体外受精操作流程 复杂

哺乳动物体外受精的基本操作程序，主要环节包括以下几个方面(一) 卵母细胞的采集和成熟培养1 .卵母细胞的采集：卵母细胞的采集方法通常有三种。(1) 超数排卵：雌性动物用促卵泡素和促黄体素处理后，从输卵管中冲取成熟卵子可直接与 获能精子受精。在大家畜中，由于操作程序复杂，成本较高，很少使用。这种方法的关键是 掌握卵子进入输卵管和卵子在输卵管中维持受精能力的时间一般要求在卵子具有旺盛受精 力之前冲取。(2) 从活体卵巢中采集卵母细胞：这种方法是借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活 体动物的卵巢中吸取卵母细胞。在家畜中，牛和马等大家畜常用超声波探测仪辅助取卵，其方法是用手从直肠把握卵巢， 经阴道壁穿刺插入吸卵针，借助B型超声波图像引导，吸取大卵泡中的卵母细胞。按照目 前的技术水平，一头健康母牛每周可获得510枚卵子。在家畜中，活体采集的卵母细胞一 般要经成熟培养后才能与精子受精。这种方法对扩繁优良母畜具有重大意义，在有些国家已 用于商业化生产。(3) 从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞：这种方法是从刚屠宰母畜体内摘出卵巢，经洗涤、 保温(30OC37OC)后，快速运到实验室，在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一 定直径卵泡中的卵母细胞(牛卵泡直径要求3-10mm )也可对卵巢进行切片，收集卵母细 胞。用此方法获得的卵母细胞多数处于生发泡期(GV期)，需要在体外培养成熟后才能与精 子受精。从废弃卵巢中采集卵母细胞的关键是注意卵巢的保温和防止细菌污染。因此卵巢从 畜体摘取后须放入含有生理盐水或磷酸缓冲液(PBS )的保温瓶中；吸卵前卵巢要用生理盐 水或PBS多次洗涤；所用溶液都要添加抗生素。这种方法的最大优点是材料来源丰富，成本低廉，但确定母畜的系谱困难。2 .母细胞的选择:采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘卵母细胞复合体（cumulusoocytecomplesxCOC 无论采用何种方法，采集的COC都要求卵母细胞形态规则，细 胞质均匀，外围有多层卵丘细胞紧密包围。在家畜体外受精研究中，常把未成熟卵母细胞分 为A、B、C和D四个等级。A级卵母细胞要求有三层以上卵丘细胞紧密包围，细胞质均匀； B级要求卵母细胞质均匀，卵丘细胞层低于三层或部分包围卵母细胞；C级为没有卵丘细胞 包围的裸露卵母细胞；D级是死亡或退化的卵母细胞。在体外受精实践中，一般只培养A 级和B级卵母细胞。3.卵母细胞的成熟培养：由超数排卵采集的卵母细胞已在体内发育成熟，不需培养可直接 与精子受精，对未成熟卵母细胞需要在体外培养成熟。培养时，先将采集的卵母细胞在实体 显微镜经过挑选和洗涤后，然后放入成熟培养液中培养。家畜卵母细胞的成熟培养液目前普 遍采用TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。通常采用微滴培养法， 微滴体积为50-200微升，每滴中放入的卵母细胞数按每5微升一个计算单位。卵母细胞移 入小滴后，放入二氧化碳培养箱中培养，培养条件为39。仁100%湿度和5%二氧化碳的空 气。牛的培养时间为20-24小时，卵丘卵母细胞复合体经成熟培养后，卵丘细胞层扩散靠 近卵母细胞周围的卵丘细胞呈放射状排列，出现放射冠，用DNA特意性染料染色后，在显 微镜下进行核相观察，可见卵母细胞处于第2次成熟分裂中期。（二）体外受精1 .精子的获能处理：哺乳动物精子的获能方法有培养和化学诱导两种方法。牛、羊的精子 常用化学药物诱导获能，诱导获能的药物常用肝素和钙离子载体。2.受精：即获能精子与成熟卵子的共培养，除钙离子载体诱导获能外，精子和卵子一般在 获能液中完成受精过程。受精培养时间与获能方法有关。在B2液中一般为6-8小时而用 TALP或S.F液作受精液时可培养1824h。精子和卵子常在小滴中共培养，受精时精子密 度为19x106/ml，每10微升精液中放人12枚卵子，小滴体积一般为50200微升。（三）胚胎培养精子和卵子受精后受精卵需移入发育培养液中继续培养以检查受精状况和受精卵的发育潜 力，质量较好的胚胎可移入受体母畜的生殖道内继续发育成熟或进行冷冻保存。提高受精卵发育率的关键因素是选择理想的培养体系。在家畜中，胚胎培养液分为复杂的和 化学成分明确的培养液两大类。复杂培养液中的成分很多，除无机和有机盐外，还添加维生 素、氨基酸、核苷酸和嘌吟等营养成分和血清，最常用的有TCM199、B2和F10。用它们 培养胚胎时，可以采用体细胞共培养体系，即体细胞与胚胎在微滴中共同培养，利用体细胞 生长过程中分泌的有益因子，促进胚胎发育，克服发育阻断。受精卵的培养广泛采用微滴法，胚胎与培养液的比例为一枚胚胎用310微升培养液；一般 510枚胚胎放在一个小滴中培养以利用胚胎在生长过程中分泌的活性因子，相互促进发育。 胚胎培养条件与卵母细胞成熟培养条件相同。有的实验室采用88% N2、7% O2和5%二 氧化碳混合气体培养，以降低培养液中氧自由基浓度，提高胚胎发育率。胚胎在培养过程中 要求每48-72小时更换一次培养液，同时观察胚胎的发育状况。当胚胎发育到一定阶段时 可进行胚胎移植或冷冻保存，牛、羊受精卵通常培养到致密桑椹胚或囊胚时进行移植或冷冻 保存。