沙门氏菌实验13.37

华南农业大学答辩委员会主席 XXX 评阅人 XXX 摘要沙门氏菌是一大群寄生于人类和动物肠道，其生化反应和抗原结构相似的革兰氏阴 性菌。其种类繁多，少数能使人致病，其他可使动物致病，偶尔可传染给人。沙门氏菌 病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一 , 其病原沙门氏菌属肠道细菌科，主 要引起人类伤寒、副伤寒以及食品中毒或败血病。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌 食品中毒常占首位或者第二位。据称在所有肉用动物中, 家禽显然对沙门氏菌最易感受。 沙门氏菌易于在雏鸡肠道内定居与增殖，鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌是引起鸡常 见多发性传染病的细菌，严重影响雏鸡成活率，造成成年鸡产蛋等生产性能的下降 2。 所以在实脸上和生产实践上必须及时进行家禽肠道传染病的预防及控制。自19世纪后期， 沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原以来，检测方法学都是建立在采取感染病人的粪 便或血液作为临床病料的基础上。随着DNA和抗体技术的发展，近20年间出现了很多改 进的方法，其中许多方法可以在48 h内检出沙门氏菌。根据GB/T4789.4-2008,食品中 沙门氏菌传统的检测方法有 5个基本步骤：前增菌、选择性增菌、选择性平板分离、生 化试验、血清学分型鉴定。目前检测食品中的沙门氏菌是按统计学取样方案为基础， 25g 食品为标准分析单位。本实验由于实际条件的限制，取10g鸡肠作为样品按照国标方法 进行沙门氏菌检测。关键词：沙门氏菌 革兰氏阴性 食物中毒目录前 言 31 材料与方法 31.1 材料 31.1.1 仪器 31.1.2 试剂 41.2 实验步骤 51.2.1 前增菌 61.2.2 增菌 71.2.3 分离 71.2.4 生化试验 71.2.5 血清学鉴定 92 结果与分析 102.1 初步判断结果 102.2 生化实验初步鉴别结果 102.3补做ONPG实验结果112.4 血清学鉴定结果 112.5 结果报告 113 讨论 12-XX.前言沙门氏菌病的病原体。属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。己发现的近一千种（或菌 株）。按其抗原成分，可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。其中与人体疾病有关的主 要有甲组的副伤寒甲杆菌，乙组的副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，丙组的副伤寒丙杆菌和 猪霍乱杆菌，丁组的伤寒杆菌和肠炎杆菌等。除伤寒杆菌、副伤寒甲杆菌和副伤寒乙杆 菌引起人类的疾病外，大多数仅能目引起家畜、鼠类和禽类等动物的疾病，但有时也可 污染人类的食物而引起食物中毒。家禽、蛋和肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介，感染主要取决于沙门氏菌的血 清型和食用者的身体状况，受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。根据国际惯 例，要求对易受沙门氏菌污染的食品进行分类管理，以使大多数食物不含沙门氏菌，从 而有效预防沙门氏菌病。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 仪器冰箱：2 T5 C。恒温培养箱：36 C1 C, 42 C1 C。均质器。振荡器。电子天平：感量 0.1 g。无菌锥形瓶:容量 500 mL，250 mL。无菌吸管：1 mL （具0.01 mL刻度）、10 mL （具0.1 mL刻度） 无菌培养皿：直径 90 mm。无菌试管：3 mmX50 mm、10 mmX75 mm。pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 全自动微生物生化鉴定系统。1.1.2 试剂缓冲蛋白胨水（BPW）四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液亚硫酸铋（BS ）琼脂HE 琼脂木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD ）琼脂沙门氏菌属显色培养基三糖铁（TSI）琼脂蛋白胨水、靛基质试剂尿素琼脂（pH 7.2）氰化钾（KCN）培养基赖氨酸脱羧酶试验培养基糖发酵管邻硝基酚0-D半乳糖苷（ONPG）培养基半固体琼脂丙二酸钠培养基沙门氏菌 O 和 H 诊断血清。生化鉴定试剂盒。1.2 实验步骤操作如下图11.2.1 前增菌称取10g(mL)鸡肠放入盛有90 mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打lmin2min。用Imol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.80.2。于 36 C1 C培养 8 h18h。1.2.2 增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL,转种于lOmLTTB内，于42C1C培养18h 24h。同时另取1mL，转种于1OmLSC内，于36C1C培养18h24h。1.2.3 分离分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和HE琼脂平板。HE琼脂 平板于36C1C培养18h24h, BS琼脂平板于36C1C培养40h48 h，观察 各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表 1表 1 沙门氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌BS琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或黑色，菌落周围培养基 可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基 不变HE琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色1.2.4 生化试验1.2.4.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划 线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养 琼脂平板，于36C1 C培养18 h24 h,必要时可延长至4h。在三糖铁琼脂和 赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。表2 沙门氏菌属在三铁糖琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三塘铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢一+ ()+（）+可疑沙门氏菌属一+（一）+()可疑沙门氏菌属+（）+()+可疑沙门氏菌属+/+/非沙门氏菌属注：+阳性；阴性；+（）多数阳性，少数阴性；+/阳性或阴性表 2 说明，在三铁糖琼脂内斜面产酸，底层产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验 阴性的菌株可以排除。