蛋白质组学与分析技术第三讲

1蛋白质组学与分析技术 邱德文中国农科院植物保护研究所2010。3。242蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤、透析和超过滤w利用蛋白质分子不能透过半透膜将其利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开与小分子物质分开w半透膜为玻璃纸或纤维素材料半透膜为玻璃纸或纤维素材料3利用溶解度差别的纯化方法 1.1.等电点沉淀等电点沉淀 调整溶液调整溶液pH 不同蛋白在各自不同蛋白在各自 pI处依次沉淀处依次沉淀 2.2.盐溶和盐析盐溶和盐析3.3.有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法w降低介电常数降低介电常数w争夺水化膜争夺水化膜4蛋白沉淀步骤蛋白沉淀步骤 硫酸铵沉淀（盐析）：高盐溶液中蛋白质聚合而沉淀 TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）：TCA 10%-20%，蛋白质可冰上沉淀，用丙酮和乙酸清洗沉淀。去除TCA 丙酮沉淀：3倍体积的冰丙酮，蛋白在-20度沉淀，离心沉淀蛋白，丙酮通过空气或冻干去除 在丙酮中用TCA三氯醋酸沉淀：两者联合使用更有效，10%的TCA在丙酮中重悬裂解样品溶液 用苯酚提取，随后在甲醇中醋酸铵沉淀：蛋白质被提取到饱和酚中，在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白，丙酮清洗5聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 通过丙烯酰胺单体和N，N，-甲叉双丙烯酰胺按一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合形成交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自由功能基团反应，发生交联，形成网状结构 等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，SDS-PAGE按相对分子质量大小分离蛋白质6聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 通过丙烯酰胺单体和N，N，-甲叉双丙烯酰胺按一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合形成交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自由功能基团反应，发生交联，形成网状结构 等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，SDS-PAGE按相对分子质量大小分离蛋白质78等电聚焦电泳等电聚焦电泳9双向电泳双向电泳10胶上蛋白的检测胶上蛋白的检测 蛋白质检测常用考马斯亮蓝染色 银染 负染 荧光标记、同位素标记，提高灵敏度和自动化水平11层析分离纯化技术层析分离纯化技术12蛋白质层析分离纯化技术蛋白质层析分离纯化技术蛋白质薄层层析（硅胶板蛋白质薄层层析（硅胶板+层析缸）层析缸）蛋白质柱层析（葡聚糖、硅胶填料）蛋白质柱层析（葡聚糖、硅胶填料）蛋白质分析制备仪蛋白质分析制备仪131415161718192021层析分离技术层析分离技术(chromatography)层析是广泛使用的分离蛋白质的方法，它是根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等是目前最常用的层析方法。22凝胶过滤层析凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。三种不同的蛋白质根据它们大小的不同在层析柱中被分离。23亲和层析亲和层析(affinity chromatography)在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。琼脂糖珠的表面吸附剂(如胰岛素配体)只能同特异的受体结合(胰岛素)24离子交换层析离子交换层析(ion-exchange chromatography)离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法.通过DEAE-纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开。图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白。25柱层析分离柱层析分离 常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。柱子可以分为：加压，常压，减压。压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所 以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长.减压柱能够减少硅胶的使用量，但是由于大量的空气通过 硅胶会使溶剂挥发，以前曾经大量的过 减压柱，但是自从尝试了加压后，就很少使用减压柱色谱了。