结果EPS的组成的组成uu气相色谱气相色谱气相色谱气相色谱-质谱分析显示两种质谱分析显示两种质谱分析显示两种质谱分析显示两种EPSEPS的单糖组成是不同的。的单糖组成是不同的。的单糖组成是不同的。的单糖组成是不同的。EPS EPS A A由葡萄糖和鼠李糖组成，其物质的量之比近似为由葡萄糖和鼠李糖组成，其物质的量之比近似为由葡萄糖和鼠李糖组成，其物质的量之比近似为由葡萄糖和鼠李糖组成，其物质的量之比近似为3 3：1 1，然，然，然，然而而而而EPS BEPS B由葡萄糖和甘露糖组成，比例相似。由葡萄糖和甘露糖组成，比例相似。由葡萄糖和甘露糖组成，比例相似。由葡萄糖和甘露糖组成，比例相似。实验结果实验结果EPS A&B组成组成uu甘露醇和果糖分别提供了最高甘露醇和果糖分别提供了最高甘露醇和果糖分别提供了最高甘露醇和果糖分别提供了最高（黄）（黄）（黄）（黄）和最低和最低和最低和最低（绿绿绿绿）的活菌数，的活菌数，的活菌数，的活菌数，但是甘露醇和葡萄糖之间没有但是甘露醇和葡萄糖之间没有但是甘露醇和葡萄糖之间没有但是甘露醇和葡萄糖之间没有检测到明显的差别。检测到明显的差别。检测到明显的差别。检测到明显的差别。uu果糖和甘露醇导致较低的果糖和甘露醇导致较低的果糖和甘露醇导致较低的果糖和甘露醇导致较低的EPSEPS合成合成合成合成，然而葡萄糖和乳糖则是然而葡萄糖和乳糖则是然而葡萄糖和乳糖则是然而葡萄糖和乳糖则是更适合更适合更适合更适合EPSEPS产生的糖源。产生的糖源。产生的糖源。产生的糖源。uuEPS EPS A A似乎比似乎比似乎比似乎比EPS EPS B B更依赖于更依赖于更依赖于更依赖于特定碳源特定碳源特定碳源特定碳源uu用甘露醇，葡萄糖和乳糖发酵用甘露醇，葡萄糖和乳糖发酵用甘露醇，葡萄糖和乳糖发酵用甘露醇，葡萄糖和乳糖发酵得到的得到的得到的得到的EPS AEPS A占有更高的比率。占有更高的比率。占有更高的比率。占有更高的比率。但是，用果糖发酵则得到相反但是，用果糖发酵则得到相反但是，用果糖发酵则得到相反但是，用果糖发酵则得到相反的比率。的比率。的比率。的比率。uu用不同碳源发酵，两种用不同碳源发酵，两种用不同碳源发酵，两种用不同碳源发酵，两种EPSEPS的的的的单糖组成的差异都很小。单糖组成的差异都很小。单糖组成的差异都很小。单糖组成的差异都很小。实验结果碳源的影响实验结果碳源的影响uu随着糖源浓度增加，随着糖源浓度增加，随着糖源浓度增加，随着糖源浓度增加，活菌数增多。活菌数增多。活菌数增多。活菌数增多。uuEPSEPS随着初始葡萄糖浓随着初始葡萄糖浓随着初始葡萄糖浓随着初始葡萄糖浓度的增加度的增加度的增加度的增加而而而而增加增加增加增加。uu葡萄糖浓度在葡萄糖浓度在葡萄糖浓度在葡萄糖浓度在5 5克每升克每升克每升克每升时，时，时，时，EPSEPS产量最大，产量最大，产量最大，产量最大，2020 4040g/Lg/L时时时时，EPSEPS产量产量产量产量持在很窄的范围内持在很窄的范围内持在很窄的范围内持在很窄的范围内，且且且且EPS AEPS A和和和和EPS BEPS B的比的比的比的比率不率不率不率不受葡萄糖浓度的受葡萄糖浓度的受葡萄糖浓度的受葡萄糖浓度的影响影响影响影响。实验结果糖浓度的影响实验结果糖浓度的影响uu温度影响两种温度影响两种温度影响两种温度影响两种EPSEPS的产量，从的产量，从的产量，从的产量，从EPS AEPS A的产量可以看出温度与的产量可以看出温度与的产量可以看出温度与的产量可以看出温度与EPSEPS的产量呈的产量呈的产量呈的产量呈负相关性负相关性负相关性负相关性。2020的总多聚物量是的总多聚物量是的总多聚物量是的总多聚物量是2525条件下的条件下的条件下的条件下的1.21.2倍、是倍、是倍、是倍、是3030条件下的条件下的条件下的条件下的1.61.6倍。倍。倍。倍。2020条件下的条件下的条件下的条件下的EPSEPS产量也比产量也比产量也比产量也比2525和和和和3030条件下的多。条件下的多。条件下的多。条件下的多。uu相反的，通过相反的，通过相反的，通过相反的，通过2020和和和和2525的显著不同可以得出低温降低活菌数。的显著不同可以得出低温降低活菌数。的显著不同可以得出低温降低活菌数。