九章节酶免疫技术

第九章第九章 酶免疫技术酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点第一节酶免疫技术的特点一、酶和酶作用底物一、酶和酶作用底物二、酶标记抗体或抗原二、酶标记抗体或抗原三、固相载体三、固相载体第二节酶免疫技术的分类第二节酶免疫技术的分类一、均相酶免疫测定一、均相酶免疫测定二、非均相酶免疫测定二、非均相酶免疫测定第三节酶联免疫吸附试验第三节酶联免疫吸附试验一、基本原理一、基本原理二、方法类型及反应原理二、方法类型及反应原理思考题思考题小结小结放射免疫技术放射免疫技术发光免疫技术发光免疫技术酶免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术三大经典标记技术三大经典标记技术第一节第一节 酶免疫技术的特点酶免疫技术的特点 主要试剂主要试剂:酶标记的抗体或抗原酶标记的抗体或抗原 酶标物特点：酶标物特点：免疫学活性免疫学活性 酶对底物的催化活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性酶高效催化反应的专一性原理及特点原理及特点特点：特点：灵敏度高、特异性强、灵敏度高、特异性强、准确性好准确性好酶标记试剂能够较长时酶标记试剂能够较长时间保持稳定间保持稳定操作简便、对环境没有操作简便、对环境没有污染。污染。易与其它技术偶联易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的衍生出适用范围更广的新方法新方法。原理：原理：酶标抗体（抗原）与抗原酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析定性或定量的测定分析 原理及特点原理及特点标记酶的要求：标记酶的要求：活性高活性高 性质稳定性质稳定 专一性强专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 一、酶和酶作用底物一、酶和酶作用底物辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP）糖蛋白（主酶）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心辅基是酶的活性中心RZRZ值：值：403nm 403nm（辅基）（辅基）与与275nm275nm（主酶）（主酶）ODOD值之比值之比 RZRZ值与酶活性无关，值与酶活性无关，酶活性单位比酶活性单位比RZRZ值值更为重要更为重要 ELISAELISA中应用最为广中应用最为广泛的标记用酶泛的标记用酶 常用酶常用酶酶和酶作用底物酶和酶作用底物碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（APAP）菌源性菌源性AP AP 肠粘膜肠粘膜APAP 半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-Gal-Gal）用于均相酶用于均相酶免疫测定免疫测定 常用酶常用酶酶和酶作用底物酶和酶作用底物HRPHRP的底物的底物 DHDH2 2+H+H2 2O O2 2 D+2H D+2H2 2O O HRPHRP供氢体供氢体DHDH2 2习惯上被称为底物，底物有多种习惯上被称为底物，底物有多种 H H2 2O O2 2为受氢体，为受氢体，HRPHRP对受氢体的专一性很高对受氢体的专一性很高 常用底物常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物HRPHRP的常见底物的常见底物 邻苯二胺邻苯二胺 OPDOPD四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMBTMB5-5-氨基水杨酸氨基水杨酸5-ASA 5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基-二二(3-(3-乙基乙基-苯并噻苯并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 ABTSABTS常用底物常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物OPDOPD反应后显橙黄反应后显橙黄色，加酸终止反色，加酸终止反应后呈棕黄色，应后呈棕黄色，测定波长测定波长492nm492nm。不稳定，致癌性。不稳定，致癌性。TMBTMB反应后显蓝色反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变加酸终止反应后变为黄色为黄色,测定波长测定波长450nm 450nm，稳定，无，稳定，无致癌性，致癌性，ELISAELISA中应中应用最广泛的底物。用最广泛的底物。HRPHRP的常见底物的常见底物 酶和酶作用底物酶和酶作用底物APAP的的底物底物-Gal-Gal的底物的底物 对对-硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯（pNPPpNPP ）4-4-甲基伞酮基甲基伞酮基-D-D半半-乳糖苷乳糖苷（4MUG 4MUG）经经APAP作用后的产物为黄色对作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm405 nm。酶作用后，生成高强度酶作用后，生成高强度荧光物荧光物 ，用荧光计，用荧光计 测测量。量。常用底物常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物酶免疫技术的核心组成部分酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物酶结合物（conjugateconjugate）酶标记物酶标记物 通过化学反应或免通过化学反应或免疫学反应，让酶与疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的抗体或抗原形成的结合物结合物 二、酶标记抗体或抗原二、酶标记抗体或抗原抗原要求纯度高，抗原性完整抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。产，易纯化。制备方法要求制备方法要求酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原制备方法要求制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性技术方法简单、产率高，重复性好好标记反应不影响酶和抗原或抗体标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性的活性酶标记物稳定酶标记物稳定 ，不形成聚合物，不形成聚合物酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原制备方法制备方法过碘酸钠法（直接法）过碘酸钠法（直接法）常用于常用于HRPHRP标记抗体或抗原标记抗体或抗原 戊二醛交戊二醛交联法联法酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原戊二醛交戊二醛交联法联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与与HRPHRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。步法高，酶标记物质量较均一。酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原纯化及鉴定纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度作用而降低特异性染色强度 常用的纯化方法：常用的纯化方法：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-200/G-150G-200/G-150过柱层析纯化过柱层析纯化50%50%饱和硫酸铵沉淀提纯饱和硫酸铵沉淀提纯酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法用方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面到固相载体的表面 三、固相载体三、固相载体要求要求 结合抗体或抗原的容量大结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性不影响免疫反应性 利于反应充分进行利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济固相方法简便易行，快速经济种类种类塑料制品塑料制品 微颗粒微颗粒膜载体膜载体 固相载体固相载体将抗原或抗体结合于固相载体将抗原或抗体结合于固相载体用用1%1%5%5%的牛血清白蛋白或的牛血清白蛋白或5%5%20%20%小牛血小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附特异性吸附包被包被coatingcoating封闭封闭blockingblocking包被与封闭包被与封闭第二节酶免疫技术分类第二节酶免疫技术分类 酶酶免免疫疫技技术术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均均 相相非均相非均相固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位组织切片或其它标本中抗原的定位 液体标本中抗原或液体标本中抗原或抗体的定性和定量抗体的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。