发酵过程中噬菌体感染问题0001

发酵过程中噬菌体感染问题1噬菌体噬菌体是侵染细菌的微生物病毒，广泛分布于自然界中。在生产中见到的噬菌体为蝌蚪 形，直径约0.1um，其形态在显微镜下看不见，通过电子显微镜放大9X104倍后才能看见。 故在生产中平时对噬菌体看不见摸不着，无形之中增加了对其了解和预防的难度。2噬菌体的主要特性2.1专一的寄生性。噬菌体只能在专一的宿主细胞中生长繁殖，只能在活的、处于繁殖 阶段的细胞中生长繁殖，不能脱离宿生而自行生长繁殖。如果不同菌株的亲缘关系比较近， 那么此菌株也是会感染的，特别是针对长期生产同一产品的发酵工厂要特别注意，在换新菌 株之前必须了解其背景。2.2不耐热性。游离的噬菌体在45条件下10min就可使其失活。2.3不耐药性。直接在噬菌体上喷洒1%新洁尔灭、75%酒精、1%双氧水、5%的甲醛等 都可使其失活。3感染噬菌体后的现象噬菌体分烈性噬菌体和温和性噬菌体。温和性噬菌体由于其潜在的危害性大，有时候感 染了，但不爆发，为以后的大面积爆发埋下了隐患。在从事发酵工作时就遇到，车间周围环 境恶化的已经相当厉害，仅一个星期中上的罐中有75%罐都爆发了噬菌体，除了一罐以外， 且表观中基本看不出染噬菌体的现象，而电镜观察是能看到噬菌体存在的。感染后爆发的现象有：3.1发酵液光密度开始上升，而后下降。但有时也不上升，当把1%的噬菌体人为的接 入罐中，光密度始终处于最低位3.2 pH逐渐上升，一般升到7.5，不再下降3.3耗糖、氨缓慢或停止3.4 OD回升3.5泡沫大、料液略黏3.6镜检时发现菌体减少，发胖，革兰氏染色后呈现红色碎片。严重时，可出现拉丝或 网状，或呈鱼刺状，几乎看不到完整菌体。3.7用含有噬菌体的发酵液点在平板上能看到噬菌斑4 噬菌体的预防4.1五大误区4.1.1精度为0.01um的空气过滤器能阻拦噬菌体空气。过滤器中的0.01um的精度不是 单指膜的精度，他是把布朗运动、撞击等拦截都计算在内的，故0.01um只是个相对精度， 实际上膜的绝对精度在0.2um左右，故0.01um的空气过滤器可以挡住一部分噬菌体，但不 能完全挡住。用过滤器的洗脱液经电镜观察，可以看到噬菌体的存在。4.1.2噬菌体不耐热，65以上的温度可杀死噬菌体。我们所说的热灭菌是指达到一定 的温度并维持一定的时间，使微生物致死的过程，可在实际生产中我们经常会遇到温度达到 了使噬菌体致死的温度，可是却杀不死噬菌体，主要原因在于维持时间不够。这就很容易解 释为什么空气在进罐前就已经加热到70C，可噬菌体仍然能活着进罐。4.1.3噬菌体对药物敏感。甲醛等消毒剂可杀死噬菌体原理同上，虽然药的浓度和剂量 足够，可是如果维持时间不够仍起到不杀菌效果。用5%的甲醛对全厂区喷洒，而后在环境 中取样测定，仍有很多活噬菌体。4.1.4预防噬菌体是发酵车间的事情，与其他车间无关。噬菌体的防治是要上下齐动手，人人都参于。发酵要做好是需要各部门配合且长期坚持下去。4.1.5生产正常时，对噬菌体的警惕可以放松一点了。对于噬菌体的防治，我们要做到 年年防、月月防、日日防、时时防，至少每月召开一次关于噬菌体的分析会，每年召开一次 噬菌体的总结会。4.2预防措施4.2.1活菌体的排放是噬菌体发生发展的首要条件，故如何控制活菌体的排放成为噬菌 体预防的关键所在。4.2.1.1每次上罐前对发酵罐进行空气试漏处理，防止由于设备原因造成话菌的外泄和噬 菌体的进入。4.2.1.2在接完种后，必须对残余种子液、接种瓶、种子罐及其连接管道附件等用蒸汽或 药物消毒，没经过灭活处理的种子液不得排入污水池。4.2.1.3在发酵过程中，需要知道细菌的生长情况，要求定时取样对发酵液进行检测分析。 取样最好在无风的条件下进行，取样口下方需设一个装有碱液（pHN11）的容器，除了加 盖取样瓶中的料液外，其余料液必须全部进入该碱容器，切勿喷洒或直接进入下水道。取完 样后，要用消毒水对取样者的手、取样瓶、装碱容器和以取样品为中心的上下左右1m的空 间进行立体的喷洒；取样瓶需装在盛有消毒水的容器中直到化验室。