的显著不同可以得出低温降低活菌数。实验结果温度的影响实验结果温度的影响uu对对对对pHpH进行调节可提高两种进行调节可提高两种进行调节可提高两种进行调节可提高两种EPSEPS的产量，而且的产量，而且的产量，而且的产量，而且EPS BEPS B的效果尤为明显。的效果尤为明显。的效果尤为明显。的效果尤为明显。uupH5.0pH5.0时可检测出更多的活菌数时可检测出更多的活菌数时可检测出更多的活菌数时可检测出更多的活菌数。uuEPSEPS产量产量产量产量在在在在pH6.0 pH6.0 时明显高于时明显高于时明显高于时明显高于 pH5.0 pH5.0 和不调节和不调节和不调节和不调节 pH pH的两组的两组的两组的两组。实验结果实验结果pH的影响的影响n n根据不同温度和不同根据不同温度和不同根据不同温度和不同根据不同温度和不同pHpH条件下的实验，确定了一条件下的实验，确定了一条件下的实验，确定了一条件下的实验，确定了一个适合个适合个适合个适合L.pentosus LPS26L.pentosus LPS26的生长条件用于生产的生长条件用于生产的生长条件用于生产的生长条件用于生产EPSEPS。L.pentosus LPS26L.pentosus LPS26培养于培养于培养于培养于SDMSDM中，中，中，中，葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖含量含量含量含量30g/L30g/L，pH6.0pH6.0，2020培养。我们可以确定总培养。我们可以确定总培养。我们可以确定总培养。我们可以确定总EPSEPS的产量为的产量为的产量为的产量为511mg/L511mg/L。实验结果最优培养条件实验结果最优培养条件uu在在在在D D0.02 h0.02 h-1-1时得到最大的时得到最大的时得到最大的时得到最大的EPS AEPS A产量，而更高的稀释度会导致产量显著下降产量，而更高的稀释度会导致产量显著下降产量，而更高的稀释度会导致产量显著下降产量，而更高的稀释度会导致产量显著下降。uu从从从从0.020.02到到到到0.07 h0.07 h-1-1的稀释度范围内，只得到很少的的稀释度范围内，只得到很少的的稀释度范围内，只得到很少的的稀释度范围内，只得到很少的EPS BEPS B（50mg50mg每升），因此，每升），因此，每升），因此，每升），因此，EPS BEPS B的产量似乎不受生长率的影响。的产量似乎不受生长率的影响。的产量似乎不受生长率的影响。的产量似乎不受生长率的影响。uu极稀的稀释度下（极稀的稀释度下（极稀的稀释度下（极稀的稀释度下（0.020.02到到到到0.04 h0.04 h-1-1），葡萄糖消耗量和乳酸盐的生成量相似。在），葡萄糖消耗量和乳酸盐的生成量相似。在），葡萄糖消耗量和乳酸盐的生成量相似。在），葡萄糖消耗量和乳酸盐的生成量相似。在更高的更高的更高的更高的D D值（值（值（值（0.070.07到到到到0.11 h0.11 h-1-1）下，残留的葡萄糖增多，而乳酸盐浓度降低。）下，残留的葡萄糖增多，而乳酸盐浓度降低。）下，残留的葡萄糖增多，而乳酸盐浓度降低。）下，残留的葡萄糖增多，而乳酸盐浓度降低。uu在在在在D D0.02 h0.02 h-1-1时，时，时，时，EPSEPS产量最大（产量最大（产量最大（产量最大（18.9mgEPS18.9mgEPS/g g葡萄糖）葡萄糖）葡萄糖）葡萄糖），单位体积产率单位体积产率单位体积产率单位体积产率PvPv最最最最大（大（大（大（7.08mgL7.08mgL1 1h h1 1）。）。）。）。实验结果连续培养的影响实验结果连续培养的影响uu在牛奶和补加葡萄糖和酵母提取物的牛奶中，对在牛奶和补加葡萄糖和酵母提取物的牛奶中，对在牛奶和补加葡萄糖和酵母提取物的牛奶中，对在牛奶和补加葡萄糖和酵母提取物的牛奶中，对LPS26LPS26和酸化的和酸化的和酸化的和酸化的L.lactisL.lactis进进进进行联合培养。在牛奶培养基中，行联合培养。在牛奶培养基中，行联合培养。在牛奶培养基中，行联合培养。在牛奶培养基中，EPSEPS产量很低，但产量很低，但产量很低，但产量很低，但主要产生的是主要产生的是主要产生的是主要产生的是EPS BEPS B。