第十一章 原生质体的分离和培养

第十一章原生质体的分离和培养1引言植物原生质体培养和细胞融合是植物细胞工程的核心技术，它是20 世纪60年代初，人们为了克服植物远缘杂交的不亲和性，利用远缘 遗传基因资源改良品种而开发完善起来的一门技术。植物原生质体是 遗传转化的理想受体，能够比较容易地摄取外来遗传物质，如外源 DNA、染色体、病毒、细胞器等，为高等植物在细胞水平或分子水平 上的遗传操作提供了理想的实验体系。原生质体是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力 的原生质团。就单个细胞而言，除了没有细胞壁外，它具有活细胞的 一切特征。1960年英国植物生理学家Cocking首次利用纤维素酶等 从番茄根细胞分离原生质体获得成功。1971年Takebe等培养烟草叶 片原生质体获得再生植株，首次证实了原生质体的全能性。1972年 美国科学家Carl, son等利用细胞融合技术，首次获得两种不同烟草 原生质体融合的体细胞杂种。1974年高国楠等开发出了 PEG（聚乙二 醇）融合方法。1978年德国科学家Melchers等把马铃薯和番茄的原 生质体进行融合，获得了体细胞杂种一一马铃薯番茄。1981年Zimmermann开发出了高压脉冲法，即电融合技术。植物原生质体培养和细胞融合技术已经成熟，并成为品种改良和 创造育种亲本资源的重要途径。迄今已在多种作物上获得了原生质体 植株和种、属间杂种植株，也为细胞生物学、植物生理学及体细胞遗传学的研究做出了重要贡献。第一节植物原生质体分离一、原生质体分离（一）植物细胞膜电特性和膜电位植物细胞膜是一个由脂类和蛋白质等构成的双层分子层膜，其物 理性质类似于一个双电层，细胞的内外层带的是同种电荷。不同植物 的细胞膜电位不同，同种植物细胞倍性不同以及在不同外界离子环境 下，其细胞膜的膜电位也不同（表7-1、表7-2）。了解植物细胞膜的 电特性对细胞融合的研究很有-必要。原核生物遗传饰变过去几十年取得了很大进展，转导和转化现已 成为对微生物进行遗传操作的标准方法。利用微生物进行遗传操作研 究的优点是：这些单细胞和单染色体系统既简单又容易控制；它 们的复制周期很短。在真核生物中将遗传物质由一个个体转移给另一 个个体的传统方法是有性杂交，它所能进行的范围极为有限，尤其在 动物中是这样。就是在植物中，虽然远缘杂交并非不可能，但由于有 性不亲合性的障碍，有时在选定的亲本之间也难以获得完全的杂种 （见第9章和第10章），这是通过杂交进行作物改良的一个严重障碍。 在这点上细胞融合为远缘杂交提供了一个很有潜力的新途径（体细胞 杂交）。无论是在植物中还是在动物中，细胞融合必须穿越质膜才能 完成。植物与动物不同，在质膜之外还有一层坚硬的纤维素壁，相邻 的细胞被一层主要由果胶质构成的基质粘连在一起。主要由于这个原 因，体细胞遗传学在动物中的发展远远超过了在植物中的发展。只是 自1960年以来，由于Cocking证实了通过酶解细胞壁可以获得大量 有活力的裸细胞（原生质体），对高等植物体细胞遗传饰变的真正兴趣才与日俱增。实际上，这一领域的研究甚至是更晚一970.年以后 才活跃起来的。高等植物原生质体除了可用于细胞融合的研究以外，还能通过它 们裸露的质膜摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒。原生质体的 这些特性与植物细胞的全能性结合在一起，已经在遗传工程和体细胞 遗传学中开辟了一个理论和应用研究的崭新领域。通过原生质体系统对植物细胞进行遗传饰变方法的要点是：原 生质体的分离；培养原生质体并使之再生完整植株；细胞融合； 把外源遗传物质、细胞器或微生物导人原生质体。本章讨论原生质 体分离和培养的技术，现将其主要环节示于图11. 1，与体细胞杂交 有关的细胞融合和离体原生质体在其他方面的应用将在第12章中讨 论。图 11. 1原生质体平板培养叶肉原生质体的分离、培养和植株再生（71自Bajaj, 1977) 11. 2原生质体的分离11. 2. 1原生质体分离的方法11. 2. 1. 1机械法由高等植物中分离原生质体的研究最早是Klercker在1892年进 行的。当时他所用的主要是机械法一把细胞置于一种高渗的糖溶液 中，使细胞发生质壁分离，原生质体收缩成球形，然后用利刃切割。 在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出 完整的原生质体。在某些贮藏组织中，如洋葱的鳞片、萝卜的根、黄 瓜的中皮层、甜菜的根组织等，应用这个方法可由它们高度液泡化的 细胞中分离出原生质体。然而，这个方法有明显的缺点：一是产量很 低，二是在由分生细胞和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体 时不适用。