第三章第四节发酵培养基灭菌

发酵培养基灭菌发酵培养基灭菌第三章第三章 发酵工业原料及其处理发酵工业原料及其处理 第一节第一节 培养基的成分及来源培养基的成分及来源 第二节第二节 培养基的类型及选择培养基的类型及选择 第三节第三节 淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备 第四节第四节 发酵培养基灭菌发酵培养基灭菌1 1、培养基如何分类？、培养基如何分类？在发酵生产中常用的固体还是液体培养基？在发酵生产中常用的固体还是液体培养基？2 2、说说培养基的六大营养要素？、说说培养基的六大营养要素？根据培养基的用途根据培养基的用途(特殊用途特殊用途)不同，可将培不同，可将培养基分成：孢子养基分成：孢子 种子种子 发酵发酵 增殖、选择和鉴别培养基增殖、选择和鉴别培养基 根据培养基状态不同，可将培养基分成：根据培养基状态不同，可将培养基分成：固体、液体和半固体培养基固体、液体和半固体培养基 根据营养物质的来源不同，培养基可分为：根据营养物质的来源不同，培养基可分为：天然培养基、合成培养基和半合成培养基天然培养基、合成培养基和半合成培养基 问题问题1 1在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？1 1、由于杂菌的污染，使生物反应中的由于杂菌的污染，使生物反应中的培养物质因杂菌的消培养物质因杂菌的消 耗而损失，造成生产能力的下降耗而损失，造成生产能力的下降；2 2、由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培养液的某些理化特性，使产物养液的某些理化特性，使产物 的的提取和分离变得困难提取和分离变得困难，造，造成收率降低或使产品的质量下降；成收率降低或使产品的质量下降；3 3、杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的PHPH值，从而使值，从而使生物生物反应发生异常变化反应发生异常变化；4 4、杂菌杂菌可能会分解产物可能会分解产物，从而使生产过程失败；，从而使生产过程失败；5 5、发生发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败问题问题2 21 1、为防止、为防止杂菌的污染，整个生化生产过程哪些需要注意杂菌的污染，整个生化生产过程哪些需要注意灭菌？灭菌？培养基、发酵设备、空气、菌种制作培养基、发酵设备、空气、菌种制作发酵培养基灭菌发酵培养基灭菌 一、一、灭菌的原理和方法灭菌的原理和方法 二、二、湿热灭菌原理湿热灭菌原理 三、三、培养基的湿热灭菌方式培养基的湿热灭菌方式 四、四、灭菌时间计算与影响因素灭菌时间计算与影响因素一、一、灭菌的原理和方法灭菌的原理和方法 消毒与灭菌的区别？消毒与灭菌的区别？消毒消毒杀死杀死物体表面及内部一部分物体表面及内部一部分对人体有害的对人体有害的病原菌的营养体病原菌的营养体，而对被消毒的物体基本而对被消毒的物体基本无害的措施，如对皮肤、水果、饮用水的无害的措施，如对皮肤、水果、饮用水的消毒，啤酒、牛奶、果汁等消毒，啤酒、牛奶、果汁等消毒。消毒。灭菌灭菌 杀死杀死任何物体内外的任何物体内外的一切微生物一切微生物的方法，的方法，灭菌后的物体不再有可存活的微生物。灭菌后的物体不再有可存活的微生物。1 1、化学试剂灭菌法、化学试剂灭菌法 化学试剂：化学试剂：甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：适用范围：环境空气、皮肤及器械的表面消毒环境空气、皮肤及器械的表面消毒2 2、射线灭菌法、射线灭菌法 电磁波、紫外线或放射性物质电磁波、紫外线或放射性物质适用范围：适用范围：无菌室、接种箱无菌室、接种箱3 3、干热灭菌法、干热灭菌法 常用烘箱，灭菌条件为在常用烘箱，灭菌条件为在160160下保温下保温1h 1h 适用范围：适用范围：金属或玻璃器皿金属或玻璃器皿4 4、湿热灭菌法、湿热灭菌法 利用饱和蒸汽进行灭菌、条件为：利用饱和蒸汽进行灭菌、条件为：121121，30 30 适用范围：适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌广泛应用于生产设备及培养基的灭菌 例：高压灭菌锅例：高压灭菌锅5 5、过滤除菌法、过滤除菌法 