uu对牛奶培养基进行补充后，不仅微生物量有了明显的增加（对牛奶培养基进行补充后，不仅微生物量有了明显的增加（对牛奶培养基进行补充后，不仅微生物量有了明显的增加（对牛奶培养基进行补充后，不仅微生物量有了明显的增加（LPS26 LPS26 2.5102.5108 8CFU mlCFU ml-1-1和和和和IPLA947 1.810IPLA947 1.8109 9CFU mlCFU ml-1-1）而且）而且）而且）而且EPS BEPS B有了极大的增长，有了极大的增长，有了极大的增长，有了极大的增长，所以所以所以所以EPSEPS总产量也有了明显的增长（总产量也有了明显的增长（总产量也有了明显的增长（总产量也有了明显的增长（162.9mg/L162.9mg/L）实验结果牛奶培养基的影响实验结果牛奶培养基的影响1.1.我们的结果显示培养条件对我们的结果显示培养条件对我们的结果显示培养条件对我们的结果显示培养条件对L.pentosusL.pentosus的生长和产生的生长和产生的生长和产生的生长和产生EPSEPS有明显的影响，并能够证明用分批发酵时有明显的影响，并能够证明用分批发酵时有明显的影响，并能够证明用分批发酵时有明显的影响，并能够证明用分批发酵时EPSEPS产量产量产量产量高达高达高达高达511mg/L511mg/L。2.2.碳源对碳源对碳源对碳源对L.pentosus L.pentosus LPS26 LPS26的生长和产生的生长和产生的生长和产生的生长和产生EPSEPS的量以及两的量以及两的量以及两的量以及两种种种种EPSEPS的比率有明显的影响。葡萄糖提供的比率有明显的影响。葡萄糖提供的比率有明显的影响。葡萄糖提供的比率有明显的影响。葡萄糖提供EPSEPS的高产量的高产量的高产量的高产量而且明显更支持而且明显更支持而且明显更支持而且明显更支持EPS A EPS A 的合成。相反，果糖更利于的合成。相反，果糖更利于的合成。相反，果糖更利于的合成。相反，果糖更利于EPS EPS B B 的合成。的合成。的合成。的合成。L.pentosus L.pentosus LPS26LPS26的生长和的生长和的生长和的生长和EPSEPS的产生无直的产生无直的产生无直的产生无直接联系，因为最大活菌数量与接联系，因为最大活菌数量与接联系，因为最大活菌数量与接联系，因为最大活菌数量与EPS EPS 的最大产量并不相的最大产量并不相的最大产量并不相的最大产量并不相符。符。符。符。3.3.最低糖浓度时葡萄糖的单位产最低糖浓度时葡萄糖的单位产最低糖浓度时葡萄糖的单位产最低糖浓度时葡萄糖的单位产EPSEPS量是最高的，糖原的量是最高的，糖原的量是最高的，糖原的量是最高的，糖原的过量并不能刺激过量并不能刺激过量并不能刺激过量并不能刺激EPSEPS的合成，只会降低合成的效率。的合成，只会降低合成的效率。的合成，只会降低合成的效率。的合成，只会降低合成的效率。分析讨论分析讨论4.4.较低温度时较低温度时较低温度时较低温度时EPS AEPS A和和和和EPS BEPS B的产量会增加，这是产的产量会增加，这是产的产量会增加，这是产的产量会增加，这是产EPSEPS嗜温嗜温嗜温嗜温乳酸杆菌的共有特征。认为缓慢生长的细胞显现出缓慢的乳酸杆菌的共有特征。认为缓慢生长的细胞显现出缓慢的乳酸杆菌的共有特征。认为缓慢生长的细胞显现出缓慢的乳酸杆菌的共有特征。认为缓慢生长的细胞显现出缓慢的细胞壁复合物的生物合成，会有更多的脂质运载体的前体细胞壁复合物的生物合成，会有更多的脂质运载体的前体细胞壁复合物的生物合成，会有更多的脂质运载体的前体细胞壁复合物的生物合成，会有更多的脂质运载体的前体分子在分子在分子在分子在EPSEPS的合成中被利用。的合成中被利用。的合成中被利用。的合成中被利用。5.5.pHpH值的控制同样可增强值的控制同样可增强值的控制同样可增强值的控制同样可增强L.pentosus L.pentosus LPS26 LPS26产生产生产生产生EPSEPS的能力。的能力。的能力。的能力。