26蛋白质分析制备仪27选择纯化设备选择纯化设备纯化需要纯化需要MicroSpinSyringe+KTA 系统系统+PurificationHiTrap HiTrap Modulescolumnscolumns快速，高处理量筛选(GST or(His)6 融合蛋白)非常快速，一步纯化 (适合大部分融合蛋白)一步纯化 (适合大部分融合蛋白)优化以提高纯度 常规实验，重复性好 纯化后蛋白复性 28HiTrap Chelating准备柱子 用 H2O 洗加 NiSO4 再用 H2O 洗加样用平衡缓冲液冲洗柱子废液收集用洗脱缓冲液洗脱融合蛋白收集组份3 min5-15 min2 min用平衡缓冲液平衡柱子废液3 min29高效纯化策略高效纯化策略载量载量速度速度分辩率分辩率回收率回收率30准备工作准备工作 考虑考虑:纯度水平纯度水平 需要量需要量 保持生物活性保持生物活性 有效和经济有效和经济 蛋白质特性蛋白质特性:稳定性稳定性-pH-离子强度离子强度-温度温度 分子量分子量 等电点等电点31pH 的重要性的重要性:蛋白质净电荷随蛋白质净电荷随 pH 改变改变滴定曲线蛋白质净电荷蛋白质净电荷 1210稳定性范围用阳离子交换用阳离子交换用阴离子交换用阴离子交换3pH不同 pH 下的分离情况21+-32pH 的重要性的重要性:蛋白质净电荷随蛋白质净电荷随 pH 改变改变流动相的流动相的 pH 选择性选择性VVV阳离子阴离子pH0+-VVVVVAbsAbsAbsAbs表面净电荷Abs Abs Abs Abs33样品准备样品准备考虑考虑:根据蛋白质来源选择不同萃取方法根据蛋白质来源选择不同萃取方法 使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶 在室温以下快速处理在室温以下快速处理 用缓冲液维持用缓冲液维持 pH,离子强度离子强度目的目的:稳定样品稳定样品34三步纯化策略三步纯化策略Step 纯度粗提粗提 中度纯化中度纯化 精细纯化精细纯化 样品准备样品准备,萃取萃取,净化净化 达到最高纯度达到最高纯度去除大部分杂质去除大部分杂质 分离分离,浓缩浓缩和稳定样品和稳定样品35三步纯化策略三步纯化策略步骤步骤层析填料的层析填料的颗粒大小颗粒大小36三步纯化策略三步纯化策略步骤步骤流速流速37三步纯化策略三步纯化策略步骤步骤分辩率分辩率38粗提粗提目的目的 纯化粗样纯化粗样 快速浓缩快速浓缩(减少体积减少体积)和稳定样品和稳定样品(去除蛋白去除蛋白酶酶)最适用层析技术最适用层析技术:离子交换离子交换/疏水层析疏水层析分辩率快速快速回收率载量载量39粗提粗提:离子交换填料离子交换填料预装柱预装柱 20ml颗粒大小颗粒大小流速流速HiPrep 16/10 Q XL&SP XL 90 m 10 ml/minHiPrep 16/10 DEAE&CM 90 m 10 ml/minSepharose Big BeadsSTREAMLINESepharose Fast Flow40粗提粗提:疏水层析填料疏水层析填料 高载量高载量 高流速高流速HiPrep 16/10 Phenyl(高&低取代)HiPrep 16/10 ButylHiPrep 16/10 OctylHiTrapHIC 选择试剂盒放大41中度纯化中度纯化目的目的 去除大部分杂质去除大部分杂质最适用层析技术最适用层析技术:离子交换离子交换/疏水层析疏水层析HiLoad离子交换和疏水层析预装柱分辩率分辩率快速回收率载量载量42中度纯化中度纯化:离子交换填料离子交换填料Sepharose HP 34 mQ&SP150 cm/hr小包装和预装柱小包装和预装柱 交联琼脂醣交联琼脂醣SOURCE 30 mSepharose High PerformanceSOURCE 30 Q&S 25 mg 上样载量上样载量3 m:Mini Q&SMini Beads Q&S 2 mg上样载量上样载量48精细纯化精细纯化:离子交换和疏水层析填料离子交换和疏水层析填料RESOURCE15 mQ,S,Phenyl,Ether,Isopropyl1 ml 预装柱流速高达预装柱流速高达10 ml/min RESOURCE HIC Test Kit49精细纯化精细纯化:反相层析填料反相层析填料SephasilRPC硅胶硅胶3 mC2/C18聚苯乙烯聚苯乙烯/二乙烯基苯二乙烯基苯120:肽类肽类C4,C8,C185 and 12 m硅胶硅胶100:肽类肽类300 :蛋白质蛋白质pH 1-12(14)肽类肽类5,15 and 30 m50Source30 m15 m5 m离子交换/疏水层析/反相层析反相层析离子交换/反相层析51适用於三步纯化策略的层析技术适用於三步纯化策略的层析技术蛋白质性质蛋白质性质层析技术层析技术净电荷离子交换(IEX)大小凝胶过滤(GF)疏水性疏水层析(HIC),反相层析(RPC)生物辩识(配基特异性)亲和层析(AC)配基特异性，净电荷,扩张柱床吸附技术(EBA)疏水性有AC,IEX or HIC52适用於三步纯化策略的层析技术适用於三步纯化策略的层析技术层析技术层析技术主要特色主要特色粗提粗提中度纯化中度纯化精细纯化精细纯化IEX高分辨率高载量快速HIC分辨率好载量一般快速AC高分辨率高载量快速GF高分辨率RPC高分辨率53适用於三步纯化策略的层析技术适用於三步纯化策略的层析技术层析技术层析技术样品起始状态样品起始状态样品结束状态样品结束状态IEX低离子强度高离子强度或 pH 