利用过滤方法阻留微生物利用过滤方法阻留微生物 适用范围：适用范围：制备无菌空气制备无菌空气 6 6、火焰灭菌法、火焰灭菌法 酒精灯火焰酒精灯火焰 适用范围：适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口接种针、玻璃棒、三角瓶口 灭菌方法灭菌方法连线题连线题接种针、试管口接种针、试管口环境空气、皮肤表面环境空气、皮肤表面无菌室、接种箱无菌室、接种箱培养基的灭菌培养基的灭菌空气空气过滤除菌法过滤除菌法火焰灭菌法火焰灭菌法湿热灭菌法湿热灭菌法射线灭菌法射线灭菌法化学试剂灭菌法化学试剂灭菌法二、湿热灭菌原理二、湿热灭菌原理 湿热灭菌原理湿热灭菌原理灭菌条件灭菌条件灭菌不利方面灭菌不利方面由于蒸汽具有很强的穿透能力，而且在由于蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热冷凝时会放出大量的冷凝热(潜热潜热)，很，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。121121，30min30min。同时也会破坏培养基中的营养成分，同时也会破坏培养基中的营养成分，甚至会产生不利于菌体生长的物质。甚至会产生不利于菌体生长的物质。因此，在工业培养过程中，除了尽可因此，在工业培养过程中，除了尽可能杀死培养基中的杂菌外，还要尽可能杀死培养基中的杂菌外，还要尽可能减少培养基中营养成分的损失能减少培养基中营养成分的损失 1 1、衡量热灭菌指标、衡量热灭菌指标致死温度：致死温度：杀死微生物的极限温度。杀死微生物的极限温度。致死时间：致死时间：在此温度下，杀死全部微生物所需要的时间。在此温度下，杀死全部微生物所需要的时间。热热 阻：阻：对热的抵抗力，对热的抵抗力，指微生物在某一特定条件指微生物在某一特定条件 （主要是温度和加热方式）下的致死时间。（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻：相对热阻：几种微生物对热的相对抵抗能力。几种微生物对热的相对抵抗能力。指微生物在指微生物在某一特定条件下某一特定条件下的致死时间与的致死时间与 另一微生物在另一微生物在相同条件下相同条件下的致死时间的比值。的致死时间的比值。灭菌方式灭菌方式大肠杆菌大肠杆菌霉菌孢子霉菌孢子细菌芽孢细菌芽孢噬菌体或噬菌体或病毒病毒干热灭菌干热灭菌1 12-102-10100010001 1湿热灭菌湿热灭菌1 12-102-103 310105 51-51-5苯酚苯酚1 11-21-21 110109 93030甲醛甲醛1 12-102-102502502 2紫外线紫外线1 15-1005-1002-52-55-105-10相对热阻相对热阻从表中可看出从表中可看出 芽孢或孢子芽孢或孢子的热阻要比生长期营养细胞的热阻的热阻要比生长期营养细胞的热阻大得多，这是由于芽孢或孢子内大得多，这是由于芽孢或孢子内吡啶二羧酸吡啶二羧酸含量对含量对热阻的增加有关。另外，热阻的增加有关。另外，芽孢子中蛋白质含水量较芽孢子中蛋白质含水量较营养细胞低营养细胞低（特别是游离水分少），也是芽孢耐热（特别是游离水分少），也是芽孢耐热强的一个原因。强的一个原因。l对培养基和发酵设备的灭菌，广泛使用对培养基和发酵设备的灭菌，广泛使用湿热灭菌法湿热灭菌法。l工厂蒸汽比较容易获得，控制操作条件方便，简单工厂蒸汽比较容易获得，控制操作条件方便，简单而又价廉、有效而又价廉、有效l处理培养基加热受热时间与处理培养基加热受热时间与灭菌程度灭菌程度和和营养成分的营养成分的破坏破坏都有关系。都有关系。l营养成分的减少将影响菌种的培养和产物的生成营养成分的减少将影响菌种的培养和产物的生成l所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾，恰当掌握主要矛盾，恰当掌握加热受热时间加热受热时间是灭菌工作的关键。是灭菌工作的关键。受热时间如何确定？受热时间如何确定？2 2、微生物的死亡速率：对数残留定律微生物的死亡速率：对数残留定律 微生物受热死亡的原因，主要是因高温使微生微生物受热死亡的原因，主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变物体内的一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡。微生物受热性，从而导致微生物无法生存而死亡。微生物受热而丧失活力，但其物理性质不变。而丧失活力，但其物理性质不变。在一定温度下，微生物的受热死亡遵照在一定温度下，微生物的受热死亡遵照分子反分子反应速度理论应速度理论。在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其。在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残留活菌数的减少而递减，即减少量随残留活菌数的减少而递减，即微生物的死微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比，亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比，式中，式中，NN残存的活菌数；残存的活菌数；t t灭菌时间（灭菌时间（s s）；）；K K灭菌速度常数（灭菌速度常数（s s-1-1），也称反），也称反应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关；微生物的种类与加热温度有关；dN/dtdN/dt活菌数瞬时变化速率，即死亡速率活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。积分得：积分得：KNdtdNkteNNt0NtNKNtNKt00lg303.2ln1式中：式中：NN0 0开始灭菌（开始灭菌（t=0t=0）时原有活菌数；）时原有活菌数；NNt t-经时间经时间t t后残存活菌数。后残存活菌数。微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比，微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比，NtNKNtNKt00lg303.2ln1灭菌速度常数灭菌速度常数K K是判断微生物是判断微生物受热死亡难易程度受热死亡难易程度的基本依据。的基本依据。各种微生物在同样的温度下各种微生物在同样的温度下K K值是不同的值是不同的K K值愈小，则此微生物愈耐热。值愈小，则此微生物愈耐热。问题问题 在在121121度，枯草杆菌度，枯草杆菌FS5230FS5230的的K K为为0.047s0.047s-1-1，梭状芽孢杆菌梭状芽孢杆菌PA3679PA3679的的K K值为值为0.03 s0.03 s-1-1 ，请问，请问哪一种微生物更耐热？哪一种微生物更耐热？1 1）如微生物存在芽孢，其死亡速率呈现非对数死亡）如微生物存在芽孢，其死亡速率呈现非对数死亡定律定律 ;2 2）同一种微生物在不同的灭菌温度下，同一种微生物在不同的灭菌温度下，k k值不同，值不同，灭菌温度愈低，灭菌温度愈低，k k值愈小；温度愈高，值愈小；温度愈高，k k值愈大值愈大。3 3）如果要达到彻底灭菌，如果要达到彻底灭菌，NtNt等于等于0 0，则灭菌所需的，则灭菌所需的 时间应为无限长，这在实际中是不可能的。时间应为无限长，这在实际中是不可能的。工程上，工程上，Nt=0.001Nt=0.001，即在，即在10001000次灭菌中，次灭菌中，允许有一次失败允许有一次失败;NtNKNtNKt00lg303.2ln1注：3 3、灭菌温度和时间的选择、灭菌温度和时间的选择 当培养基被加热灭菌时，常会出现这样的矛盾，这当培养基被加热灭菌时，常会出现这样的矛盾，这就是，加热时，微生物固然会被杀死，但培养基中的有就是，加热时，微生物固然会被杀死，但培养基中的有用成分也会随之遭到破坏，用成分也会随之遭到破坏，那么有何良策可以既达到灭那么有何良策可以既达到灭菌要求，同时又不破坏或尽可能少破坏培养基中的有用菌要求，同时又不破坏或尽可能少破坏培养基中的有用成分呢成分呢？实践证明，在高压加热的情况下，培养基中的氨基实践证明，在高压加热的情况下，培养基中的氨基酸和维生素极易被破坏，如在酸和维生素极易被破坏，如在121121，仅，仅20min20min，就有，就有59%59%的的赖氨酸赖氨酸和和精氨酸精氨酸及其他及其他碱性氨基酸碱性氨基酸被破坏，蛋氨被破坏，蛋氨酸和色氨酸也有相当数量被破坏。酸和色氨酸也有相当数量被破坏。因此，必须选择一个因此，必须选择一个既能满足灭菌需要，又可使培养基的破坏尽可能小的灭既能满足灭菌需要，又可使培养基的破坏尽可能小的灭菌工艺条件菌工艺条件。