11. 2. 1. 2酶解法1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分离原 生质体的可能性。他使用了 一种由疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液以降解细胞壁。然 而，进一步的研究只是到了有商品酶供应之后才成为可能。自从1968 年纤维素酶和离析酶投入市场以后，植物原生质体才变成了一个热门 的研究领域。首先用商品酶进行原生质体分离的是Takebe等(1968)。在他们 分离烟草叶肉原生质体的程序中，上述两种酶是依次使用的，即先用 离析酶处理叶片小块，使之释放出单个细胞，然后再以纤维素酶消化 掉细胞壁，释放出原生质体。Power和Cocking(1968)证实，这两种 酶也可一起使用。这种“同时处理法”或“一步法”比“顺序处理法” 快，并且由于减少了步骤，从而减少了微生物污染的机会。多数研究 者现在都使用这种简化的一步法，这种方法的细节见附录11. 1。现 在市面上有各种酶制品出售(表11. 1).取决于组织性质的不同，它 们可以不同配比搭配使用。表11. 1存厦毕后佐分离审常用的商品醢酶来源生产厂家纤维素酶类Onozuka R10Meicelase PCellulysinDriselase绿色木霉绿色木霉绿色木霉Irpex lutensYakult Honsha Co. Ltd., Tokyo,JapanMeiji Seika Kaisha Ltd., Tokyo,JapanCalbiochem. , San Diego, CA 92037,USAKayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo,Japan果胶酶类MacerozymeR-lOPectinasePectolyase 丫一23根霉黑曲霉日本黑曲霉Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo,Japansigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178, USAseishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo,Japan半纤维素酶类Rhozyme HP-150Hemicellulase黑曲霉黑曲霉Rohm and Haas Co. , Philadelphia,PA 19105, USASigma Chemical Co., St. Louis,M0 63178, USA由于商品酶的出现，现在实际上已有可能由每种植物组织分离出 原生质体，只要该组织的细胞还没有木质化即可。据报道，由以下各 种组织中都已分离出原生质体：叶肉细胞，根组织，豆科植物的根瘤， 茎尖，胚芽鞘，块茎，花瓣，小孢子母细胞，果实组织，糊粉细胞， 下胚轴和培养的细胞等。有活力和适于培养的原生质体的大量分离受到若干因素的影响， 一个实验体系所需的最适条件主要是靠经验确定的。在想用一个新的 实验系统分离原生质体时，可以参考Uchimiya和Murashige(1974) 在烟草培养细胞上所做的工作，和Scott等(1978)在禾谷类植物叶肉 组织上所做的工作(见表11. 2)。表11. 2在两个物种中原生质体分离的最适条件项目烟草的培养细胞禾谷类叶肉细胞植物材料45日龄继代培养物56日龄幼苗纤维素酶1%Onozuka R102%Cellulysin果胶酶(离析酶)O.1%O.2%OnozukaO.5%半纤维素酶RlO1%酶溶液的pH4.6 5.4酶溶液容积/组4.7 或 5.710 m1 / g织鲜重10 ml / g2 h保温时间23 h20 25C最适温度22 37C80 r / min振荡速度渗压剂50 r / min300800 mmol / L甘露醇600 mmo / L山梨醇引自 Uchimiya和Murashige（1974）；引自 Scott 等（1978）。由叶肉细胞分离原生质体的方法见附录11. 1（同时见图11. 2）。图11.2分离叶肉原生质体的技术流程（引自E. C. Cocking）11. 2. 2影响原生质体产量和活力的因子11. 2. 2. 1材料来源植物原生质体最方便和最普遍的来源是叶片，因为由叶片中可以 分离出大量的比较均匀一致的细胞，而又不致使植物遭到致命的破 坏。由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。当由叶片 制备原生质体时，植株的年龄和生长条件十分重要。