4.2.1.4化验室检测的对象就是带有活菌的料液，检测完pH后的电极需先用新洁尔灭冲 洗，冲洗水入pHN11的碱桶中；测OD时，移取原液的移液管或移液枪头须入碱水浸泡， 比色管、比色器皿用新洁尔灭清洗浸泡30min后才可继续使用；离心管用新洁尔灭清洗浸 泡30min后才可继续使用，且离心后固相及其清洗水须入碱桶中，凡是与料液有直接接触 的液体废弃物须入碱桶，严禁直接排入下水池；凡是与料液有直接接触的固体废弃物须有 pHN11碱水浸泡2h后方可废弃。4.1.2.5在发酵罐运行过程中有大量的尾气要外排，而这尾气中就含有活菌体，故尾气需 经过蒸汽加热、热水处理和末端处理并且要排到远离车间100m以上的车间下风口位置。4.2.1.6在放罐时，就是把大量的菌体排到下游，故对于放罐料液需要进行加热（70 10min）和调酸（pH23）处理。4.2.2如果在活菌的控制上做得比较好了，但仍避免不了有微量的活菌外泄，那就通过切断 噬菌体与发酵液的接触来预防噬菌体的污染。4.2.2.1提高吸风口高度，离地面每提高10m，空气中的含菌量可减少一个数量级。故吸 风口高度越高越好，建议最低高度需超过发酵车间楼顶高度10m。4.2.2.2在空压机进口前加装5um的过滤器，可以过滤掉很大一部分杂菌。4.2.2.3加强环境消毒车间内部用漂白水和新洁尔灭轮流对所有地面角落进行喷洒，定点放置固体二氧化碳， 使车间内部能闻到淡淡的药味。每天早晚一次对车间地沟用漂白粉消毒，保持地沟内清洁无 积水。车间周围用C1O2、漂白粉每天喷洒2次。4.2.2.4加强普查力度定期（3天1次）对车间内部和车间周围环境中的杂菌含量进行普查统计，重点部位要 求每天普查，对测得不合格的区域进行重点消毒，并且分析杂菌的来源。每月1次选择有代 表性的样品灭活后用电镜复检。4.2.2.5加强对蛇管的检查力度。特别是弯头和焊接部分，极易受到料液的腐蚀而穿孔。 蛇管中循环水的压力一般大于罐内压力，不管穿孔多少，水中的噬菌体会源源不断的进入发 酵罐中，车间对蛇管3年来的4400m管道480只弯头及其连接管道的渗漏部位和数量统计 如下：蛇管弯头蛇管焊缱蛇管直管备注136S3可见在所有的漏点中，弯头渗漏的比例达到了 88%，需特别引起重视。5感染噬菌体后的处理办法当发酵罐上出现噬菌体的典型现象后，一般说来是车间周围环境污染的相当厉害了。此 时切忌不要多上罐，因为罐上得越多，周围环境污染更厉害。最好是减产或停产一个星期。5.1发酵罐如果在20h感染噬菌体，那么立即加热到70C维持10min后转到另外一个空 消好的罐中，进行补种后重新发酵。如果在20h后感染的话，能产多少酸就让它产多少酸， 如果不产酸的话就120C，30min处理，排入污水池。5.2感染噬菌体后的发酵罐及其相关联的系统都要经过处理：5.2.1发酵罐要经过空消121C，30min一5%甲醛100C，4h-4%碱水100C，4h空消 121C，30min 处理5.2.2所有与罐体直接相连的阀门拆下来肢解后用4%碱水浸泡4h，然后组装好试压 （0.8MPa的压缩空气）不漏后待用。5.2.3物料管道用5%甲醛熏蒸4h，然后用4%热碱水浸泡30min以上，用清水清洗干净 备用。5.2.4移种管道用5%甲醛熏蒸4h，煮罐后的碱水通过移种管道排出，再用蒸汽消毒1h， 要求每个排污阀都要微开，确保有水或汽排出。5.2.5把补料罐先清空，补料管道用5%甲醛熏蒸4h，煮罐后的碱水通过移种管道排出， 再用蒸汽消毒1h，要求每个排污阀都要微开，确保有水或汽排出。5.2.6放料管道用5%甲醛熏蒸4h，煮罐后的碱水通过放料管道排出，再用蒸汽消毒1h5.2.7空气总管用5%甲醛熏蒸4h，要求每个支路都要消到，再用蒸汽冲刷3h，最后用 空气吹干。5.2.8配料槽储料槽等用4%热碱水浸泡4h。5.2.9取样瓶取样篮等用消毒水或碱水浸泡。5.2.10空气过滤器重消吹干后备用。要用坚决、彻底的态度来对待噬菌体，宁可做过头 也不能少做或不做。5.3立即召开车间会议，探讨工艺管线等有无缺陷，如果存在立即整改5.4立即制定相应的卫生和环境消毒策略，并予以执行。总之，随着科技的进步，人类对噬菌体研究的深入，今后将会有更多有效的措施用于工业噬 菌体的防治，确保发酵生产的正常运行。