N乙酰半胱氨酸对大鼠颅脑损伤后ICAM1和NFκB表达的影响

N乙酰半胱氨酸对大鼠颅脑损伤后ICAM1和NFB表达的影响 目的 观察N乙酰半胱氨酸（NAC）对大鼠颅脑损伤后细胞间黏附因子1（ICAM1）和核转录因子B(NFB)表达的影响，探讨其脑保护机制。方法 90只Wistar大鼠随机分为假手术组(n=6)、颅脑创伤组(n=42)及颅脑创伤NAC干预组(n=42)。采用自由落体法建立大鼠颅脑创伤模型，应用免疫组织化学法检测NFB和ICAM1表达的变化。结果 与假手术组相比，脑损伤组NFB和ICAM1表达水平明显升高，NAC可降低NFB和ICAM1表达，减轻炎症反应。结论 NAC可能通过抑制NFB和ICAM1的表达，减轻炎症反应，发挥脑保护作用。颅脑损伤 N 乙酰半胱氨酸 核因子 B 细胞间黏附因子 1Abstract：ObjectiveTo explore the effect of NAC on NFB and ICAM1 expression after traumatic brain injury(TBI) in rats,and discuss the mechanisms of neuroprotection by NAC.MethodsNinety adult male Wistar rats were randomly divided into sham group(n=6),TBI group(n=42) and NAC group(n=42).The experimental TBI model was established by Feeneys method.Samples were obtained after injury for inspecting the expression of ICAM1 and NFB proteins by immunochemical method.ResultsCompared with the sham group, the expression levels of ICAM1 and NFB were significantly increased after traumatic brain injury,and NAC significantly decreased the expression of ICAM1 and NFB.ConclusionExpression of NFB and ICAM1 decreased by NAC might be one of the mechanisms in regulating ICAM1,NFB level and inhibiting inflammation in cortex and exerting protective function to neurons.Key words：brain injury;Nacetylcysteine(NAC);NFB;ICAM1研究表明脑损伤后适量的核转录因子(NFB)表达水平可抑制神经细胞凋亡，具有脑保护作用，但其过度激活常导致其它炎性细胞因子的过度表达，导致严重的继发性脑损害1，2。细胞间黏附因子1（ICAM1）可介导多种炎症细胞黏附于血管内皮细胞，是多种炎性因子发挥作用的分子基础3，同时ICAM1的表达又受到包括NFB在内的多种因子的调节。N乙酰半胱氨酸(NAC)是一种含有巯基的还原剂，具有稳定细胞膜、保护细胞活性和清除活性氧等作用4，在减轻心、脑、肝等脏器的缺血再灌注损伤中的作用日益受到关注，而在创伤性颅脑伤中的作用研究较少，本试验旨在观察NAC对大鼠颅脑损伤后伤侧脑组织内NFB和ICAM1表达的影响，探讨有关的作用机制，以期为临床治疗提供理论依据。材料与方法1主要仪器、试剂和实验动物Dympus DP70成像系统，Imageproplus 5.0(IPP5.0)数据分析系统，NAC（Sigma公司），大鼠立体定向仪(江湾型,上海)，ICAM1多克隆抗体（兔抗）（北京博奥森生物技术有限公司）；NFB p65(F6)：sc8008(鼠抗)（Santa Cruz公司），二步法免疫组化试剂盒(抗鼠和抗兔IgGPV6001/6002)、SP试剂盒和DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；3月龄健康雄性Wistar大鼠，SPF级，体重(26020)g（甘肃省中医学院动物实验中心提供）。2实验动物分组及模型制备随机分为假手术组(sham组，n=6)、颅脑创伤组（TBI组，n=42）及NAC干预组（NAC组，n=42），后2组分别分为3、12、24、48、72小时、5、7天组，每组6只。采用改良Feeneys自由落体硬膜外撞击法制作颅脑损伤模型5，致伤冲击力为1000g/cm。假手术组除不打击外，其它步骤同创伤组。NAC干预组于颅脑损伤后立即经腹腔注入NAC150mg/kg， 颅脑创伤组于伤后经腹腔注射等量生理盐水。大鼠清醒后笼中饲养，自由进食水。3标本采集与检测Sham组于伤后24小时取材，余2组在伤后相应时间点分别取材。将大鼠深度麻醉后固定于动物实验台上，剪开胸腔，以生理盐水150ml和4%多聚甲醛150ml先后经左心室灌注固定，同时剪开右心耳。之后完整取出脑组织，冠状切取损伤灶处具有完整皮层的组织固定、石蜡包埋，4m连续切片备用。免疫组化采用SP法测定NFB表达水平、采用二步法测定ICAM1的表达，一抗均按1：150稀释，分别严格按SP和二步法试剂盒说明书操作。免疫阳性染色细胞和血管显微镜下表现为深黄色或棕褐色。在Dympus DP70成像系统高倍光学显微镜下（400），每张切片任选6个非重叠高倍视野进行观察，对ICAM1免疫染色血管进行计数并计算平均值，NFB免疫组化染色标记强度用光密度值(optical density,OD)表示，比较各组OD值。结果1ICAM1表达的变化 ICAM1免疫阳性染色表现为深黄色或棕褐色，主要定位于血管内皮细胞，且主要集中在皮层血管，脉络丛只有少量免疫染色血管（图1a、b和c、d）。NS对照组伤后3小时即可见免疫染色血管开始增多，12小时明显增多，72小时小时达到高峰，之后开始下降，7天时可见明显下降。与sham组相比，TBI组和NAC组3小时组阳性血管数虽有升高，但均无统计学意义（P0.05），余各时间点均明显增高，有非常显著性差异（P0.05），12小时和7天组时，免疫阳性血管数减少，有显著性差异（P2NFB蛋白表达的变化NFB阳性染色定位于胞浆和(或)核膜，呈黄色或棕黄色(图1e、f和g、h)。颅脑损伤后3小时在伤侧脑组织中即可见NFB表达，12小时表达明显升高，24小时达高峰，后表达水平逐渐下降，与sham组比较均有非常显著性差异(P图1颅脑损伤后ICAM1和NFB表达变化(SP400)（略）与TBI组相比：*P0.05 ；与sham组和TBI组比较：*P0.05图2NAC对大鼠颅脑损伤后不同时间点伤侧脑组织ICAM1表达的影响（略）表1NAC对大鼠颅脑伤后不同时间点伤侧脑组织NFB表达的影响（略）与TBI组比较：*P