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第八章第八章 微生物遗传学微生物遗传学菏泽出入境检验检疫局菏泽出入境检验检疫局 贺同欣贺同欣第一节第一节 遗传的物质基础及其特性遗传的物质基础及其特性第二节第二节 遗传信息的表达遗传信息的表达 第三节第三节 细胞中遗传信息的变异细胞中遗传信息的变异第四节第四节 微生物的诱变育种和遗传工程微生物的诱变育种和遗传工程何谓遗传学？遗传学遗传学是关于遗传物质的生理生化性质、世代传递方式，以及所携带的信息在个体发育中的表达的一门科学。早期的遗传学研究亲代与子代之间遗传性状的传递，提出了遗传的染色体理论，对基因进行了作图，并发现了基因重组现象，故名传递遗传学传递遗传学。近代的遗传学则进一步从分子水平上研究基因的构成、复制、表达、突变和修复等，被称为分子遗分子遗传学传学。微生物遗传学涉及部分真核生物，所有的原核生物，以及病毒的遗传；介绍微生物的遗传物质的结构特点、遗传信息的表达与调控、遗传变异的基本规律；介绍通过基因操作改变微生物的遗传信息从而有效地控制或利用微生物的基本策略。第一节第一节 遗传的物质基础及其特性遗传的物质基础及其特性一、遗传物质的鉴定一、遗传物质的鉴定二、脱氧核糖核酸二、脱氧核糖核酸三、基因组三、基因组DNADNA和染色体和染色体四、染色体以外的遗传因子四、染色体以外的遗传因子经典试验1.肺炎链球菌的转化试验 图8.1（a）S型和R型细胞侵染试验一、遗传物质的鉴定一、遗传物质的鉴定分离后的S型细胞物质对R型细胞的转化图8.1（b）结论细胞生物的遗传物质是双链DNA病毒的乙醇物质可以是单链的或双链的DNA或RNA，即：ssDNA，dsDNA，ssRNA或dsRNA。二、脱氧核糖核酸二、脱氧核糖核酸1核酸的化学组成和结构 2DNA的复制方式 3DNA的理化性质1核酸的化学组成和结构 Watson 和Crick在1953年描述了DNA的结构模型：DNA分子是由两条相互平行、方向相反的多核苷酸单链以右手螺旋方向相互缠绕而形成的双螺旋。脱氧核糖和磷酸构成的主链位于外围，通过氢键相互交联的碱基处于双螺旋的内部。腺嘌呤与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对；两条单链互补；一条链的碱基序列限定了另一条链的序列。Rosalind Franklin 的贡献 Watson and Crick proposed DNA structure in 1953 by building models based on chemical and physical data that had been gathered in other labs,primarily x-ray diffraction data collected by Rosalind Franklin et al.2DNA的复制方式 细菌DNA的q-形复制 真核生物DNA的复制10100 m mm 复制叉复制叉复制叉复制叉复制原点复制原点模板模板新生链新生链DNA的滚环复制模式 图8.2切口切口55333模板模板新生链新生链新链连续复制新链连续复制互补链合成互补链合成3DNA的理化性质DNA的稳定性 在溶液中，DNA具有一定的粘性，易受剪切力的破坏；易被核酸酶降解；在强酸中，DNA能被水解成碱基、糖和磷酸；在特定的稀酸中(如pH 34)，不同碱基与核糖之间的糖苷键会发生特异性的断裂，根据这种特异性可测定DNA的碱基序列；在稀碱如0.2当量NaOH中，双链DNA很快变性产生单链DNA，继而单链DNA被进一步破坏。3DNA的理化性质（2）DNA的光学性质 DNA中的碱基属于芳香簇化合物，能够吸收紫外光(UV)。DNA吸收峰的光波波长为260纳米；当浓度为 1 mg/ml时，dsDNA：A260=20ssDNA、RNA：A260 25 人们根据A260测定DNA的浓度，根据A260/A280和估算DNA的纯度。3DNA的理化性质（3）DNA的热变性 双链DNA在一定的高温下解链(变性)产生单链DNA。双链DNA完全解链后，紫外吸收值A260可以提高 40，当吸收值的提高达到中点时的温度称为解链温度（Tm）。1.41.21.070 80 90 100CTm3DNA的理化性质（4）复性、退火或杂交 当温度缓慢降低时，序列互补的单链DNA能够渐渐地重新配对，即复性。不同来源的DNA之间碱基序列互补的区段进行的碱基配对称为退火或杂交，这被广泛应用于DNA的扩增、定点诱变、基因鉴别。3DNA的理化性质（5）分子特征与微生物分类鉴定 DNA中的GC含量通常通过Tm值来测定。