微生物的受热死亡属于单分子反应单分子反应，其灭菌速率常数K与温度之间的关系可用阿累尼乌斯公式表示：exp()EKARTA-频率常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1；R-气体常数，8.314J/molK；T-绝对温度，K；E-微生物死亡活化能，J/mol。K灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数.从上式可知，从上式可知，K K值的大小与微生物值的大小与微生物的的种类种类与与加热温度加热温度有关有关 灭菌时，培养基成分分解速率常数K与温度之间的关系也可用阿累尼乌斯公式表示：exp()EKARTK-培养基内易被破坏成分的分解速率常数；A-频率常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1；R-气体常数，8.314J/molK；T-绝对温度，K；E-培养基成分分解所需活化能，J/mol。当培养基成分从当培养基成分从T1上升到上升到T2时，微生物的死亡速率与培养基的分解有如下时，微生物的死亡速率与培养基的分解有如下关系：关系：2121lnlnKEKKEK（）（）通过实验测定可知：灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分的破坏活化能值，因此：）（）（1212lnlnKKKK即随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍即随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分的破坏速率的增加倍数。数要大于培养基成分的破坏速率的增加倍数。也就是说，也就是说，结论结论1 1：当灭菌温度上升时，微生物死亡速率的提高：当灭菌温度上升时，微生物死亡速率的提高要超过培养基成分的破坏速率的增加。要超过培养基成分的破坏速率的增加。2121lnlnKEKKEK（）（）分析分析:在热灭菌过程中，同时会发生在热灭菌过程中，同时会发生微生物死亡微生物死亡和和培养基破坏培养基破坏这两种过程，且这两种过程的进行速这两种过程，且这两种过程的进行速度都随温度的升高而加速，但度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率微生物的死亡速率随温度的升高更为显著随温度的升高更为显著。据测定据测定：每升高：每升高1010时一般化学反应的反应速率时一般化学反应的反应速率的增加倍数是的增加倍数是1.5-2.01.5-2.0，而杀死芽孢为，而杀死芽孢为5-105-10，杀死，杀死微生物细胞为微生物细胞为3535左右。左右。灭菌温度灭菌温度灭菌时间（分）灭菌时间（分）营养成分破坏营养成分破坏%10010040040099.399.3110110363667.067.0115115151550.050.01201204 427.027.01301300.50.58.08.01451450.080.082.02.01501500.010.011.01.0 由此可见，若要减少营养成分的破坏，可升由此可见，若要减少营养成分的破坏，可升高温度灭菌。高温度灭菌。结论结论2 2：在灭菌时选择较高的温度、较短的时在灭菌时选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时同时又可减少营养物质的损失。又可减少营养物质的损失。灭菌要达到杀死灭菌要达到杀死99.99%99.99%的细菌芽孢，有两种方法的细菌芽孢，有两种方法可以采用，一种是可以采用，一种是118118灭菌灭菌15min15min，另一种是，另一种是128128灭菌灭菌5min5min。哪一种方法好，为什么？。哪一种方法好，为什么？答：答：从理论研究和生产实践都可证明，在灭菌过程中，同从理论研究和生产实践都可证明，在灭菌过程中，同时会发生微生物死亡和培养基破坏这两种过程，且这两种过程时会发生微生物死亡和培养基破坏这两种过程，且这两种过程的进行速度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率随温的进行速度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率随温度的升高更为显著。度的升高更为显著。