其它的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是 沙门氏菌属的可能。注：TSI结果判定方法：斜面黄色为+,红色为一；底层黄色为+,红色为 ；产气可以观察培养基内的气孔；硫化氢的判断是培养基转黑色为 +，黄色 为一。入试管底部全部为黑色,可以判断底层为 +。赖氨酸脱羧酶试验管为蓝 绿色,对照管变黄为阳性；试验管和对照管均变黄色为阴性。1.2.4.2通过TSI反应中的H2S、靛基质实验、尿素琼脂、KCN实验结果，查表3将可以 反应分为 A1、 A2、 A3。表 3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（H2S）靛基质PH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶A1+ - -+A2+ +- -+A3- - -+/-注:+阳性;-阴性；+/-阳性或阴性注：靛基质试验在培养后加靛基质试剂 2-3 滴，立即观察，表面为红色为 阳性，不变色为阴性，尿素试验结果为桃红色为阳性，淡橙红色为阴性；氰化 钾浑浊，有菌生长为阳性，反之阴性。1.2.4.3反应系列号Al:典型反应判断为沙门氏菌属如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶3 项中有一项异常，按表4可判断为沙门氏菌属。如2项异常为非沙门氏菌属。表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表PH7.2尿素氰化钾赖氨酸脱羧判定结果(KCN)酶- -甲型副伤寒沙门氏菌属（要求血清学鉴定结果）- +沙门氏菌IV或V （要求符合本群生化特征）+ -+沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）注:+阳性:-阴性1.2.4.4反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。 甘露醇和山梨醇试验结果为黄色是阳性，紫色是阴性。1.2.4.5反应序号A3:补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副 伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。ONPG试验结果为深黄色是阳性，谈黄色或无色是阴性。1.2.4.6API20E生化鉴定试剂盒如选择 API20E 生化鉴定试剂盒，可根据表 2 的初步判定结果，从营养琼脂平板 上挑取可以菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，试用 API 生化鉴定试 剂盒进行鉴定.1.2.5 血清学鉴定l.2.5.l 抗原的准备一般采用1.2%-1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。本次试验采 用扩大培养营养琼脂平皿上的菌落做实验。1.2.5.2多价菌体抗原(O)鉴定在玻片上划出两个约1cm*2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片 上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清，在另一区 域下部加入 1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域 内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑暗背景进行观察， 任何程度的凝集现象皆为阳性反应。2 结果与分析2.1 初步判断结果三铁糖琼脂斜面底层均为黄色，不产气，没有产硫化氢；赖氨酸脱羧酶培养基实验 组和对照组颜色一样，都显黄色，为阴性。反应结果如下表A所示。表 A 三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果斜面三塘铁琼脂底层产气硫化氢赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断+可疑沙门氏菌属表 2 说明，经过初步判断，菌为可疑沙门氏菌，应继续做有关的鉴别实验。2.2 生化实验初步鉴别结果实验中的 TSI 反应中的产硫化氢；靛基质试验后表面不变色，为阴性；尿素试验结果是淡橙红色，为阴性；KCN澄清，为阴性。初步鉴别结果如下表B。表 B 沙门氏菌生化反应初步鉴别结果硫化氢靛基质尿素氰化钾赖氨酸脱羧酶-由表B可以看出，对比初步鉴别表中的序号，为A3。反应序号A3:补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌， 同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。2.3 补做 ONPG 实验结果ONPG 试验结果为深黄色，是阳性。2.4 血清学鉴定结果经过多加体抗原（O）鉴定试验，没有观察到任何的凝集现象，即为阴性反应。2.5 结果报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，样品为非沙门氏菌，报告10g样品中未检 出沙门氏菌属。结果分析如下报告鸡肠中沙门氏菌检测报告样品名称：鸡肠采样时间：2011年10月28日样品数量：10g检样时间：2011年10月28日检验环境条件：室温29C，相对湿度60%检测项目沙门氏菌检测依据GB/T4789.4-2008生化试验三糖铁斜面+底层+产气硫化氢赖氨酸脱羧酶靛基质PH7.2尿素氰化钾甘露醇+山梨醇+ONPG+血清学鉴定多价菌体抗原（O）检测结果10g样品中未检出沙门氏菌属说明没有取到典型的沙门氏菌菌落，可能是鸡肠 清洗得过于干净所致。注：“”为阳性，“”为阴性。3 讨论3.1 为什么鸡肠中无法检测出沙门氏菌？答：可能因为 1.鸡肠洗的过于干净 2.菌落挑选错误 3.三糖铁实验的时，接种针灼烧 灭菌没冷却完全，导致沙门氏菌死亡，杂菌却没被灭活。4.实验试剂保存不当。3.2 实验当中注意事项？答：1.实验中需要多处检查实验结果的颜色，观察容易出错。2. 实验步骤较多，条件允许可以多做平行试验以保准确性。3. 实验样品不应洗得过于彻底，另外要保证样品的新鲜。参考文献1 彭丽萍，陈博文，徐建超等. 食品沙门氏菌检测方法进展. 中国进出境动植检，1998， （4）:39-412 徐树强. 鸡沙门氏菌分离、鉴定及药敏试验. 中国禽业导刊，2002，19（6）：153 吴斌，秦成，石智，等畜产品中沙门氏菌的风险评估大连轻工业学院学报，2004 （3）：226-2284 王冬梅, 董开忠, 雒晓芳, 程燕等.冻猪肉中沙门氏菌的检测与分析.西北民族大学 学报，2009（30）：63-655 曾晓芳. 畜产品中沙门氏菌污染的检测与控制 J . 四川畜牧兽医, 2003, 30（ 4）: 28- 29.7刘华伟, 马立农, 郭蔼光, 等. 畜产品中沙门氏菌的快速检测 J . 西北农业学报, 2004, 13（ 4） : 32- 36.