同一个属的细菌，GC含量的变化一般小于10。DNADNA杂交技术用于研究亲缘关系近的微生物。如果两菌株在最适条件下杂交，DNA相关性70%，且Tm值差别 2 h使PCR实现自动化。上图为PCR仪，下图为示PCR循环。T(C)90 70 50Time (min)循环 1 循环2 循环3 循环三、基因工程三、基因工程1.1.基因工程总体策略基因工程总体策略2.2.目标基因的克隆与鉴定目标基因的克隆与鉴定3.3.宿主和载体宿主和载体4.4.重组蛋白的生产重组蛋白的生产1.基因工程总体策略（1）基因工程指用人为的方法将所需要的某一供体生物的DNA提取出来，在适当的条件下用适当的酶切割后，把它与载体DNA分子连接起来形成具有自我复制能力的DNA分子复制子，并将它转移到宿主细胞中进行扩增和表达。基因工程总体策略（2）重组蛋白的生产品种、菌株改良遗传基因分析2.目标基因的克隆与鉴定蓝-白选择活性筛选放射自显影或生色反应用32P标记探针迪高莘标记探针及Marker3.宿主和载体克隆载体 是一个能复制的 DNA分子，被用来运载插入的外源基因进入受体细胞。它可以是质粒、噬菌体、粘粒或人工染色体。-L M Prescott et al.,in MICROBIOLOGY,5th ed.外源基因由克隆载体携带进入宿主细胞OriAmpRForeign geneMCSVectors carry genes into host cells质粒图谱范例大肠杆菌K12及其衍生菌株重组蛋白生产的优势:a.可以对基因加以改造;b.基因拷贝数大量提高;c.用强启动子进行快速转录;d.基因翻译得到优化;e.可进行主动调节;f.宿主细胞易于培养.4.重组蛋白的生产a.基因定位突变技术YYYXXXYYYYYYXXXXXXYYYAAATTT CCCAAAYYYXXXTTTAAA GGGTTTXXXBlunting Kination LigationPCR极耐热性木聚糖酶基因的突变效果DNAmRNAProtein基因组重组基因转录翻译多拷贝 强转录 优化翻译b.c.d.蛋白质合成过程中的优势 E.coli 中 lac 启动子 lac&trp 启动子的杂合体 Ptac E.coli 噬菌体 T7启动子 E.coli 的l噬菌体 启动子PL phage PHsh from E.colie.主动调节E.coli表达体系中的调控模式 PL启动子的表达调控PL +1 RBSFGTerminator3040 mRNA热激热敏感性抑制子cIT7启动子的表达调控T7 Promoter待表达基因宿主细胞宿主染色体质粒质粒PlacT7 RNA聚合酶基因012345678910110246810Induction time(h)cell density(OD600)0100200300400500600 xylanase activity(U/mL)pHsh-xynII cell densitypJLA-xynII cell densitypET-xynII cell densitypHsh-xynII activitypJLA-xynII activitypET-xynII activityf.极端酶高效表达极耐热性木聚糖酶基因的表达四、生物种系的遗传改良四、生物种系的遗传改良 及疾病的基因治疗和基因药物及疾病的基因治疗和基因药物 1.1.基因重组微生物基因重组微生物2.2.通过植物转基因改良品种通过植物转基因改良品种3.3.动物的转基因动物的转基因4.4.基因治疗与基因药物基因治疗与基因药物定义：代谢(途径)工程is the use of molecular techniques(or recombinant DNA techniques)to improve the efficiency of pathways that synthesize specific products.-L M Prescott et al.,in MICROBIOLOGY,5th ed1.基因重组微生物Zymomonas mobilis的乙醇发酵途径Entner-Doudoroff pathway丙酮酸乙醛+CO2乙醇乙醇脱氢酶丙酮酸脱羧酶E.coli 的部分代谢途径 EMP途径乳酸 丙酮酸 甲酸CO2+H2 乙酰辅酶A 磷酸转移酶 乙醛脱氢酶乙酰磷酸乙醛 乙酸激酶 乙醇脱氢酶 乙酸乙醇乳酸脱氢酶E.coli 的代谢工程 EMP途径乳酸 丙酮酸乙醛 甲酸CO2+H2 乙酰辅酶A乙醇 磷酸转移酶 乙醛脱氢酶乙酰磷酸乙醛 乙酸激酶 乙醇脱氢酶 乙酸乙醇乳酸脱氢酶丙酮酸脱羧酶乙醇操纵子设计宿主菌株的选择基因的整合表达水平的筛选条件优化等乙醇脱氢酶外原基因构建途径外原基因构建途径利用木质纤维水解液的乙醇发酵菌株利用木质纤维水解液的乙醇发酵菌株菌株菌株 产量产量 得率得率 速率速率 （g/l）（%）（g/l/h）Sacharomyces 1400 21.0 98 1.60Z.mobilis CP4 22.6 88 1.04E.coli KO11 34.7 80 1.16代谢工程菌发酵水平比较2.