因此，对于同一灭菌效果，选择较高的温度、较短的时间，因此，对于同一灭菌效果，选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。失。三、培养基的湿热灭菌方式三、培养基的湿热灭菌方式 1 1、间歇灭菌（分批灭菌、实消）间歇灭菌（分批灭菌、实消）2 2、连续灭菌（连消）连续灭菌（连消）1 1、间歇灭菌（分批灭菌、实消）、间歇灭菌（分批灭菌、实消）定义：定义：将配制好的培养基将配制好的培养基同时放在同时放在发酵罐或其他装置发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，通常也称为实罐灭菌。的过程，通常也称为实罐灭菌。（常用）（常用）发酵罐发酵罐1 1）基本概念）基本概念 24016012080时间（时间（min)050100150温度温度升温升温冷却冷却保温保温过程包括：过程包括：升温、保温和冷升温、保温和冷却等三个阶段。却等三个阶段。各阶段对灭菌的贡献：各阶段对灭菌的贡献：20%20%、75%75%、5%5%从以上分析可知，灭菌过程中从以上分析可知，灭菌过程中加热和保温阶段加热和保温阶段的灭菌作用是主要的的灭菌作用是主要的，而冷却阶段的灭菌作用是次，而冷却阶段的灭菌作用是次要的，一般很小，可以忽略不计。要的，一般很小，可以忽略不计。此外，还应指出的是，应当此外，还应指出的是，应当避免长时间的加热避免长时间的加热阶段阶段，因为加热时间过长，不仅破坏营养物质，而，因为加热时间过长，不仅破坏营养物质，而且也有可能引起培养液中某些有害物质的生成，从且也有可能引起培养液中某些有害物质的生成，从而影响培养过程的顺利进行。而影响培养过程的顺利进行。各阶段对灭菌的贡献：各阶段对灭菌的贡献：20%20%、75%75%、5%5%l在实际生产中，也可能遇到所供蒸汽不足、温度不够高在实际生产中，也可能遇到所供蒸汽不足、温度不够高的情况，这时的情况，这时可以适当延长灭菌时间可以适当延长灭菌时间。l生产上甚至有用生产上甚至有用100100蒸煮而达到彻底灭菌的实例。蒸煮而达到彻底灭菌的实例。l 如要做固体曲而没有高温蒸汽时，可将原料用如要做固体曲而没有高温蒸汽时，可将原料用100100蒸汽蒸蒸汽蒸30min30min，杀死其中的营养细胞，杀死其中的营养细胞，但孢子与细菌的芽孢没但孢子与细菌的芽孢没有被杀死。有被杀死。将蒸过的原料置于室温下过夜，将蒸过的原料置于室温下过夜，未被杀死的未被杀死的孢子便发芽生长，芽孢发育成营养细胞，再孢子便发芽生长，芽孢发育成营养细胞，再30min30min便可杀便可杀死。如此连续反复进行死。如此连续反复进行2-32-3次，亦可达到彻底灭菌的目的。次，亦可达到彻底灭菌的目的。3）间歇灭菌的操作）间歇灭菌的操作 间歇灭歇是在所用的发酵罐或其他培养装置中进行的，它是在配制罐中配好培养基后，通过专用管道输入发酵罐等培养设备中，然后开始灭菌。在进行培养基的间歇灭菌之前，通常先将发酵罐等培养装置的分空气过滤器进行灭菌，并且用空气将分过滤器吹干。开始灭菌时，应先放去夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，通过空气管向发酵罐内的培养基通入蒸汽进行加热，同时，也可在夹套内通蒸汽进行间接加热。当培养基温度升到70左右时，从取样管和放料管向罐内通入蒸汽进一步加热，当温度升至120，罐压为1*105Pa（表压）时，打开接种、补料、消泡剂、酸、碱等管道阀门进行排汽，当然在保温过程中，应注意凡在培养基液面下的各种进口管道都应通入蒸汽，而在液面以上的其余各管道则应排放蒸汽，这样才能不留死角，从而保证灭菌彻底。保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。由于培养基的间歇灭菌不需要专门的灭菌设备，投资少，对设备要求简单，对蒸汽的要求也比较低，且灭菌效果可靠，因此，间歇灭菌是中小型生产工厂经常采用的一种培养基灭菌方法。2 2、连续灭菌（连消）、连续灭菌（连消）1 1）定义：定义：将配制好的培养基在向发酵罐等培养将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、装置输送的同时进行加热、保温和冷却保温和冷却而进行灭菌。而进行灭菌。