为了能在最大程 度上控制供体植株的生长条件，一些作者使用了离体培养的植物，对 这些植物的叶片无须进行表面消毒。不过多数作者还是使用温室或生 长室栽种的植物，在这种情况下，一般以生长在下述条件下的植株能 产生较好的结果：低光照强度（1 000以W/cm2。），短日照，温度范 围2025C，相对湿度60%80%，以及充足的氮肥供应。由于从禾本科和其他一些物种的叶肉细胞分离适于培养的原生 质体相当困难，因此在这些植物中一直用培养细胞作为供体材料。培 养细胞的原生质体产量取决于这些细胞的生长速率和生长时期。频繁 继代（每3d 一次）的悬浮培养物以及处于对数生长早期的细胞，是最 适宜的供体材料。11. 2. 2. 2前处理由生长在非无菌条件下的植株上取来的组织，首先必须进行表面 消毒。一般来说，消毒方法与第2章中介绍的用于组织和器官培养的 消毒方法相同。根据Scott等（1978）的实验结果，对禾谷类植物叶片 进行表面消毒时，效果最好效率最高的方法是把它们用苄烷铉 （Zephiran）（O.1%） 一酒精（10%）溶液漂洗5 min。叶片表面消毒的 另一种方法是用60 9/ 670%的酒精漂洗，然后再在超净工作台上 使叶表面的酒精蒸发掉。要保证酶解能充分进行，必须促使酶溶液渗入到叶片的细胞间隙 中去，为达到这个目的可以采用几种不同的方法，其中应用最广泛的 方法是撕去叶片的下表皮，然后以无表皮的一面向下，使叶片飘浮在 酶溶液中。如果叶片的下表皮撕不掉或很难撕掉，则可把叶片或组织 切成小块（约1 mm。），投入到酶溶液中。若与真空渗人相结合后， 后一种方法不但十分方便，而且也非常有效。据Scott等（1978）报道， 若以真空处理35 rain，使酶溶液渗入叶片小块，在2 h内即可把 禾谷类植物的叶肉原生质体分离出来。检查酶溶液是否已充分渗入的 标准，是当真空处理结束后大气压恢复正常时叶片小块能否下沉。代 替撕表皮的另一种有效方法是用金刚砂（246日）摩擦叶的下表面。在酶处理期间进行搅拌或振动可以增加培养细胞的原生质体产 量。11. 2. 2. 3酶处理原生质体分离的情况在很大程度上取决于所用酶的性质和浓度。 分离植物细胞原生质体所必需的两种酶是纤维素酶和果胶酶，后者的 作用主要是降解中胶层，前者是消化细胞壁纤维素。市售的最早真菌 酶制品是Onozuka纤维素酶SS和Onozuka离析酶SS，这两种酶一百 得到了广泛的应用。由于对这类酶的需求与日俱增，现在又有其他很 多公司进行这类酶的生产（见表11. 1）。崩溃酶同时具有纤维素酶、 果胶酶、地衣多糖酶和木聚糖酶等几种酶的孵解活性，对于由培养细 胞中分离原生质体特别有用。即使是纯化的酶，如纤维素酶R10， 看来也含有相当数量的果胶酶。果胶酶Y 一 23是一种效力很高的离 析酶，若与纤维素酶结合使用，可在30 min内由豌豆叶肉细胞中把 原生质体释放出来。对于某些组织来说，除了纤维素酶和离析酶之外可能还需要半纤 维素酶。大麦的糊粉细胞以纤维素酶处理之后并不能把原生质体释放 出来，这是因为在原生质体周围还留下一薄层抗纤维素酶的壁。这类 细胞称作原生质球，只有用Glusulase酶处理才能把它们剩余的壁消 化掉。粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质，它们对原生质体的活 力可能是有害的。因此有些研究者常在使用之前将这些酶纯化，方法 是使它们通过聚丙烯酰胺凝胶或葡聚糖凝胶G25进行过滤洗提。不过在多数情况下，这些酶的粗制形式也能产生令人满意的结果。确实，Arnold和Eriksson(1976)观察到，酶的纯化会导致存活原生质体数 目的减少，相比之下，粗制酶效果更好。酶的活性与pH值有关。按照生产厂家的说明，Onozuka纤维素 酶R-10和离析酶R-10的最适pH值分别为56和45。不过实 际上酶溶液的pH值经常被调节在4.76.O之间。Uchimiya和 Murashige(1974)观察到，用于由烟草的培养细胞分离原生质体的混 合酶溶液有2个最适pH值，一个是4.7，另一个是5.7。对这些酶的活性来说，最适温度是4050、C，而对细胞来说， 这样的温度碰巧是太高了。一般来说，分离原生质体时温度以25 30C为宜。酶的浓度和酶处理的持续时间须经若干次实验后才能决 定。在酶溶液中保温处理的时间可以短至30 min或长至20 h。可能 影响原生质体产量的另一个因子是酶溶液的容积和植物组织数量之 间的相互关系。一般来说，每1 g组织用10 ml酶溶液常可产生令人 满意的结果。酶溶液可以在低温冰箱中贮存数月而不丧失活性。11. 2. 2. 4渗压剂离体原生质体的一个基本属性是它们的渗透破碎性，因而在酶溶 液、原生质体清洗介质和原生质体培养基中必须加入一种适当的渗透 压稳定剂。