同时，我们再次观察到了菌体生长和同时，我们再次观察到了菌体生长和同时，我们再次观察到了菌体生长和同时，我们再次观察到了菌体生长和EPSEPS的生产之间并不偶的生产之间并不偶的生产之间并不偶的生产之间并不偶联，因为联，因为联，因为联，因为pH 5.0pH 5.0时菌体数量达最大而时菌体数量达最大而时菌体数量达最大而时菌体数量达最大而pH6.0pH6.0时时时时EPSEPS的产量达的产量达的产量达的产量达到最大。到最大。到最大。到最大。6.6.通过连续培养得到的结果表明通过连续培养得到的结果表明通过连续培养得到的结果表明通过连续培养得到的结果表明EPS AEPS A和和和和EPS BEPS B有着不同的生有着不同的生有着不同的生有着不同的生产动力学。产动力学。产动力学。产动力学。EPS AEPS A主要在一个非常低的稀释率（主要在一个非常低的稀释率（主要在一个非常低的稀释率（主要在一个非常低的稀释率（0.02h0.02h-1-1），），），），有较大产率。而有较大产率。而有较大产率。而有较大产率。而EPS BEPS B的生产并不受生长速率的影响。的生产并不受生长速率的影响。的生产并不受生长速率的影响。的生产并不受生长速率的影响。分析讨论分析讨论1.1.7.7.在一个低的在一个低的在一个低的在一个低的D(0.02D(0.020.04h0.04h-1-1)下，相似的糖消耗与乳酸盐下，相似的糖消耗与乳酸盐下，相似的糖消耗与乳酸盐下，相似的糖消耗与乳酸盐生产被也观察到。这个发现表明糖类作为一种重要的碳源组生产被也观察到。这个发现表明糖类作为一种重要的碳源组生产被也观察到。这个发现表明糖类作为一种重要的碳源组生产被也观察到。这个发现表明糖类作为一种重要的碳源组成部分被吸收后代谢成为与成部分被吸收后代谢成为与成部分被吸收后代谢成为与成部分被吸收后代谢成为与EPSEPS合成有关的核糖核苷酸前体合成有关的核糖核苷酸前体合成有关的核糖核苷酸前体合成有关的核糖核苷酸前体物质。物质。物质。物质。2.2.8.8.结果显示，结果显示，结果显示，结果显示，EPS BEPS B是牛奶培养基的主要聚合物，而在是牛奶培养基的主要聚合物，而在是牛奶培养基的主要聚合物，而在是牛奶培养基的主要聚合物，而在SDMSDM培养基中培养基中培养基中培养基中EPS AEPS A是最丰富的是最丰富的是最丰富的是最丰富的EPSEPS形式。这是一个培养基形式。这是一个培养基形式。这是一个培养基形式。这是一个培养基成分影响一种菌株生产不同比率的成分影响一种菌株生产不同比率的成分影响一种菌株生产不同比率的成分影响一种菌株生产不同比率的EPSEPS的例子。的例子。的例子。的例子。3.3.9.9.关于两种关于两种关于两种关于两种EPSEPS的结构更深入的研究正在进行中，我们希的结构更深入的研究正在进行中，我们希的结构更深入的研究正在进行中，我们希的结构更深入的研究正在进行中，我们希望更深入的理解它们的结构功能之间的关系。望更深入的理解它们的结构功能之间的关系。望更深入的理解它们的结构功能之间的关系。望更深入的理解它们的结构功能之间的关系。分析讨论分析讨论谢谢大家！谢谢大家！加油，好好做！9 9、静夜四无邻，荒居旧业贫。、静夜四无邻，荒居旧业贫。4 4月月-23-234 4月月-23-23Saturday,April 22,2023Saturday,April 22,20231010、雨中黄叶树，灯下白头人。、雨中黄叶树，灯下白头人。16:04:2016:04:2016:04:2016:04:2016:0416:044/22/2023 4:04:20 PM4/22/2023 4:04:20 PM1111、以我独沈久，愧君相见频。、以我独沈久，愧君相见频。4 4月月-23-2316:04:2016:04:2016:0416:04Apr-23Apr-2322-Apr-2322-Apr-231212、故人江海别，几度隔山川。、故人江海别，几度隔山川。16:04:2016:04:2016:04:2016:04:2016:0416:04Saturday,April 22,2023Saturday,April 22,20231313、乍见翻疑梦，相悲各问年。、乍见翻疑梦，相悲各问年。4 4月月-23-234 4月月-23-2316:04:2016:04:2016:04:2016:04:20April 22,2023April 22,20231414、他乡生白发，旧国见青山。