发光法测定菌体ATP含量

发光法测定菌体 ATP含量 1.实验目的 2.实验原理 3.试剂 4.实验材料与仪器 5.操作步骤及结果 一 .实验目的 1.理解 ATP的理化特性和生理功能 ; 2.学会用荧火虫素 -荧火虫素酶生物发 光法定量测定 ATP含量的方法 ; 3.理解 ATP生物发光原理及应用研究。 二 .实验原理 生物发光 (bioluminescence)在希腊 语中表示活着的意思 ,在拉丁语中表示 发光、发亮的意思。目前，生物发光 应用最广最主要的是荧光素 -荧光素酶 反应发出的荧光，荧光素酶存在于荧 火虫、水母一上些细菌中，它是生物 内产生的一种生物反应蛋白质。 1.ATP生物发光工作原理 荧光素酶 -ATP检测法，其化学反应的结果 是把化学能转化为光能。细胞内源性的 ATP 含量可以反应活细胞的数量和活性。其化 学反应如下： ATP+D-L- Luciferin +O2 Oxyluciferin+AMP+ppi+O2+Light 当细胞受损或死亡时，其 ATP值迅速下 降或消失，基于这一原理，检测细胞内的 ATP含量，即可反应细胞的存活状况， ATP 浓度与活细胞数密切相关。 检测时先将 ATP与提取剂充分混合，使 细胞壁和细胞膜裂解，释放 ATP，再加入荧 光素 -荧光素酶， ATP在荧光素和荧光素酶 的作用下，使其释放磷酸基团同理发出荧 光，用生物荧光仪检测相对荧光强度 （ relative light units,RLU） ,由此测出 ATP 含量，进而反映活细胞数。 2.ATP生物发光特点 优点 ： 灵敏、快速、简便、稳定 是 ATP生物 发光的主要优势所在，同时可以把 ATP数量 化，用荧光强度（ RLU）把光定量，广泛 应用于食品工业，医药，生物学等领域。 缺点 ：荧光强度和菌落形成单位（ CFU） 之间没有直接关系，也无法对细菌的种属 进行鉴定。 3.应用研究 检测环境是否被有害的微生物污染， 食品卫生的检测和生产环境实时监测 （ HACCP）等。 用于乳制品的检测、调味品如脱水蔬菜 的细菌学的测定。 新药筛选及疗效评价：广泛应用于需 要进行大量快速初选工作的新药筛选 中。 细胞免疫活性检测应用： ATP生物发 光法还可测定 T细胞的免疫活性。 三 .试剂 1.荧光素 -荧光酶试剂 将解冻后的 12mlReocnstiuttoin Bueffr与 荧光素酶 -荧光素粉剂混合，轻轻摇晃（不 能振荡）使其溶解。第一次使用前在室温 下放置 1h，以后只需 20min左右。不用时要 放置在 -20C 下保存。 取 0.5ml的标准 ATP试剂（ 10-7mol/l）到 5ml的容量瓶中，加入缓冲液定容，得到 10- 8mol/l的标准 ATP试剂。 用移液管取 5ml的上述标准 ATP试剂到 50ml 的容量瓶中，加入缓冲溶液定容，得到 10- 9mol/l的标准 ATP试剂。 重复以上过程，得到 10-10mol/l和 10-11mol/l 的标准 ATP试剂。 2.标准 ATP试剂 3.缓冲液 以 Tris-Acetate作为缓冲液。称取一定量 的 Tris碱，使定容后的浓度为 0.05mol/l，定 容前需要先调节 PH值。将 PH计插入 TrisI溶 液中，慢慢滴加乙酸溶液，直到 PH值为 7.8， 然后定容，在 4C下保存。 4.ATP提取液 采用三氯醋酸（ TCA）作为 ATP提取剂， 浓度为 0.03g/ml，在 4C下保存。对于不同 的微生物，采用不同的浓度进行提取，细 菌和真核细胞的提取浓度一般为 0.005- 0.025g/ml，酵母真菌类则适当高一些。提 取结束后，要用缓冲液将 TCA的浓度稀释 到一定的浓度，再进行测量，以减少 TCA 对反应的影响。 四 .实验材料与仪器 TD-20/20荧光光度计 抽滤器及真空泵（过滤微生物进，采用 0.22 微米的滤膜） PH计。 