在具有合适渗透压的溶液中，新分离出来的原生质体看上 去都是球形的(见图11. 3)。根据定量观察，原生质体在轻微高渗溶 液中比在等渗溶液中更为稳定。较高水平的渗透剂可以阻止原生质体 的破裂和出芽，但与此同时也可能会抑制原生质体的分裂。为了凋节用于原生质体分离和培养的各种溶液的渗透压，已经对 很多电解质和非FU解质进行过试验，但应用得圾广泛的渗透压稳定 剂是山梨醇和甘露醇，适宜的浓度范围是450800 mmol / L。Uchimiya和Murashige(1974)注意到，当由烟草悬浮培养物分离原生 质体时，几种可溶性碳水化合物一一包括葡萄糖、果糖、半乳糖、山 梨醇和甘露醇等，都是同样有效的。当把非电解质用做渗透压稳定剂 时，常要在酶溶液中补加上某些盐类一尤其是CaCl2(50100 mmol /L)，以便提高质膜的稳定性。Meyer(1974)以及 Bohnke 和 Kohlenbach(1978)报道，使用电解 渗压剂(335 mmol / L KCl 和 40 mmol / L MgSO 7H20)能够提高原生 质体的活力，产生更为纯净的制品。然而，若以盐类调节培养基的渗 透压则是有害的。11. 2. 3原生质体的净化当材料已在酶溶液中保温足够的时间以后，小心地振动容器或轻 轻地压挤叶块，以使原来组织中的原生质体释放出来。此时容器内经 过酶解后的混合物中除了完整的未受损伤的原生质体之外，还含有亚 细胞碎屑，尤其是叶绿体、维管成分、未被消化的细胞和碎裂的原生 质体，因而必须把这些杂质除掉。清除较大碎屑的方法是使酶解后的 混合物穿过一个镍丝网(5070m)。进一步的净化则须采用以下3 种方法中的一种：11. 2. 3. 1沉降法将镍丝网滤出液置于离心管中，在75100 g下离心23 min 后，原生质体沉于离心管底部，残渣碎屑悬浮于上清液中。弃去上清 液。再把沉淀物重新悬浮于清洗培养基中，在50 g下离心35 min 后再悬浮，如此反复3次。常用的原生质体清洗培养基为CPW盐溶液， 成分为(mg / 1):KH PO2 427.2KIO.16KN03101.OCuS04 5H20O.025CaCl2 2H2O1 480.0pH5.8MgSO4 7H20246.0(Cocking 和Peberdy，1974)。11. 2. 3. 2漂浮法根据原生质体来源的不同，利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶 液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底。具体做法是， 将悬浮在少量酶混合液或清洗培养基中的原生质体沉淀和碎屑置于 离心管内蔗糖溶液(21%)的顶部，在100 g下离心1 0 min。碎屑下 沉到符底后.一个纯净的原生质体带出现在蔗糖溶液和原生质体悬浮 培养基的界面上。用移液管小心地将原生质体吸出，转入到另一个离 心管中。通过反复地离心和重新悬浮之后，如在沉降法中一样，再将 原生质体清洗3次，最后以适当的密度悬浮在培养基中。11. 2. 3. 3界面法这种方法的原理是，采用两种密度不同的溶液，离心后使完整的 原生质体处在两液相的界面。最早使用这种方法净化原生质体的Hughes等(1978)在离心管底部注入的是450 mmol / L蔗糖，在顶部 注入的是450 mmol / L甘露醇。1年后Piwowarczyk(1979)改进了这 种密度梯度法，只通过一次离心即可得到不混有酶和碎屑的完整无损 的原生质体。这种梯度的制备方法是，在离心管中依次加入一层溶于 培养基中的500 mmol / L蔗糖，一层溶于培养基中的140 mmol /L蔗 糖和360 mmol / L山梨醇，最后是一层悬浮在酶溶液中的原生质体， 其中含有 300 mmol / L 山梨醇和 100 mmol / L CaCl2o 经 400 g 5 min 离心之后，刚好在蔗糖层之上会出现一个纯净的原生质体层，而碎屑 则移动到管底。11. 2. 4原生质体活力的测定对于新分离出来的原生质体的活力有几种不同的测定方法：以 胞质环流作为进行活跃代谢的指标，但对在细胞周缘携有大量叶绿体 的叶肉细胞原生质体来说，这种方法的作用不大；以氧的摄人量做 指标，摄人量可通过一个能指示呼吸代谢强度的氧电极进行测定； 以光合活性做指标；以完整的质膜排斥伊凡蓝的能力做指标；以 荧光素双醋酸酯(FDA)的染色能力为指标。上述测定细胞(原生质体) 活力的方法有些已在第6. 3. 5节中做过介绍。11. 3原生质体培养11. 3. 1供体植物的选择现在已愈来愈清楚地认识到，为了能够获得可重复的高植板效 率，供体组织的生理状态和原生质体的质量即使不比培养条件更重 要，其重要性也和培养条件相当。