、他乡生白发，旧国见青山。22 22 四月四月 2023 20234:04:20 4:04:20 下午下午16:04:2016:04:204 4月月-23-231515、比不了得就不比，得不到的就不要。、比不了得就不比，得不到的就不要。四月四月 23 234:04 4:04 下午下午4 4月月-23-2316:0416:04April 22,2023April 22,20231616、行动出成果，工作出财富。、行动出成果，工作出财富。2023/4/22 16:04:202023/4/22 16:04:2016:04:2016:04:2022 April 202322 April 20231717、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。4:04:20 4:04:20 下午下午4:04 4:04 下午下午16:04:2016:04:204 4月月-23-239 9、没有失败，只有暂时停止成功！。、没有失败，只有暂时停止成功！。4 4月月-23-234 4月月-23-23Saturday,April 22,2023Saturday,April 22,20231010、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。16:04:2016:04:2016:04:2016:04:2016:0416:044/22/2023 4:04:20 PM4/22/2023 4:04:20 PM1111、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。4 4月月-23-2316:04:2016:04:2016:0416:04Apr-23Apr-2322-Apr-2322-Apr-231212、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。16:04:2016:04:2016:04:2016:04:2016:0416:04Saturday,April 22,2023Saturday,April 22,20231313、不知香积寺，数里入云峰。、不知香积寺，数里入云峰。4 4月月-23-234 4月月-23-2316:04:2016:04:2016:04:2016:04:20April 22,2023April 22,20231414、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。22 22 四月四月 2023 20234:04:20 4:04:20 下午下午16:04:2016:04:204 4月月-23-231515、楚塞三湘接，荆门九派通。、楚塞三湘接，荆门九派通。四月四月 23 234:04 4:04 下午下午4 4月月-23-2316:0416:04April 22,2023April 22,20231616、少年十五二十时，步行夺得胡马骑。、少年十五二十时，步行夺得胡马骑。2023/4/22 16:04:202023/4/22 16:04:2016:04:2016:04:2022 April 202322 April 20231717、空山新雨后，天气晚来秋。、空山新雨后，天气晚来秋。4:04:20 4:04:20 下午下午4:04 4:04 下午下午16:04:2016:04:204 4月月-23-239 9、杨柳散和风，青山澹吾虑。、杨柳散和风，青山澹吾虑。4 4月月-23-234 4月月-23-23Saturday,April 22,2023Saturday,April 22,20231010、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。16:04:2016:04:2016:04:2016:04:2016:0416:044/22/2023 4:04:20 PM4/22/2023 4:04:20 PM1111、越是没有本领的就越加自命不凡。、越是没有本领的就越加自命不凡。4 4月月-23-2316:04:2016:04:2016:0416:04