的改变，而确定抗原或抗体的含量。原理原理一、均相酶免疫测定一、均相酶免疫测定最具代表性的两种技术最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术EMITEMITenzyme-mutiplied immunoassay technique克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析 CEDIACEDIAcloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫测定均相酶免疫测定EMITEMIT示意图示意图CEDIACEDIA示意图示意图分类：分类：液相酶免疫测定液相酶免疫测定 固相酶免疫测定固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（附试验（ELISAELISA）是目前最为常用的固相酶免是目前最为常用的固相酶免疫测定疫测定与均相不同与均相不同之处之处需分离游离与结合的酶标记物需分离游离与结合的酶标记物二、非均相酶免疫测定二、非均相酶免疫测定第三节酶联免疫吸附试验第三节酶联免疫吸附试验 底物显色底物显色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反应反应加入待测抗体或加入待测抗体或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或抗体洗涤洗涤使结合在固相上使结合在固相上的抗原抗体复合物的抗原抗体复合物与未结合的分离与未结合的分离1234一、基本原理一、基本原理固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物酶标记物（酶结合物）酶反应的底物酶反应的底物 三个必要试剂三个必要试剂 二、方法类型及反应原理二、方法类型及反应原理双抗体夹心法双抗体夹心法方法：方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色标抗体，加底物显色应用：应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCGHCG等等ELISAELISA检测抗原的方法检测抗原的方法双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原+-E EE EE EE EE EE EE EE EE E竞争法竞争法 方法：方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）物、激素等）ELISAELISA检测抗原的方法检测抗原的方法竞争法测抗原竞争法测抗原+-E EE EE EE EE EE EE E2 2、加待检物、加待检物抗原与酶标抗抗原与酶标抗原竞争与抗体原竞争与抗体结合结合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不显色的底物不显色或显色弱或显色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物显色的底物显色1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面2 2、加待测物、加待测物和酶标抗原，和酶标抗原，酶标抗原与抗酶标抗原与抗体结合体结合E E间接法间接法方法方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgGIgG（抗（抗抗体或二抗）加底物显色。抗体或二抗）加底物显色。优点优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用应用 常用于常用于HCVHCV抗体、抗体、HIVHIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法间接法测抗体间接法测抗体-E EE EE EE EE EE EE EE EE E双抗原夹心法双抗原夹心法原理：原理：类似双抗体夹心法类似双抗体夹心法操作步骤操作步骤：类似类似 应用：应用：乙型肝炎表面抗体乙型肝炎表面抗体ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法竞争法竞争法原理：原理：类似检测抗原的竞争法类似检测抗原的竞争法 应用应用：乙型肝炎病毒核心抗体乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb(HBcAb)和和乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒e e抗体抗体(HBeAb(HBeAb)的检测的检测 ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法捕获法捕获法 应用：应用：病原体急性感染诊断中的病原体急性感染诊断中的IgMIgM型抗体型抗体 甲型肝炎甲型肝炎HAV-IgMHAV-IgM抗体抗体 乙型肝炎病毒核心乙型肝炎病毒核心HBc-IgMHBc-IgM抗体抗体ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法捕获法捕获法 原理：原理：抗人抗人IgMIgM链抗体包被链抗体包被捕获待测标本中捕获待测标本中IgMIgM类抗体类抗体加入特异性抗原和酶标记特加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体异性抗原的抗体 底物显色底物显色 捕获法原理捕获法原理+-E EE EE EE EE E 1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待测物、加待测物特异性特异性IgMIgM与与非特异性非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性、加特异性抗原，与特异抗原，与特异性抗体结合性抗体结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体与特异性抗原结与特异性抗原结合，加底物显色合，加底物显色2 2、加待测物、加待测物只有非特异性只有非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性抗、加特异性抗原，不能与非原，不能与非特异性特异性IgMIgM结合结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体无抗原结合，无抗原结合，加底物不显色加底物不显色第第四四节节 酶免疫测定的应用酶免疫测定的应用均相酶免疫测定主要用于药物和小分均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISAELISA应用更为广泛，应用更为广泛，ELISAELISA广泛用于广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、（甲肝抗体、“乙肝三对乙肝三对”、丙肝抗、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。抗原、前列腺特异性抗原等）。1 1酶免疫技术的要点？酶免疫技术的要点？2 2酶联免疫吸附试验的原理（酶联免疫吸附试验的原理（ELISAELISA）？）？3 3竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？4 4常用的底物有哪几类？特点？常用的底物有哪几类？特点？5 5常用的酶有哪几类？特点？常用的酶有哪几类？特点？6 6何谓包被与封闭？其作用？何谓包被与封闭？其作用？7 7常用固相载体的种类和特点？常用固相载体的种类和特点？8 8举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。9 9ELISAELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？的非特异性干扰有哪些，其机制？1010对酶免疫技术的应用评价如何？对酶免疫技术的应用评价如何？思考题思考题 酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定，均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定，非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）,其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。小小 结结