如前所述，如果要使用由完整的植 物器官得到的组织制备原生质体，供体植株应当栽培在光、温和湿度 可控的条件下。由田间植株上取得的叶片常产生难以重复的结果。据 Schenck和Hoffmann(1979)报道，由种在温室或生长箱中的植株制备 的油菜和甘蓝的叶肉原生质体不能进行分裂，而由在无菌条件下生长 的幼苗制备的原生质体则能形成愈伤组织。Shepard等(1980)建议， 用于制备原生质体的马铃薯植株应种在营养、温度、光强和光周期等 可严格控制的条件下，否则无论采用什么培养基原生质体也不能进行 分裂。在若干物种(如甘蓝、甘薯、大豆和陆地棉等中，由新采集的叶 片制备的原生质体不能进行持续的分裂，在这种情况下，若先把叶片 在适当的培养基中预培养37 d，则有可能获得可分裂的原生质体。 11. 3. 2原生质体培养基11. 3. 2. 1 成分在多数情况下原生质体培养所用的为MS，Bs，或它们的衍生培 养基的盐类。据Kao等(1973)报道，在Vicia hajastana和无芒雀麦 的原生质体培养中，若在B。培养基中加入1 mmol / L CaCl2，能提 高分裂细胞百分数。然而，若在该培养基中补加20 mmol / L NH4NO3， 则会降低分裂细胞的频率。在烟草和马铃薯 中，Meyer(1974)和 Upadhya(1975)也分别报道了铉离子对叶肉原生质体的存活率具有类 似的效应。在原生质体培养中所用的维生素与标准组织培养基中的相同。生 长激素，尤其是生长素和细胞分裂素，几乎总是必不可少的。然而对 于禾谷类植物原生质体培养来说，单是2, 4-D或者已经足够，或者 比和细胞分裂素配合使用效果更好。为了诱导细胞能以理想的速率进 行分裂，在培养基中所须加入的生长素和细胞分裂素的种类及之间的 配比因植物材料而不同。在生长素中最常用的是 2，4-D，但据 Uchimiya和Murashige（1976）报道，对于烟草悬浮细胞原生质体培养 来说，NAA效果比2, 4-D或IAA更好。在细胞分裂素中最常用的是 BAP、激动素和2ip。虽然由活跃生长的培养细胞分离的原生质体要 求较高的生长素/细胞分裂素配比才能进行分裂，但是由高度分化的 细胞如叶肉细胞等得到的原生质体，常常需要较高的细胞分裂素/生 长素配比才能进行脱分化。虽然有些时候根据完整细胞和组织对培养条件的要求，可以推测 出适于其原生质体培养的培养基成分，但认为原生质体在培养中的表 现与无壁细胞相当的这样一种简单概念并非总是正确的。例如，当去 掉细胞壁以后，培养的冠瘿瘤细胞就会失去其生长调节物质的自主 性，而在多细胞阶段，这种自主性又得到了恢复。同样，豌豆根尖原 生质体对培养条件的要求与其细胞也有所不同Scott等（1978）发现， 刚分离出来的禾谷类植物原生质体对培养基中的植物激素很敏感，但 由这些原生质体再生的细胞则可转移到含有生长素和细胞分裂素的 培养基中诱导分裂。11. 3. 2. 2渗压剂在还没有再生出一个坚韧的细胞壁之前，原生质体必须有培养基 渗透压的保护。像在酶溶液中一样，培养基中的渗透压一般是以500 600 mmol / L甘露醇或山梨醇调节的。据Scott等（1978）以及Arnold 和Eriksson(1976)报道，对于禾谷类植物和豌豆的叶肉原生质体来 说，蔗糖或葡萄糖不能取代甘露醇或山梨醇用做培养基中的渗透压稳 定剂。然而有些作者则发现，葡萄糖的作用优于其他的渗压剂。Shepard等(1977，1980)在马铃薯、甘薯和木薯原生质体培养中则经 常用蔗糖作为渗透压稳定剂。在雀麦草的原生质体培养中，实验表明 蔗糖的效果比葡萄糖或甘露醇好。在培养基中使用电解质渗压剂会抑 制壁的再生，导致不能进行正常的有丝分裂。培养开始后710 d，大部分有活力的原生质体已经再生出细胞 壁并进行了几次分裂，此后通过定期加入几滴不含渗压剂或渗压剂水 平很低的新鲜培养基，可使培养基的渗透压逐渐下降。若还把渗压剂 保持在原来的高水平上，若干时间以后细胞就会停止分裂。最后将肉 眼可见的细胞团转入到不含渗压剂的新鲜培养基中。11. 3. 3培养条件新分离出来的原生质体应在散射光或黑暗中培养。在某些物种中 原生质体对光非常敏感，最初的47 d应置于完全黑暗中培养。在 显微镜台上以加绿色滤光片的白炽灯光照射5 min后，豌豆根原生质 体的有丝分裂活动就会受到完全的抑制。经过57 d,当完整的细 胞壁形成以后，细胞就具备了耐光的特性，这时才可把培养物转移到 光下。因此，在原生质体对光敏感的情况下，应当尽量少做观察，凡 经观察过的原生质体不应包括在以后的实验结果中。原生质体培养一般是在2530C下进行的。有关在原生质体培养 中温度对壁的再生和以后分裂活动的影响研究得很少。