五 .操作步骤 1.ATP的提取 在测量微生物的 ATP前，需要将 ATP从微 生物内提取出来， ATP的提取效率直接影 响生物量测定结果。因此， ATP的提取也 就成为 ATP生物发光法测定生物量和重要 步骤之一。 TCA法和 加热煮沸法 是两种常用的 ATP 提取方法。 TCA法 TCA法是目前最常用的 ATP提取方法。 TCA对活细胞 有两种作用：一是 破裂细胞 ，释放 ATP，二是 ATP水 解酶失活 。 提取普通微生物中的 ATP时， TCA浓度为 0.015g/m 此浓度下， TCA对 ATP与荧光素酶的生物发光反应较 强的抑制作用，必须在反应前对提取液进行中和， 稀释。使 TCA浓度 小于或等于 0.001g/ml，此时 TCA 对反应的影响基本可以忽略。一般采用 PH7.8左右的 Tris-Aectate缓冲液进行稀释。 具体操作 取样品（如河水等，如果是固体样品需用水悬浮后取 上清或匀浆） 2ml置于试管中 加入 2mlTCA溶液，震荡提取得 3min 取 1ml提取液置于 50ml容量瓶中，用 PH7.8的 Tris- Aectate缓冲液定容 稀释后的提取液置于 4C下保存待测。 此时 TCA的浓度 为 0.0003g/ml， 不会对反应产生 影响 加热煮沸法 加热煮沸法是前期研究中采用较多的 ATP提 取方法。 该方法先将样品中的微生物过滤出来，再 将其置于缓冲液中加热煮沸提取 ATP。 抽滤装置包括真空泵、滤瓶、缓冲瓶 滤膜采用 0.22m孔径的醋酸纤维滤膜 高温加热的作用主要是破碎细胞同时使细胞 内 ATP水解酶失活 具体操作 迅速将滤膜 转移到沸水 浴的缓冲液 中，提取 5min 将装有 8ml缓 冲液的试管置 于沸水浴中量 取一定体积的 样品进行抽滤 将提取液转移到 10ml容量瓶，定 容，试管中残留 的提取液用少量 Tris-Aectate缓冲 液冲洗两次倒入 容量瓶中 混合均匀后 置于 4C下 保存待测 迅速放入冰 水浴中冷却 2.ATP的检测 1)先用标准 ATP试剂作一条标准曲线。测量 得到样品的相对发光值 . 2)测定样品发光值 ,与标准曲线对比，得到样 品中的 ATP含量 , ATP含量可以转化为微生 物的浓度 . 测量荧光所用的仪器是 TD-20/20荧光光度 计，一般将仪器的设置延迟时间设为 60s 标准曲线制作 在测定管中加入 50 l一定浓度的标准溶液 和 50 l缓冲液，测定管置于样品室中，加 入 100l荧光素 -荧光酶反应剂后迅速盖上样 品室的盖子，开始检测。 标准液浓度分别为 10-7mol/l、 10-8mol/l、 10-9mol/l、 10-10mol/l、 10-11mol/l 空白值用去 ATP水代替不同浓度的标准液 进行测定，重复 3次取平均值。 以 ATP浓度的对数值 为 横坐标 ，荧光反应值 RLUS的对数值 为 纵坐标 ，绘制标准曲线。 由标准曲线可见，在一定的范围内， ATP浓 度与荧光反应发光值之间有较好的线性关 系，样品中 ATP浓度与相对发光值对应。 样品测定及结果 用 50 l样品提取液代代替标准 ATP试剂， 具体操作 与制作标准曲线一样 。最后 ATP浓度与微生物浓度之 间的转化，是基于每个微生物包含 5 x10-16gATP。 注意 :荧光素酶的活性衰减很快，在室温下荧光素酶试剂只能 保存 8h，如果测定过程 8h则应将荧光素酶反应剂健壮在多支 小管中，于 4C避光保存。每次使用时都要提前将酶试剂取出， 并室温下放置一段时间，使其恢复到室瘟。如果样品测定要 持续较长的时间，可分装酶制剂于 -20C冷冻保存，保存过程 中要避免反复解冻。如果峡谷个样品量的间隔时间较长，就 需要重新制作标准曲线，以得保证测定的准确性 。