l连续灭菌时，培养基可在连续灭菌时，培养基可在短短时间内加热到保温温度时间内加热到保温温度，并且，并且能能很快地被冷却很快地被冷却l因此可在比间歇灭菌因此可在比间歇灭菌更高的更高的温度下温度下进行灭菌进行灭菌l而由于而由于灭菌温度很高灭菌温度很高，保温保温时间时间就相应地可以就相应地可以很短很短l极有利于减少培养基中的营极有利于减少培养基中的营养物质的破坏。养物质的破坏。连续灭菌的基本设备有哪些连续灭菌的基本设备有哪些？问题问题发酵罐蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽冷却水冷却水无菌培养基无菌培养基配料罐配料罐泵泵加热塔加热塔维持罐维持罐冷却管冷却管 连续灭菌的基本设备一般包括（连续灭菌的基本设备一般包括（1 1）配料预热罐配料预热罐，将配制好的，将配制好的料液预热到料液预热到60-7060-70，以避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差，以避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（过大而产生水汽撞击声；（2 2）连消塔连消塔，连消塔的作用主要是使，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混和，并使料液的温度很快升高到灭菌高温蒸汽与料液迅速接触混和，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（温度（126-132126-132）；（）；（3 3）维持罐维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下保持保持5-7min5-7min，以达到灭菌的目的；（，以达到灭菌的目的；（4 4）冷却管冷却管，从维持罐出来，从维持罐出来的料液要经过冷却排管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，的料液要经过冷却排管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到冷却到40-5040-50后，输送到预先已经灭菌过的罐内。后，输送到预先已经灭菌过的罐内。喷射加热连续灭菌流程灭菌介质原料介质蒸汽T=140度保温段真空 流程中采用了蒸汽喷射器，它使培养液与高温蒸汽直流程中采用了蒸汽喷射器，它使培养液与高温蒸汽直接接触，从而在短时间内可将培养液急速升温至预定的接接触，从而在短时间内可将培养液急速升温至预定的灭菌温度然后在该温度下维持一段时间灭菌，灭菌后的灭菌温度然后在该温度下维持一段时间灭菌，灭菌后的培养基通过一膨胀阀进入真空冷却器急速冷却，从图中培养基通过一膨胀阀进入真空冷却器急速冷却，从图中可以看出，由于该流程中可以看出，由于该流程中培养基受热时间短，营养物质培养基受热时间短，营养物质的损失也就不很严重，同时该流程保证了培养基物料先的损失也就不很严重，同时该流程保证了培养基物料先进先出，避免了过热或灭菌不彻底等现象进先出，避免了过热或灭菌不彻底等现象。薄板换热器连续灭菌流程进料 35100 120 维持罐120 蒸汽147 120 55 出料35 水20 31 流程中采用了薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，蒸汽在薄板换热器的加热段使培养液的温度升高，经维持段保温一定时间后，培养基在薄板换热器的冷却段进行冷却，从而使培养基的预热、加热灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。该流程的加热和冷却时间比喷射加热连续灭菌流程要长些，但由于在培养基的预热过程同时也起到了灭菌后培养基的冷却，因而节约了蒸汽和冷却水的用量。分别说出优点分别说出优点3 3）间歇灭菌与连续灭菌的比较）间歇灭菌与连续灭菌的比较 灭菌方式灭菌方式优优 点点缺缺 点点连续连续灭菌灭菌1.1.灭菌温度高，可减少培养基灭菌温度高，可减少培养基中营养物质的损失中营养物质的损失2.2.操作条件恒定，灭菌质量操作条件恒定，灭菌质量稳定稳定3.3.易于实现管道化和自控操易于实现管道化和自控操作作4.4.避免了反复的加热和冷却避免了反复的加热和冷却，提高了热的利用率，提高了热的利用率5.5.发酵设备利用率高发酵设备利用率高1.1.对设备的要求高，需另外设置对设备的要求高，需另外设置加热、冷却装置加热、冷却装置2.2.