当培养在25C 温度下时，番茄和秘鲁番茄的叶肉原生质体以及陆地棉培养细胞的原 生质体，或是不能分裂，或是分裂的频率很低；但在2729C下， 这些原生质体发生分裂，植板效率很高。据认为，较高的温度不仅能 影响分裂的速率，而且在迄今不能分裂的原生质体系统中，还可能是 启动和维持分裂的一个前提。11. 3. 4培养方法11. 3. 4. 1固体培养琼脂糖包埋原生质体的培养方法和对培养条件的要求常与单细胞培养相似。 故原生质体可按Bergmann的细胞植板法（见第6章）用琼脂平板进行 培养（见图11. 4）。不过近年来发现，用琼脂糖代替琼脂可以提高植 板效率。特别是对于那些在琼脂培养基上不易发生分裂的原生质体， 使用琼脂糖可能会取得比较好的效果。低融点琼脂糖可在30C左右 融化，与原生质体混合不影响原生质体的生活力。使用半固体培养基 的优点是原生质体的位置固定不变，这就为跟踪观察某一个体的发育 过程提供了方便。悬浮于培养基中的原生质体将培养皿倒扣在25C下培养1份原生质体1份培养基加1. 2%悬浮液 块脂（40C）* II .F3并降低渗透压 以产生愈伤组织图11. 4原生质体培养的技术流程（引自E. C. Cocking）11. 3. 4. 2液体培养尽管半固体培养基有上述优点，但很多研究者还是喜欢使用液体 培养基，这是因为，当使用液体培养基的时候：经过几天培养之后， 可用有效的方法把培养基的渗透压降低；如果原生质体群体中的蜕 变组分产生了某些能杀死健康细胞的有毒物质，可以更换培养基；以 及经过几天高密度培养之后，可把细胞密度降低，或可把特别感兴 趣的细胞分离出来。在液体培养基中进行原生质体培养可采用不同的 方式，如：1. 液体浅层培养：将含有一定密度原生质体的液体培养基在培 养皿底部铺成一薄层，厚1 mm左右，用封口膜封口后进行培养。2. 微滴培养：用滴管将原生质体悬浮液分散滴在培养皿底部， 每滴501001，盖好封严后置于潮湿的容器中培养。液体培养方法尽管有上述优点，但在浅层培养情况下原生质体间 容易发生粘连，影响它们的生长发育，在微滴培养情况下则必须注意 防止失水变干。11. 3. 4. 3双层培养在培养皿底部先铺一层琼脂固化培养基，然后在它上面滴加原生 质体悬浮液。这种培养方法的好处是固体培养基中的养分可以不断向 液体培养基中释放，同时培养基亦不易失水变干。11. 3. 5植板密度与在细胞培养中的情况相似，原生质体初始植板密度对植板效率 有显著的影响。原生质体培养的一般密度是每毫升培养基1X104到 1X105原生质体。在这样一种高密度的情况下，由个别原生质体形成 的细胞团常在相当早的培养期就彼此交错地长在一起，倘若该原生质 体群体在遗传上是异质的，其结果就会形成一种嵌合体组织。在体细 胞杂交和诱发突变的研究中，最好是能获得个别细胞的无性系，为此 就需要在低密度(每毫升培养基100500个原生质体)下培养原生质 体或由原生质体产生的细胞。通过这个途径还可追踪个别细胞的发育 过程，因而即使缺少适当的选择系统一一这是目前体细胞杂交中的一 个困难环节一也有可能把杂种细胞团分离出来。11. 3. 6低密度培养的对策11. 3. 6. 1培养基为了培养低密度原生质体，Kao和Michayluk(1975)配制了一种 复杂的培养基，即KM8p培养基(见表11. 3)，在其中Viciahajastana 的单个细胞能再生出壁，进行持续的分裂并形成愈伤组织。在这种培 养基中，苜蓿、豌豆和Vicia的叶肉原生质体在较低的群体密度(少 于100个原生质体/ m1)下比在较高的密度下分裂得快。用KM8p培养 基培养马铃薯原生质体以及马铃薯+番茄原生质体融合产物也获得了 成功。在应用KM8p培养基的时候，应将培养材料置于黑暗或近于黑 暗(50 lx)的条件下，因为在强光下这种培养基对植物有毒。11. 3. 6. 2培养方法1.饲养细胞层法：这是Raveh等(1973)建立的一种在低密度下 培养原生质体的方法。在一般情况下，当植板密度低于lO4原生质体 /ml时，烟草原生质体不能分裂，但通过饲养细胞层法，这些细胞 可在低至10100原生质体/ml的密度下进行培养。饲养细胞层的 制备方法是，先以剂量为5X103R的X-射线照射原生质体(106细胞/ ml),这一剂量能抑制细胞分裂，但并不破坏细胞的代谢活性。照射 后将原生质体清洗23次(洗净由照射所产生的有毒物质是重要的 一环)，植板在软琼脂培养基上。这时将琼脂培养基中未经照射过的 原生质体铺在饲养细胞层上。饲养层细胞的最适密度与在一般原生质 体培养中的最适植板密度(2. 4X104 / ml)相同。饲养层也可由悬浮培 养的细胞制备。虽然已知在不同物种的原生质体之间可以发生互馈现 象，但是对于烟草和柑橘原生质体来说，以本物种原生质体制备的饲 养层比用异物种细胞制备的饲养层更为有效。