高中生物选修实验分离以尿素为氮源的微生物

实验实验2分离以尿素为氮源分离以尿素为氮源的微生物的微生物实验原理：实验原理：脲或称尿素，是蛋白质降解的产物。人和脲或称尿素，是蛋白质降解的产物。人和其它哺乳动物的尿中都含有尿素，尿素一其它哺乳动物的尿中都含有尿素，尿素一般不能直接被农作物吸收。有一些细菌含般不能直接被农作物吸收。有一些细菌含有脲酶，它们可以通过降解尿素作为其生有脲酶，它们可以通过降解尿素作为其生长的氮源。选择以尿素作为唯一氮源即可长的氮源。选择以尿素作为唯一氮源即可分离出此类微生物。分离出此类微生物。(NH2)2C=O+H2O 2NH3+CO2脲酶脲酶选择培养基选择培养基定义：定义：是根据某一种或某一类微生物的是根据某一种或某一类微生物的特殊营养特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来微生物中分离出来(即提供有利于目的菌株生长的即提供有利于目的菌株生长的条件包括营养、温度、条件包括营养、温度、pH等，同时抑制或阻止其等，同时抑制或阻止其他微生物生长。他微生物生长。实例应用：实例应用：1、培养基中加入抗生素可以筛选出抗生素抗性菌、培养基中加入抗生素可以筛选出抗生素抗性菌2、培养基中缺乏碳源时，可筛选出自养型生物、培养基中缺乏碳源时，可筛选出自养型生物(1)全营养全营养LB固体培养基：固体培养基：蛋白胨蛋白胨0.25g、酵母提取物、酵母提取物0.12g、NaCl 0.25g、琼脂糖琼脂糖0.5g、加水、加水25ml。灭菌待用。灭菌待用。(2)尿素固体培养基：尿素固体培养基：0.025g葡萄糖、葡萄糖、NaCl 0.12g、K2HPO40.12g、酚红酚红0.25mg、琼脂糖琼脂糖0.5g、加水、加水15ml。灭菌待用。灭菌待用。冷却到冷却到60时加入经时加入经G6玻璃漏斗过滤玻璃漏斗过滤（使其无菌）（使其无菌）的的尿素溶液。尿素溶液。培养基中的尿素在细菌的脲酶培养基中的尿素在细菌的脲酶催化下分解产生催化下分解产生NH3，呈碱性，呈碱性，使细菌周围培养基的颜色发生使细菌周围培养基的颜色发生变化：变化：酸黄碱红酸黄碱红制备培养基：制备培养基：步骤：步骤：1、制平板：、制平板：在在60左右时，将两只三角瓶左右时，将两只三角瓶中已灭菌的中已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养固体培养基和尿素固体培养基，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，基，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固在水平的超净台上摇匀，平放至凝固步骤：步骤：2、制备细菌悬液。、制备细菌悬液。在无菌条件下，将在无菌条件下，将1g土土样加到有样加到有99mL无菌水的三角瓶中，振荡无菌水的三角瓶中，振荡10min，即成，即成102土壤稀释液。依此法制土壤稀释液。依此法制备备103、104和和105的土壤稀释液。的土壤稀释液。（10倍稀释法：倍稀释法：0.5mL悬液悬液+4.5 mL无菌水）无菌水）步骤：步骤：3、用涂布分离法分离细菌。、用涂布分离法分离细菌。取取104和和105土壤稀释液各土壤稀释液各0.1mL，分别加入到，分别加入到LB培养基和尿素培养基中，用玻璃刮培养基和尿素培养基中，用玻璃刮刀将菌液涂布到整个平面上刀将菌液涂布到整个平面上步骤：步骤：4、培养细菌。、培养细菌。将培养皿倒置，在将培养皿倒置，在37恒温恒温箱中培养箱中培养2448h，观察菌落数，观察菌落数 5、观察。、观察。全营养培养基中菌落较多，尿素全营养培养基中菌落较多，尿素培养基只有少量菌落。培养基只有少量菌落。思考与练习：思考与练习：1、为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培、为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？养基？答：琼脂是未被纯化的混合物，内含一定答：琼脂是未被纯化的混合物，内含一定的含的含N化合物，用琼脂糖替代琼脂后，微生化合物，用琼脂糖替代琼脂后，微生物只能以尿素为唯一物只能以尿素为唯一N源，利于对细菌的筛源，利于对细菌的筛选。选。思考与练习：思考与练习：有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用？有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用？此类细菌使废弃物降解形成氨后将其利用，此类细菌使废弃物降解形成氨后将其利用，有利于自然界中的氮循环。防止尿素在自有利于自然界中的氮循环。防止尿素在自然情况下高温水解形成氨，并进一步形成然情况下高温水解形成氨，并进一步形成一些化合物，使土壤板结一些化合物，使土壤板结思考与练习：思考与练习：3、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？环带出现？此细菌能分解尿素产生氨，氨为碱性，酚此细菌能分解尿素产生氨，氨为碱性，酚红指示剂在碱性下为红色，标志着存在脲红指示剂在碱性下为红色，标志着存在脲酶水解尿素的作用，红色区域大小代表脲酶水解尿素的作用，红色区域大小代表脲酶活性强弱和含量的多少。酶活性强弱和含量的多少。思考与练习：思考与练习：4、与全营养培养基上的菌落数比较，为什、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落？么尿素培养基上只有少数菌落？答：说明能利用尿素的细菌只占少数。答：说明能利用尿素的细菌只占少数。1 1、土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微、土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌（目的菌）。培养基成分如表所示，实能高效降解尿素的细菌（目的菌）。培养基成分如表所示，实验步骤如图所示。请分析回答：验步骤如图所示。请分析回答：KHKH2 2POPO4 41.4 g1.4 gNaNa2 2HPOHPO4 42.1 g2.1 gMgSOMgSO4 47H7H2 2O O0.2 g0.2 g葡萄糖葡萄糖10 g10 g尿素尿素1 g1 g琼脂琼脂15 g15 g将上述物质溶解后，用蒸馏将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到水定容到100 mL100 mL （1 1）培养基中加入尿素的目的是筛选）培养基中加入尿素的目的是筛选 ，这种培养基属，这种培养基属于于 培养基。培养基。（2 2）“目的菌目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的 和和 ，实验需要振荡培养，原因是，实验需要振荡培养，原因是 目的菌目的菌选择选择尿素尿素 为目的菌提供氧气为目的菌提供氧气 葡萄糖葡萄糖（3 3）图中将细菌转到固体培养基上时，常采用）图中将细菌转到固体培养基上时，常采用 的方的方法接种，获得单菌落后继续筛选。法接种，获得单菌落后继续筛选。（4 4）在进行分离分解尿素的细菌实验时，）在进行分离分解尿素的细菌实验时，A A同学从培养基上筛选同学从培养基上筛选出大约出大约150150个菌落，而其他同学只选择出大约个菌落，而其他同学只选择出大约5050个菌落。个菌落。A A同学的同学的实验结果产生的原因可能有实验结果产生的原因可能有 （填序号）。（填序号）。土样不同土样不同 培养基污染培养基污染 操作失误操作失误 没有设置对照没有设置对照（5 5）实验结束后，使用过的培养基应该进行）实验结束后，使用过的培养基应该进行 处理后，处理后，才能倒掉。才能倒掉。涂布平板（划线）涂布平板（划线）灭菌灭菌