操作较麻烦操作较麻烦3.3.染菌的机会较多染菌的机会较多4.4.不适合于含大量固体物料的灭不适合于含大量固体物料的灭菌菌5 5 对蒸汽的要求高对蒸汽的要求高间歇间歇灭菌灭菌1.1.设备要求低，不需另外设置设备要求低，不需另外设置加热、冷却装置加热、冷却装置2.2.操作要求低，适于手动操操作要求低，适于手动操作作3.3.适合于小批量生产规模适合于小批量生产规模4.4.适合于含有大量固体物质适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌的培养基的灭菌1.1.培养基的营养物质损失较多，培养基的营养物质损失较多，灭菌后培养基的质量下降灭菌后培养基的质量下降2.2.需进行反复的加热和冷却，能需进行反复的加热和冷却，能耗较高耗较高3.3.不适合于大规模生产过程的灭不适合于大规模生产过程的灭菌菌4.4.发酵罐的利用率较低发酵罐的利用率较低加热器、维持罐（管）加热器、维持罐（管）和冷却器以及发酵罐和冷却器以及发酵罐等都应先进灭菌等都应先进灭菌 由表可见，无论在理论上或者在实践上，由表可见，无论在理论上或者在实践上，与间歇灭菌过程相比，连续灭菌的优点十与间歇灭菌过程相比，连续灭菌的优点十分明显。因此，连续灭菌越来越多地被用分明显。因此，连续灭菌越来越多地被用培养基的灭菌。培养基的灭菌。四、灭菌时间计算与影响因素四、灭菌时间计算与影响因素 A A、分批灭菌（实罐灭菌）、分批灭菌（实罐灭菌）一般可以不计升温阶段所杀一般可以不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均灭的菌数，把培养基中所有的菌均看作是在保温阶段（灭菌温度）被看作是在保温阶段（灭菌温度）被杀灭，这样可以简单地利用式，粗杀灭，这样可以简单地利用式，粗略地求得灭菌所需的时间略地求得灭菌所需的时间 NtNKNtNKt00lg303.2ln11 1）培养基灭菌时间的计算）培养基灭菌时间的计算解：N0=40 106 2 105=8 1012（个）Nt=0.001（个）K=1.8min-1NtNKNtNKt00lg303.2ln1(min)34.20)108lg(8.1303.2lg303.2150NtNKt例：有一发酵罐内装例：有一发酵罐内装40m340m3培养基，在培养基，在121121温度下进温度下进行实罐灭菌行实罐灭菌。原污染程度为每。原污染程度为每1mL1mL有有2 2*105105个耐热细个耐热细菌芽孢，菌芽孢，121121度时灭菌速度常数为度时灭菌速度常数为1.8min-11.8min-1。求灭菌。求灭菌失败机率为失败机率为0.0010.001时所需要的灭菌时间。时所需要的灭菌时间。但是实际上，培养基在加热升温时（即在但是实际上，培养基在加热升温时（即在升温阶段）就会有部分菌被杀灭，特别是升温阶段）就会有部分菌被杀灭，特别是当培养基加热到当培养基加热到100100度以上，这个作用较为度以上，这个作用较为显著。因此，显著。因此，保温灭菌时间实际上比上述保温灭菌时间实际上比上述计算的要短。计算的要短。严格地讲，在降温阶段也有杀菌作用，但严格地讲，在降温阶段也有杀菌作用，但降温时间短，在计算时一般不考虑。降温时间短，在计算时一般不考虑。【例2】上例中，灭菌过程的升温阶段，培养基从100上升至121，共需15min。求升温阶段结束时，培养基中芽孢数和保温所需时间。解 T1373K T2394K根据公式求得373K至394K之间若干k值，k-T关系如下表表 k-T关系由此可得 图解积分法 根据公式，求升温阶段结束时培养基中残留的芽孢数为根据灭菌公式，求得保温所需的时间NtNKNtNKt00lg303.2ln1B B、连续灭菌（连消）、连续灭菌（连消）连续灭菌的灭菌时间，仍可用灭菌公式计算，但培养连续灭菌的灭菌时间，仍可用灭菌公式计算，但培养基中的含菌数，应改为基中的含菌数，应改为每单位体积每单位体积(1mL)(1mL)培养基的含菌数培养基的含菌数，则灭菌公式变换为下式则灭菌公式变换为下式式中式中 c c0 0单位体积培养基灭菌前的含菌数，个单位体积培养基灭菌前的含菌数，个mL;mL;c cs s单位体积培养基灭菌后的含菌数，个单位体积培养基灭菌后的含菌数，个mLmL。