2.共培养法：两个不同物种原生质体共培养的方法也可用于某 些物种的原生质体或杂种细胞的培养。具体做法是把两种类型的活跃 代谢和正在分裂的原生质体混合在液体培养基中，一起进行培养。这 种方法只适用于以下情况，即在这两种类型的原生质体之间能发生有 效的互馈，同时由这两种类型细胞所产生的愈伤组织在形态上能够彼 此区分。例如Menczel等(1978)曾把用机械方法分离出来的烟草属两 个物种种间融合杂种细胞转移到林生烟草一个白化品系的原生质体 培养物上，由于杂种细胞是绿色的，因而能与白化类型的非绿色细胞 团清楚地区分开来。3. Cuprak微滴法：高国楠(1977)及Gleba(1978)等曾使用一种 构造特别的“ Cuprak 培养皿，培养单个原生质体及由这些原生质体 再生的细胞。这种培养皿有两室：小的外室和大的内室。内室中有很 多编码的小穴，每个小穴能装0.2525p l培养基。把原生质体悬浮 液的微滴加入到小穴中，在外室内注入无菌蒸馏水以保持培养皿内的 湿度。把培养皿盖上盖子以后，用封口膜封严。通过这个方法， Gleba(1978)由单个地培养在0.250.5p l小滴的原生质体获得了 完整的烟草植株。对于单个原生质体的分裂来说，微滴的大小是关键 因素。每O.25O.5p l的小滴内含有一个原生质体，在细胞数对培 养基容积的比率上相当于细胞密度为24X103细胞/ml。增加微滴 的大小将会降低有效植板密度。据Gleba(1978)报道，在大于2p l 的微滴中，单个细胞不能分裂。在粉蓝烟草+大豆和拟南芥+油菜杂种 细胞培养中，应用微滴法已取得了成功。11. 3. 7细胞壁的形成开始培养后24 d之内，原生质体将失去它们所特有的球形外 观，这种变化被视为再生新壁的象征。证明细胞壁再生的更可靠和更 直接的方法是以卡氏白(Calcafluor white)染色或利用各种电镜技 术。在使用前一种方法时，将原生质体置于浓度为O.01%或0.1%并 含有适当渗透压稳定剂的卡氏白溶液中保温5 min。经过清洗除去多 余染料后，再把原生质体置于载玻片上渗透压适当的溶液中。卡氏白 能与细胞壁物质结合，当使用配有激发滤片BGl2和吸收滤片K510的 水银蒸气灯观察时，能发出荧光。据认为，一旦把酶洗掉，原生质体 立即开始合成新肇。一般说来，和已分化的叶肉细胞原生质体相比， 在活跃生长的悬浮培养细胞的原生质体中微纤丝的沉积快得多。例 如，蚕豆培养细胞的原生质体在培养后1020 min即能开始壁的合 成，而叶肉原生质体经824h培养后在其周围才能见到细胞壁物质， 大约72 h后才能形成完整的壁。在有些情况下原生质体保持无壁状 态可长达1周以上，甚至数月之久。燕麦胚芽鞘和蔷薇培养细胞的原 生质体则只能轻度地再生细胞壁。新形成的细胞壁是由排列松散的微纤丝组成的，由这些微纤丝后 来组成了典型的细胞壁。迄今所能得到的证据表明，微纤丝的合成是 发生在质膜的表面。然而，对于特定的细胞器是否与微纤丝的合成有 关还没有取得一致的看法，Robenek和Peveling(1977)以日本茵芋 (Skimmia如ponica)原生质体所做的研究，指出了内质网与壁物质的 合成有关，并排除了高尔基体参与的可能性。Horine和Ruesink(1972)报道，旋花科植物原生质体只有在外源 供应一种易于代谢的碳源(如蔗糖)时，细胞壁才能再生，否则细胞壁 就不能形成。培养基中若存在电解质渗透压稳定剂会抑制壁的发育。 对于胡萝卜细胞悬浮培养物的原生质体来说，若在培养基中加入聚乙 二醇1 500，细胞壁的发育就既快又比较均匀。壁的形成与细胞分裂有直接关系，凡是不能再生细胞壁的原生质 体也就不能进行正常的有丝分裂。细胞壁发育不全的原生质体常会出 芽，或体积增大，相当于原来体积的若干倍。此外，由于在核分裂的 同时不伴随发生细胞分裂，这些原生质体可能变成多核原生质体。所 以会出现这些异常现象，除了其他原因之外，原生质体在培养之前清 洗不彻底可能是一个重要原因。11. 3. 8细胞分裂和愈伤组织的形成虽然细胞壁的存在是进行规则有丝分裂的前提，但并非所有的原 生质体再生细胞都能进行分裂。因此，原生质体植板效率可以有很大 变化：低至0.1%，高达80%。凡能分裂的原生质体，可在27 d之内进行第一次分裂。在少 有的情况下，第一次分裂之前的滞后期可持续长达725d之久。与 已经高度分化的叶肉细胞原生质体相比，活跃分裂的悬浮培养细胞的 原生质体进入第一次有丝分裂的时间照例要早。凡能继续分裂的细 胞，经23周培养后可长出细胞团。再经过2周之后，愈伤组织已 明显可见，这时可把它们转移到不含渗压剂的培养基中，依一般的组 织培养方法处理。11. 3. 