改变样品体积不受限制样品被浓缩样品被浓缩HIC高离子强度低离子强度样品被浓缩样品被浓缩AC特异性结合特异性洗脱条件样品体积不受限制样品被浓缩样品被浓缩GF样品体积受限制交换缓冲液(2 M(NH4)2SO4容易氧化65DAOCS-一般准则一般准则 在所有缓冲液中加在所有缓冲液中加 DTT 使所有半胱氨酸使所有半胱氨酸残基保持还原状态残基保持还原状态 加入蛋白酶抑制剂以保持生物活性加入蛋白酶抑制剂以保持生物活性 用用 SDS PAGE 检查每一个组份中检查每一个组份中 DAOCS 利用酶测定法测量生物活性利用酶测定法测量生物活性66准备样品准备样品悬浮细菌细胞在溶解缓冲液中悬浮细菌细胞在溶解缓冲液中超声震荡破碎细胞超声震荡破碎细胞DNA 沉淀沉淀利用离心沉淀利用离心沉淀来源:从 S.Clavuligerus 克隆得到的DAOCS 基因 和在大肠杆菌的胞浆中扩增67选择粗提的层析技术选择粗提的层析技术 阴离子交换阴离子交换:快速快速,浓缩浓缩 样品处理最简单样品处理最简单 分离基础分离基础:电荷电荷 因为因为 DACOS 的的酸性酸性 pI 和不稳定性，和不稳定性，所以缓冲液选择中性所以缓冲液选择中性 pH68粗提粗提-在在 KTAFPLC 上优化梯度上优化梯度线性梯度线性梯度步级梯度步级梯度优化梯度优化梯度层析柱层析柱:HiPrep 16/10 Q XL系统系统:KTAFPLC0102030min01002003001002003004000020406080mAUmlmS/cm01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01020min01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01020min69选择中度纯化技术选择中度纯化技术 HIC:分离基础分离基础:疏水性疏水性 蛋白质疏水性质很难预测蛋白质疏水性质很难预测:筛选适合填料筛选适合填料 HIC 可以跟可以跟 IEX 互补衔接互补衔接,减少样品处理步骤减少样品处理步骤(只只需要加盐需要加盐)DAOCS 在高盐下能保持稳定在高盐下能保持稳定70选择精细纯化的层析技术选择精细纯化的层析技术 GF:分离基础分离基础:分子量差异分子量差异 GF:最适合分离双体，寡聚体和聚合最适合分离双体，寡聚体和聚合物物71DAOCS-优化好的粗提步骤优化好的粗提步骤层析柱层析柱:HiPrep 16/10 Q XL系统系统:KTAFPLC浓缩样品浓缩样品快速去除有害物质快速去除有害物质01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm72DAOCS-优化好的中度纯化步骤优化好的中度纯化步骤层析柱层析柱:SOURCE 15ISO内径内径 16 mm,长度长度 50 mm系统系统:KTAFPLC HIC 和和 IEX 互补互补 浓缩样品浓缩样品 除去大部分杂质除去大部分杂质01002001002003004000mlA280 nm73DAOCS-优化好的精细纯化步骤优化好的精细纯化步骤层析柱层析柱:HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade系统系统:KTAFPLC去除聚合物和余下的去除聚合物和余下的少量污染物少量污染物交换缓冲液交换缓冲液08060402010020040060080010000mlmAU74DAOCS-用用 SDS-PAGE 分析分析4321MMM-LMW 低分子量标记1-样品2-组份-Q Sepharose XL3-组份-SOURCE 15ISO4-组份-Superdex 75 pg67k43k30k75DAOCS 纯化纯化-结果结果粗提粗提中度纯化中度纯化精细纯化精细纯化08060402010020040060080010000mlmAU01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01002001002003004000mlmAu76DAOCS 纯化纯化-结果结果DAOCS 的高分辨电子密度图谱结晶 DAOCS 的 X-射线绕射图感谢瑞典农业科技大学的 Prof.Inger Andersson 和 Dr.Anke Terwisscha van Scheltinga,以及瑞典 Uppsala 大学生化系的 Dr.Karin Valegrd 提供以上图片77中度纯化中度纯化DAOCS 纯化纯化-总结总结工艺工艺优化优化快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting)快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting)优化好的纯化流程优化好的纯化流程样品准备样品准备HiPrep 16/10 Q XLSOURCE 15ISOHiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade 粗提粗提精细纯化精细纯化浓缩浓缩60 分钟分钟30分钟分钟40分钟分钟120分钟分钟80分钟分钟时间时间浓缩浓缩78KTA 平台层析系统纯化平台层析系统纯化 DAOCS-结论结论 DAOCS 纯度足够进行结晶纯度足够进行结晶 使用使用 KTA 平台层析系统的模板和快速探索平台层析系统的模板和快速探索(scouting)功能可以快捷有效地优化纯化工艺功能可以快捷有效地优化纯化工艺 纯化时间从纯化时间从 3 天减少到天减少到 6 小时小时79