通过植物转基因改良品种农杆菌属细菌生活在土壤中，从伤口侵入植物组织后，将T-DNA 插入植物的染色体，产生激素刺激细胞生长，并指导细胞合成细菌所需要的营养物质。A.tumefaciens促使细胞过量生长产生大块细胞团，引起冠瘿病；A.rhizogenes侵染植物根部导致异常生长，形成“发根”。这两个种是植物遗传工程的重要工具。T-DNA整合分泌细胞分裂素植物生长素植物细胞核孔VirD2分泌冠瘿碱伤害分泌乙酰丁香酮农杆菌细胞核Pi-VirA诱导vir表达从Ti质粒中切出TDNAVirD4VirD2VirB农杆菌和植物的相互作用用Ti质粒构建的穿梭载体3.动物的转基因最有效方法：用病毒转染动物或动物胚胎。主要目的：用动物表达产生人类特定的组织或器官；建立人类疾病治疗的动物模型；昆虫、猪、羊等都能被用来表达人类蛋白。逆转录蛋白（retrovirus）单链RNA，侵染哺乳动物；侵染后，RNA逆转录产生双链DNA；启动子很强，是基因治疗的理想载体。杆状病毒（baculovirus）是双链DNA昆虫病毒，粒子杆状，可以被单独排出胞外，也能在细胞内被包装成多角体，即：许多杆状粒子被包埋在多角蛋白中。多角蛋白的启动子特别强，可大量表达外源基因；昆虫体系能完善翻译后的修饰；适用于生产动物蛋白。4.基因治疗与基因药物 有些疾病的发生是由于染色体中的某一个基因失常，彻底治愈这类疾病的方法是用正常基因来替代缺陷基因。将新基因导入人体，对缺陷基因进行改正或修复，从而对疾病进行治疗的方法称为基因治疗。基因治疗中通常以逆转录病毒为载体，将新基因直接导入体内的增殖细胞。反义RNA作为基因药物有些疾病是由于某一种蛋白的不正常表达所引起，如大多数病毒病、癌症、早老性痴呆等都是由于一些不应有的基因表达所导致的病症。解决这些问题的有效办法是防止相关基因的转录和表达。反义RNA的碱基序列与mRNA上翻译起始区域附近的序列互补，与mRNA结合后能有效地阻止核糖体的结合和翻译的启动。RNA干涉现象这个现象最早发现于线虫中，其大致过程是：进入细胞的双链RNA在细胞质中被双链RNA酶切割成2123个碱基的短小干扰RNA(siRNA)；siRNA随之解旋，所产生的单链和其它的因子一起形成一种复合体，叫做RNA诱导的沉默复合体（RISC）；RISC通过siRNA识别具有互补序列的靶mRNA并将其切断。siRNA作为基因药物siRNA在使用效率和特异性方面优于反义RNA。siRNA的发展非常迅速，已经开始进入眼病、肝炎等疾病的临床应用。2005年我国科学家宣布用siRNA抑制SARS病毒的试验取得成功。主要参考书：1.Madigan,MT,JM Martinko,and J Parker.2003.Brock Biology of Microbiology,10th ed.Printice Hall,New Jersey.2.Talaro,KP.2005.Foundations in Microbiology,5th ed.McGraw-Hill co.&High Education Press,Beijing.3.Prescott,LM,JP Harley,and DA Klein.2002.Microbiology,5th ed.McGraw-Hill co.&High Education Press,Beijing.4.Turner,PC,AG McLennan,AD Bates and MRH White.1997.Instant Notes in Molecular Biolgy.Bios Scentific Publishers Limited,2000.5.Maloy,SR,JE Cronan Jr,and D Freifelder.1994.Microbial Genetics,2nd ed.Jones and Bartlett Publishers,Boston.6.陈三凤，刘德虎.2003.现代微生物遗传学.化学工业出版社，北京.7.周德庆.2002.微生物学教程.高等教育出版社，北京.
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