9植株再生只有由经过饰变的细胞能获得完整的植株时，才有可能通过对离 体原生质体的遗传饰变进行作物改良。已经证明细胞的全能性是一个 显性性状。因此，在一项体细胞杂交研究中，至少应有一个亲本的原 生质体能表现全能性。能够影响愈伤组织培养物进行植株分化的因素 已在第4，5两章讨论过。有关离体原生质体再生植株的第一篇报道发表于1971年，作者 为Takebe等，材料为烟草。此后表现出这种潜力的物种名单不断增 加。尤其引人注目的是，1980年，一个禾本科物种珍珠粟和2个豆 科牧草物种苜蓿和白车轴草由原生质体形成了完整的植株。在20世 纪整个80年代，这一名单中新增加的其他重要栽培植物除如前所述 的各种禾本科作物外，还有棉花、大豆、木薯、番茄、黄瓜、新疆甜 瓜、草莓、杨树、中华猕猴桃、川芎和当归等，连同70年代的报道 加在一起，到1997年止，已由原生质体再生植株的植物已有分属于 46科160多属的360多种（许智宏，1997）。在过去几十年间，高等植物原生质体培养已经取得了重大成绩， 但就若干重要的农作物来说，到目前为止成功还仅限于少数基因型， 并且一般而言再生植株的频率也不高。因此尚须不断改进培养基和培 养方法，力争克服基因型的局限性并提高植株再生的频率。此外，日 前所用的原生质体分离和培养的程序还比较复杂，重复性也不高，所 知道的一些有关培养的规律多数只是经验的总结。从这个角度考虑， 今后的工作应更注意研究基本规律，并使培养技术系统化、程序化、 更简单实用。11. 3. 10禾谷类植物原生质体培养与公认的模式植物如烟草、矮牵牛、曼陀罗、胡萝卜以及十字花 科的芸苔属植物相比，禾谷类植物原生质体培养曾一度停滞不前，但 是，由于禾谷类植物是粮食和饲料的主要来源，世界各国在禾谷类植 物原生质体培养上都投入了大量的人力和物力。通过众多实验室坚持 不懈的努力，禾谷类植物原生质体培养在20世纪80年代终于取得了 一连串突破，几种主要禾本科农作物水稻、玉米、小麦、高粱和 大麦等的原生质体培养在1985年以后相继告捷。回顾禾谷类植物原 生质体培养的整个发展过程，可将其大致分为三个主要发展阶段：第一阶段为1980年以前，是摸索和尝试阶段。在此阶段中，多 数研究者仿效茄科植物叶肉原生质体培养方法，希望能从禾谷类植物 叶片或根、茎等组织分离原生质体并培养成植株。然而，尽管使用了 各种不同的培养基和培养方法，获得再生植株的努力都没有成功， Deka等(1976)从水稻叶鞘分离的原生质体，Potrykus等(1977)从玉 米茎分离的原生质体，培养后都只产生了愈伤组织。此后很多研究者 转而利用培养的组织或细胞作为分离禾谷类植物原生质体的材料，逐 渐有了一些成功的报道，研究进入了第二阶段。由第一阶段向第二阶段的转折是在1980年，这一年，Vasil等 从珍珠粟原生质体培养获得了再生小植株。这是禾谷类植物原生质体 培养的首次成功报道。他们所采用的分离原生质体的材料是从珍珠粟 幼胚愈伤组织建立的胚性细胞悬浮培养物。所谓胚性细胞悬浮培养 物，是指在一定条件下具有体细胞胚胎发生能力的细胞悬浮培养物。 这类悬浮培养物多半是由幼穗、幼胚、成熟胚和花药等诱导的愈伤组 织经液体振荡培养后建立起来的，而禾谷类植物的根、茎、叶等组织 由于在培养中通常不表现形态发生潜力，因此在多数情况下由它们的 愈伤组织很难建立起胚性细胞悬浮培养物。采用与珍珠粟原生质体培 养或多或少相似的方法，后来又从羊草的幼胚、紫狼尾草的花序、水 稻的盾片和花药、小麦及玉米的幼胚等诱导的愈伤组织建立了胚性细 胞悬浮培养物。以此作为材料分离原生质体进行培养，已先后在几种 禾谷类作物原生质体培养中获得了再生植株。基于以上事实，在第二 阶段研究中人们普遍认为，利用胚性细胞悬浮系分离原生质体进行培 养，是禾谷类作物原生质体培养获得成功的一条主要途径。但是，这 种方法在应用中仍存在一些问题，主要表现为在一个物种内成功只局 限于少数基因型，而且即使是能获得成功的基因型，植株分化频率也 不高。因此，为了建立良好的胚性细胞悬浮系，不得不对基因型和愈 伤组织进行大量的筛选工作。为了改变这种局面，探讨更有效地建立 胚性细胞悬浮系的途径，近几年来又做了不少工作，取得了一些新的 进展，使这一领域的研究进入了第三阶段。第三阶段的重点是进一步扩大已获得再生植株的基因型的再生 频率，并力争使更多的基因型培养成功，为此对培养方法又做了若干 改进，其中以王海波等(1989)的工作最具代表性，克服了前一阶段较 多地注意原生质体游离前细胞状态的选择和对游离条件的优化，而很 少把对组织和细胞状态的调控与原生质体培养结合起来的片面性。经过将近20年的不懈努力，到1990年，在几乎所有重要的禾本 科农作物中都已由原生质体获得了再生植株(表11. 4)。然而，要使 这项技术真正达到实用水平，仍须做出很大努力。