NtNKNtNKt00lg303.2ln1发酵罐发酵罐蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽冷却水冷却水无菌培养基无菌培养基配料罐配料罐泵泵加热塔加热塔维持罐维持罐冷却管冷却管【例】若将上例中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度为【例】若将上例中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度为131131，此温度下灭菌速率常数为，此温度下灭菌速率常数为15min15min-1-1，求灭菌所需的维，求灭菌所需的维持时间。持时间。解解15.915.92 2、影响灭菌的因素、影响灭菌的因素 简答：影响灭菌的因素有哪些简答：影响灭菌的因素有哪些？问题问题1 1培养基成分培养基成分 培养基的物理状态培养基的物理状态 培养基的培养基的pHpH值值 培养基中的微生物数量培养基中的微生物数量 微生物细胞中水含量微生物细胞中水含量 微生物细胞菌龄微生物细胞菌龄 微生物的耐热性微生物的耐热性 空气排除情况空气排除情况 搅拌搅拌 泡沫泡沫 为什么说培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越高，灭菌温度就得为什么说培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越高，灭菌温度就得相应高些相应高些？问题问题2 2为什么说液体培养基比固体培养基更易灭菌为什么说液体培养基比固体培养基更易灭菌？问题问题3 3培养基的培养基的pHpH值越低，灭菌所需的时间就愈短（值越低，灭菌所需的时间就愈短（）问题问题4 4判断判断在实际生产中，不宜采用严重霉腐的腐败的水质，在实际生产中，不宜采用严重霉腐的腐败的水质，是因为其微生物数量多，影响灭菌效果。（是因为其微生物数量多，影响灭菌效果。（）微生物含水量越多，灭菌时间就得越长。（微生物含水量越多，灭菌时间就得越长。（）年轻细胞比年老细胞更易杀死。（年轻细胞比年老细胞更易杀死。（）为什么为什么？在灭菌过程中，充分搅拌更有利于灭菌。（在灭菌过程中，充分搅拌更有利于灭菌。（）为什么为什么？在灭菌过程中，为什么要排除罐内空气？在灭菌过程中，为什么要排除罐内空气？问题问题7 7灭菌的彻底与否应以杀死营养细胞为准还是杀死细菌芽灭菌的彻底与否应以杀死营养细胞为准还是杀死细菌芽孢为标准，为什么？孢为标准，为什么？在灭菌过程中，为什么说培养基发生泡沫对灭菌很不利？在灭菌过程中，为什么说培养基发生泡沫对灭菌很不利？问题问题5 5问题问题6 6排除冷空气的原因排除冷空气的原因压力越高，水的沸点越高，即水蒸气的温度越压力越高，水的沸点越高，即水蒸气的温度越高，高，一定压力的纯水蒸汽有相应温度对应一定压力的纯水蒸汽有相应温度对应，1515磅磅 英寸英寸2 2纯水蒸汽对应纯水蒸汽对应121 121，高压蒸汽灭菌实，高压蒸汽灭菌实质是高温使蛋白质变性。质是高温使蛋白质变性。121121（指示（指示1515磅磅 英英寸寸2 2），），15-2015-20分钟具有灭菌效果。分钟具有灭菌效果。灭菌锅上的表是压力表，在灭菌锅上的表是压力表，在有空气存在有空气存在时时1515磅磅 英寸英寸2 2对应的温度实际是小于对应的温度实际是小于121121，在在15-2015-20分分钟的杀菌效果不能保证。钟的杀菌效果不能保证。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系 压力数压力数全部空气全部空气排出时的排出时的温度温度()()2/32/3空气空气排出时的排出时的温度温度()()1/21/2空气空气排出时的排出时的温度温度()()1/31/3空气空气排出时的排出时的温度温度()()空气全不空气全不排出时的排出时的温度温度()()千克千克(公斤公斤/厘米厘米2 2)磅磅/英寸英寸2 2(lb/in(lb/in2 2)0.350.350.700.701.051.051.401.401.751.752.102.105 510101515202025253030108.8108.8115.6115.6121.3121.3126.2126.2130.0130.0134.6134.61001001091091151151211211261261301309494105105112112118118124124128128909010010010910911511512112112612672729090100100109109115115121121